Name: 셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 형광 변동 분광학을 활용하여 살아있는 세포에서 세포 간 접촉부의 단백질 상호작용을 실시간으로 분석하는 방법을. 이 기술은 세포 고정 없이 생체 내에서 직접 상호작용을 연구할 수 있어 세포 생물학 연구에 유용합니다.

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이 작품은 부분적으로 도이치 가운데 (DFG)에 의해 지원 254850309를 부여. 저자는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Madlen Luckner 감사합니다.

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 실험 절차-셀 연락처, 형광 변동 분광학 기술을, 즉 sFCCS 및 ccN & B에서 트랜스 상호 작용 단백질-단백질의 조사를 수 이러한 방법은 두 괴기 하 게 분리 된 FPs 하나 또는 다른 융해 단백질을 표현 하는 각각 두 개의 인접 셀의 연락처에 대 한 관심의 protein(s) 융합에 의해 방출 되는 형광 변동에 대 한 통계 분석을 포함 한다. 트랜스 복합물의 존재는 이웃 PMs에서 단백질의 공동 보급의 정도 조사 하 여 정량은. 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 자세한 프로토콜,이 문서 분석 결과의 성공적인 신청의 실험적인 증거를 신경 접착 단백질 APLP1에 제공합니다. 우리는 APLP1 관련, 셀 연락처에서 homotypic 트랜스 상호 작용을 거쳐 보여줍니다. 또한, 아연 이온 트랜스 상호 작용에 대 한 multivalent 플랫폼을 제공 하 고, 따라서, 향상 된 트랜스 바인딩을 유도 하는-셀 연락처에서 APLP1 ...

