Name: 새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 학습하세요 유방암 세포에서 apoptosis 역전 후 줄기세포 유사 세포로의 전환을 flow cytometry와 FACS를 이용해 분석하는 방법을. 이 기술은 암 재발 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 혁신적인 기술 펀드의 혁신 기술 위원회에 의해 지원 되었다:는 주 키 연구소의 Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee 성 생물 의학 연구 기금과이 Hysan 재단에서 자금 지원. Y.X.는 CUHK에서 대학원 재학에 의해 지원 되었다.

1. 유 방 암 세포를 비 줄기 의 준비
<ol><li>문화 MCF-7 고 페 놀 레드 무료 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 mm 접시에 보충의 10 mL에 MDA-MB-231 셀. 문화 T47D 10ml 2 m L-글루타민 보충 페 놀 레드 무료 RPMI 1640 매체에에서, 10% 열-비활성화 FBS, 및 1 %v / v 100 mm 접시에 페니실린 스 (PS). 문화는 5% CO2/95% 공기 세포 문화 인큐베이터에서 37 ° C에 세포. 참고: 페 놀 레드 형광 기반 탐지에 영향을 뿐만 아니라31의 에스트로겐과 같은 효과 인해 유방암 세포의 성장에 대 한 잠재적인 영향을 하고있다. 예를 들어 페 놀 레드 수 황 체 호르몬 수용 체 및 MCF-7 셀31의 성장을 자극 하 고 있다. 그것은 또한 T47D 셀31의 성장을 자극할 수 있습니다.</li>
	<li>워시 셀 2 mL의 인산 염을 식 염 수 (PBS)를 두 번 버퍼링. MCF-7 및 MDA-MB-231 또는 0.25 %trypsin-EDTA T47D 세포의 2 개 mL를 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 참고: 트립 신-EDTA의 농도 필요 다른 유 방 암 세포 유형 사이 세포의 분리 다 부적절 한 농도 식 패턴 일부 세포 표면 마커 CD44 및 CD2432등의 영향을 미칠 수 있는 동안.</li>
	<li>문화 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37 ° C에서 5 분 요리. 트립 신-EDTA에 의해 이상 소화에서 세포를 방지 하기 위해 현미경 세포의 분리를 자주 확인 합니다.</li>
	<li>90% 이상 세포를 분리 때 접시에 완료 된 RPMI 매체의 5 mL을 추가 하 고 여러 번 셀 레이어 표면 플라스틱.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브와 원심 분리기에서 300 x g 와 4 ° C 5 분에 대 한 셀을 전송 합니다. 참고: 일반적으로, 약 6 x 106 세포는 confluency 70%에 도달할 경우 100 mm 접시에서 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 FACS 버퍼 (PBS 0.5 %BSA 0.1% 나트륨 아 지 드를 포함)의 106 셀/100 μ에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>여러 튜브로 셀을 나눕니다. MCF-7 셀, 4 관으로 셀 분할: 2 isotype 제어, 한 단일 CD24 CD24 긍정적인 제어 및 듀얼 얼룩으로 얼룩이 지기.</li>
	<li>T47D 셀, 3 관으로 셀 분할: 2 isotype 컨트롤과 듀얼 얼룩 한.</li>
	<li>MDA-MB-231 셀, 4 관으로 셀 분할: 2 isotype 제어, 한 단일 CD44 CD44 긍정적인 제어 및 듀얼 얼룩으로 얼룩이 지기.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 300 g 와 4 ° C 5 분에 다시 상쾌한, 삭제 한 다음 추가 Fc 블록 희석 FACS 버퍼에 1시 50분</li>
	<li>300 x g 에서 원심 분리 전에 어둠 속에서 20 분 동안 얼음에 샘플을 품 어와 4 ° C 5 분에 대 한 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>인간의 CD44에 대 한 단일 클론 항 체 형광 색소 활용 된 추가 (PerCP-Cy5.5) CD24 (PE)는 듀얼에서 (FACS 버퍼)에 1시 40분, 1시 10분 희석에 얼룩 그룹 및. 긍정적인 컨트롤에 대 한 추가 CD44 (PerCP-Cy5.5) MDA-MB-231을 각각 같은 농도에서 MCF-7 셀 CD24 (PE) 추가. 참고: CD44 C24의 조합 유 CSC 연구26,,2728,29,30에서 일반적으로 사용 되었습니다.</li>
	<li>Isotype 컨트롤 그룹에 대 한 추가 PerCP Cy5