많은 생물학 과정 세포 세포 상호 작용, 예를 들어, 셀 접착1,2,3, 셀 셀 퓨전4 및 세포 인식5사이트에서 발생합니다. 이러한 이벤트는 특히 중요 한 다세포 생물의 세포-세포 커뮤니케이션, 예를 들어, 면역 반응 동안에 대 한 개발 중입니다. 이 프로세스는 일반적으로 즉, 이웃 세포의 원형질 막 (오후)에 표면에 지역화 되 고 규제에서 공간과 시간을 정확 하 게 세포 세포 접촉에서 특정 상호 작용을 받을 단백질에 의해 중재 됩니다. 대부분의 경우에서 이러한 상호 작용 직접 호모-또는 heterotypic 단백질-단백질 트랜스 상호 작용, 하지만 또한 이온 또는 extracellular 링커1로 작동 하는 ligands를 포함 될 수 있습니다. 비록 기본적인 중요성의, 살아있는 세포의 기본 환경에서 직접 이러한 특정 단백질-단백질 상호 작용을 조사 하는 분석 실험의 부족이 이다. 많은 방법 중 필요 셀 중단 (예, 생 화 확 적인 분석 실험 공동 immunoprecipitation6등), 고정 (예를 들어, 일부 최고 해결책 광학 현미경 검사 법 기술과 세포-세포의 전자 현미경의 7연락처), 또는 일반적인, 예를 들어, 집계 / 접착 분석 실험8,9. 이 문제를 해결 하려면 형광 기법 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)10 또는 형광 보완성11기반으로 구현 되었습니다. 그러나, fluorophores 사이 충분히 작은 거리를 위해 이러한 메서드는 단백질10, 트랜스 상호 작용을 잠재적으로 방해의 extracellular 측에 형광 라벨 필요 합니다.
여기, 우리 셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 대체 형광 기반 분석 결과 제시. 이 방법은 결합 형광 크로스-상관 관계 접근 (검색 형광 교차 상관 분광학 (sFCCS), 교차 상관 번호와 밝기 (ccN &amp; B))의 단백질의 융합 개념을 표현 하는 셀의 혼합 관심, 예를 들어, 접착 수용 체. 두 개의 상호 작용 세포에 조사 수용 체는 세포내에서 2 개의 괴기 하 게 분리 된 형광 성 단백질 (FPs), 표시 됩니다 ( 그림 1A참조) 사이드.
고용된 방법 confocal 레이저 스캐닝 현미경의 초점 볼륨을 통해 형광 성 융해 단백질의 방산 움직임에 의해 유도 된 형광 변동에 대 한 통계 분석을 기반으로 합니다. 더 자세히 분석 결과 프로브 셀 연락처에서 두 이웃 PMs에 관심사의 단백질의 공동 보급 합니다. 단백질 트랜스 상호 작용을 받을 경우이 트랜스 단지 두 스펙트럼 채널에 방출, 두에 미터의 상관된 형광 변화를 일으키는 형광 단백질을 수행 한다. 다른 한편으로, 아무 바인딩 경우 PMs를 직면 하 고 있는 단백질의 번호 변동 독립, 아무 상관된 변동 원인이 될 것입니다. 인수는 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 1) sFCCS-셀 접촉에서 선 모양의 검사에 근거 하 고 효과적으로 접촉 지역에 위치한 자리에 상호 작용을 조사. 형광 변화의 시간적 분석을 통해 sFCCS 또한 역학 정보를 제공 한다 즉, 단백질 복합물;의 확산 계수를 2) ccN &amp; B 세포 세포 접촉 지역에서 취득 하는 이미지의 시퀀스에 대 한 pixel-wise 분석 기반으로 합니다. 프로브 하는 기능이 고 전체 따라 지도 상호 작용 영역 (하나의 초점 비행기), 문의 하지만 역학에 정보를 제공 하지 않습니다. 두 가지 방법, 즉, 평균 형광 신호 시간 단위에 단일 확산 단백질 복합물에 의해 방출 하 고, 따라서,에서 단백질 복합물의 산출할의 견적을 제공 분자 밝기의 분석 결합 될 수 있다 셀 연락처입니다.
이 문서에서 우리는 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 제시 분석 결과 수행 하기 위해 샘플 준비, 계측기 교정, 데이터 수집 및 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 모든 악기와 광자 계산 또는 아날로그 탐지기 높은 숫자 조리개와 목표에 실험을 수행할 수 있습니다. 우리 또한 프로토콜의 중요 한 단계를 토론 하 고 artefactual 신호 변동, 예를 들면, 감지기 소음, photobleaching 또는 셀 운동 발생 하는 여러 프로세스에 대 한 수정 계획을 제공 합니다. 원래 부착 세포 간의 상호 작용을 개발, 분석 결과 현 탁 액 셀을 수정할 수 있습니다 또는 적응 모델 멤브레인 시스템, 예를 들면, 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 또는 거 대 한 플라즈마 막 소포 (GPMVs), 수는 상호 작용 다른 지질 환경에서 또는 조직된 골격12,13의 부재에서 부 량이 고
형광 교차 상관 분광학 검색 형광 교차 상관 분광학14 의 수정된 된 버전 이며, 지질 막15의 느린 방산 역학 조사 하도록 특별히 설계 되었습니다. 그것은 관심의 형광 단백질을 포함 하는 오후에 수직 라인 스캔 수집을 기반으로 합니다. 2 개의 다르게 분류 단백질의 상호 작용을, 인수 spectrally 분리 fluorophores에 대 한 두 개의 레이저 라인 및 2 개의 검색 창을 사용 하 여의 스펙트럼 채널 두 개에서 수행 됩니다. 때문에 오후에 있는 단백질의 느린 유포 역학 (D≤ ~ 1 µ m2/s), 크로스 토크 무료 측정15라인을 라인에서 흥분 체계를 대체 하 여 수행할 수 있습니다. 로 시작 하는 분석: block-wise ~ 1000 라인, 2) 위치와 함께 최대 형광 신호즉, 오후, 각 블록에 위치 결정의 평균 3) 변화에 따라 측면 셀 운동 1) 정렬 알고리즘 수정 일반적인 기원12,15, 각 채널에 별도로 모든 블록의 다음, 오후에 해당 하는 픽셀의 자동 선택 모든 정렬된 라인 (즉, 센터 ± 2.5σ)의 합계의 가우스 적합에서 중앙 영역을 선택 하 여 수행 됩니다. 각 줄에 신호의 통합 수익률 막 형광 시계열 f (t) 각 채널에 (g = 녹색 채널, r = 빨강 채널). 픽셀 크기가 작은 만큼, 예를 들어, 수는 &lt; 200 nm, 포인트의 형태를 재구성 하 기능을 확산 하 고에 해당 하는 오후의 위치는 센터. 상당한 photobleaching 존재 각 채널에서 형광 시계열 수 두 배 지 수 함수 모델링 있으며 다음 다음 수식을 사용 하 여 수정:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
이 수식은 효과적으로 진폭 및 확산 시간 f (t)c, f (t)교정된 얻어질 것 이다 매개 변수 추정에 비해의 상관 관계 분석에서 얻은 수정 주의에 중요 하다. 다음, 자동 및 교차 상관 기능 (ACFs / CCFs) 형광의 신호 계산 됩니다:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">(2)
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">(3)
여기서 δF나 Fi(t)-= <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> Fi(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> 와 나 g, r=.
2 차원 확산 모델은 다음 모든 상관 관계 기능 (CFs)에 장착 되어:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
여기, N 각 채널에 대 한 확산 시간 관찰 볼륨과 τd 에 형광 단백질의 수를 나타냅니다. 이 모델 고려는 설명된 실험 설정에서 x-z 평면에서 발생 하는 오후에 있는 단백질의 유포 형광 상관 관계의 일반적으로 사용 되는 구성 달리 분광학 (FCS) 실험 조사 하는 세포 막에 confocal 볼륨17의 x y 평면에서 보급. 허리 w0 와 구조 인자 S, 설명 하는 신장 z, S에에서 초점 볼륨의 wz = wz/w0, 괴기 하 게 비슷한 염료와 같은 광학 설정 포인트 FCS 교정 측정에서 얻을 수 있습니다 이미 사용 가능한 값을 사용 하 여 확산 계수에 대 한 D염료:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">(5)
τd, 염료는 피팅 데이터를 3 차원 확산에 대 한 모델에서 얻은 염료 분자의 측정 된 평균 보급 시간에 분수 모든 N 분자의 T 의 계정 전환으로 복용 한 시간 상수와 triplet 상태 ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
마지막으로, 확산 계수 (D), 분자 명도 값 (ε) 및 sFCCS 데이터 (rel.cc.)의 상대 교차 상관은 다음과 같이 계산 됩니다.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">(7)
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">(8)
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">(9)
어디 간 상관 함수의 진폭은 G크로스(0)와 <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> i-번째 채널의 자기 상관 함수의 진폭은 이다.
이 정의 상대 교차 상관, 즉 의 최대 수식 9에 의미 를 대신 사용 하 여 고려는 단지 두 개의 단백질 종의 다양 한 농도의 최대 수에 의해 제한 됩니다는 낮은 번호에 종입니다.
교차 상관 수와 밝기 기반 샘플에서 고정된 위치에서 시간이 지남에 인수는 이미지 스택의 각 픽셀에 대 한 형광 강도의 순간 분석 일반적으로 100 ~ 200의 구성 된 프레임, 2 개의 스펙트럼 채널 ( g = 그린 채널, r = 빨강 채널). 시간적 의미에서 <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> 나<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">나 및 분산 <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> , 분자 밝기 εi 및 숫자 n나 각 픽셀에 스펙트럼 채널 계산 됩니다 (나 = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">(10)
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
그것은 진정한 광자 계수 검출기의 이상적인 경우에는 주어진된 방정식 적용 해야 합니다. 아날로그 탐지 시스템에 대 한 다음 방정식19,20적용:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">(12)
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
여기, S는 감지 된 광자와 기록된 디지털 카운트 사이의 변환 계수 <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> 판독 소음 및 오프셋 검출기 강도 오프셋을 나타냅니다. 일반적으로, 이러한 수량 해야 될 보정, 꾸준한 조명19, 예를 들어, 반사 금속 표면 또는 말린된 염료 솔루션에 대 한 강도의 기능으로 측정 하는 검출기 편차에 따라 모든 검출기 종류에 대 한. 오프셋 은 여기 빛 없이 샘플 카운트 속도 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 검출기 관련 분산의 선형 회귀를 수행 하 여 <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> (나) 강도 플롯, S 대와 <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> 결정된19일 수 있다:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
마지막으로, 교차 상관 밝기 각 픽셀에 계산 되 고21 으로 일반적 정의
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">(15)
어디 <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> 크로스-분산은 <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> .
수명이 긴 동요를 필터링 하기 위해 모든 ccN &amp; B 계산 수행 됩니다 다음 필터링 하지, 독립적으로 각 픽셀22기차. 간단히, ni, ε난 (나 = g, r)와 Bcc 슬라이딩의 예를 들어, 세그먼트 8-15 프레임에서 계산 됩니다. 이렇게 얻어진 값은 다음 값을 가져올 최종 픽셀 수와 밝기 평균 수 있습니다.
산출할 분석 셀 연락처에서 단백질 복합물의 산출할을 추정 하기 위해서는 분자 밝기는 sFCCS 또는 ccN &amp; B 데이터에 대 한 각 스펙트럼 채널에 별도로 분석할 수 있습니다. SFCCS에서 한 명도 값 측정 각 채널에서 당 얻은 것입니다. CcN &amp; B, 셀 연락처에 해당 하는 모든 픽셀의 밝기 히스토그램 취득 하 고 평균 (또는 평균) 값 측정을 위한 대표적인 밝기로 사용할 수 있습니다. 단위체 참조에 동일한 분석을 수행 하 여 모든 명도 값 감지 단백질 복합물의 평균 oligomeric 상태를 직접 정규화 될 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 oligomeric 상태의 과소에 발생할 수 있는 비 형광 FPs의 존재에 대 한 수정 하는 것이 중요. 이는 호모 dimeric 참조 단백질23,24 한 색상 sFCS 또는 번호를 사용 하 여 밝기와 밝기 (N &amp; B)를 측정 하 여 일반적으로 수행 됩니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM 성장 배지</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-01548</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca2+ 및 Mg2+</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w: Ca2+ 및 Mg2+</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-35500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023100</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect 형질주입 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma-Alderich</td><td>83689-1G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid DNA</td><td>Addgene</td><td>NA</td><td>모든 플라스미드 6-웰 플레이트에 대한 자세한 설명은 참고 문헌 12 (Dunsing et al., MBoC 2017)를 참조하십시오</td></tr>. <tr><td></td><td>Starlab</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>35- mm 유리 바닥 접시</td><td>CellVis</td><td>D35-14-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 컨포칼</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어 패키지</td><td>MathWorks</td><td>&nbsp; 2015년ᄂ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 세포 계수 챔버</td><td>Marienfeld</td><td>640110</td><td></td></tr></tbody></table>

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

생물 학적 과정의 다양 한 일반적으로 인접 셀 간의 인터페이스에 상호 작용 하는 단백질에 의해 중재-세포 상호 작용을 포함 한다. 관심,만 몇 가지 분석의 특히 살아있는 세포에 직접 그런 상호 작용 할 수 있다. 여기, 선물이 표현-셀 연락처에 이웃 세포의 표면에 단백질의 바인딩을 측정 하는 시험. 이 분석 결과 두 단계로 구성 됩니다: confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 셀 연락처에서 형광 변동 분광학 측정 뒤에 다른 형광 단백질을 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 혼합. 우리 셀 접속점에 걸쳐 녹말 체 선구자 같은 단백질 1 (APLP1)의 상호 작용을 측정 하 여 생물학으로 관련 된 맥락에서이 분석 결과의 타당성을 보여줍니다. 우리는 형광 기반 기술 (형광 교차 상관 분광학, 교차 상관 번호와 밝기 분석 검사)를 사용 하 여 필요한 악기 교정 데이터 수집에 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 우리는 데이터 분석 및 식별 하 고 외부, 스 퓨 리 어스 신호 변이 때문에 photobleaching 또는 셀 운동 등을 수정 하는 방법에 중요 한 단계를 논의.
일반적으로 제시 분석 결과 호모-또는 같은 또는 다른 종류의 셀 사이의 셀 연락처에서 heterotypic 단백질-단백질 상호 작용에 적용 하 고 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 구현 될 수 있습니다. 중요 한 요구 사항은 몇 분 동안 관심사의 단백질의 방산 역학 조사 하기에 충분 해야 하는 시스템의 안정성 이다.

첫 번째 테스트 단백질 단백질 상호 작용 분석 결과 대 한 즉, sFCCS/ccN &amp; B 측정 (그림 1), 괴기 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 셀의 혼합 수행 해야 되지 것으로 예상 되는 단백질에 세포 세포 접촉을 (즉, 부정적인 컨트롤)에서 상호 작용 합니다. 따라서, HEK 293T 세포 myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-팜-mEYFP) 또는-mCardinal 표현 했다 혼합 하 고 sFCCS-셀 접촉 (그림 2A)에 걸쳐 수행 되었다. 이상적인 경우, 각 채널에 형광 신호는 오후에 있는 단백질의 방산 모션 때문에 안정적인 평균 주위 변동 되어 초점 볼륨에 있는 단백질의 수의 통계 유사. 상호 작용 하지 않는 단백질에 대 한 변동 두 채널에 서로 ...

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

이 방법은 세포 대 세포 접촉에서 접착 또는 인식을 중재하는 수용체와 특정 리간드가 상호 작용을 유발하는지 여부와 같은 세포 대 세포 상호 작용 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 고정 또는 중단이 필요없는 살아있는 세포에서 직접 그러한 상호 작용을 조사 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 배양 된 세포 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되지만 다른 시스템 모노 멤브레인 소포 또는 소형 모델 유기체에도 적용 될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 새로 사용하는 개인은 세포 이동과 느린 신호 변동을 주의 깊게 검사하여 몇 분 동안 수집할 수 있을 만큼 샘플이 충분히 안정적이다는 것을 확인해야 합니다. 첫째, 배설 전 날 6웰 플레이트의 적어도 4개의 우물에서 적절한 수의 세포를 시드한다. DMEM 배지에서 섭씨 37도5%의 이산화탄소를 10%의 FBS와 1%L-글루타민으로 보충하여 세포를 배양합니다.녹색 또는 노란색 형광 단백질및 별도의 우물에서 적색 형광 단백질에 융합된 관심있는 단백질에 대한 기본 실험 트랜스펙트 플라스미드를 수행한다. 4 시간 후 성장 매체를 제거하고 세척 하는 동안 세포의 분리를 방지 하기 위해 잘 가장자리에 마그네슘과 칼슘 떨어지는 PBS로 보충 PBS의 1 밀리 리터와 함께 각 잘 씻어. 그런 다음 PBS를 제거합니다.EDTA 용액의 약 50 마이크로리터를 각 웰에 현명하게 떨어뜨려 세포의 분리를 용이하게 합니다. 2 분 동안 섭씨 37도에서 배양 한 후, 천천히 세포를 분리하기 위해 측면으로 6 웰 판을 흔들어. 다음으로, 각 우물에 950 마이크로리터의 성장 배지를 추가하고 몇 번 위아래로 파이프하여 모든 세포를 우물 바닥에서 분리하여 세포를 다시 중단합니다.셀이 제대로 다시 중단되고 재발 후 큰 셀 응집체가 없는지 시각적으로 확인하여 서로 분리되는지 확인합니다. 하나의 셀 용액을 해당 우물로 전달합니다. 위아래로 몇 번 파이프를 통해 부드럽게 섞는다.그런 다음 혼합 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 1일 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 종자 세포를 배양합니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 소프트웨어에서 광학 경로를 설정합니다. 스펙트럼 크로스토크를 피하기 위해 두 개의 별도 트랙을 선택하여 mEGFP 또는 mEYFP 및 mCherry 또는 mCardinal를 순차적으로 감지하고 모든 라인을 스위치 트랙을 선택합니다.탐

a-fluorescence-fluctuation-spectroscopy-assay-protein-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜은 걱정 기반의 근접 분석을 사용하는 방법에 이미지 단백질 단백질 상호 작용을 설명합니다.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

이 동영상은 형광 변동 분광법(fluorescence fluctuation spectroscopy)을 사용하여 세포 간 접촉에서 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 형광 단백질로 표지된 관심 대상인 막관통 접착 수용체를 발현하고 스펙트럼으로 분리된 두 개의 형광 표지를 가진 두 개의 서로 다른 세포 집단을 혼합함으로써, 서로 다른 색의 형광을 가진 두 인접 세포의 수용체 간의 trans-interaction은 형광 강도 변동의 교차 상관관계를 통해 평가됩니다.

세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

이 비디오는 단백질 호모올리고머화를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(FFS) 기술을 보여줍니다. 샘플의 형광 표지된 단백질은 FFS를 사용하여 단백질 올리고머화를 연구할 때 에이전트를 사용하여 이합체화됩니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질이 작은 관찰 부피 안팎으로 이동할 때 단백질의 올리고머 상태를 결정하기 위해 형광 분자의 밝기 변동 분석을 수행합니다.

단백질 호모올리고머화(Homo-Oligomerization)를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

이 비디오에서는 형광단 태그가 지정된 Shwachman-diamond syndrome(SBDS) 단백질과 신장 인자 유사 1 GTPase(EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 이방성 기술에 대해 설명합니다. EFL1의 농도가 점차적으로 증가하는 SBDS 단백질을 배양할 때 이방성의 꾸준한 증가가 관찰되어 두 단백질 간의 성공적인 상호 작용을 나타냅니다.

Fluorescence Anisotropy-based Detection of Protein-Protein Interaction(단백질-단백질 상호작용의 형광 비등방성 기반 검출)

단백질 사이의 상호 작용은 모든 세포 과정에 기본적이다. 생물 발광 공명 에너지 전달을 사용하여, 단백질의 쌍 사이의 상호 작용이 생균에 실시간으로 모니터링 할 수있다. 또한, 병원성 돌연변이의 효과가 평가 될 수있다.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

본 문서는 S. 세레비시아 및 HEK293T 세포 모두에서 단백질 자가 조립을 정량화하는 FRET 기반 유동 세포 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

유세포분석으로 생체내 단백질 자가 조립 검출 및 특성화

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

배우세요 형광 변동 분광학을 활용하여 살아있는 세포에서 세포 간 접촉부의 단백질 상호작용을 실시간으로 분석하는 방법을. 이 기술은 세포 고정 없이 생체 내에서 직접 상호작용을 연구할 수 있어 세포 생물학 연구에 유용합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

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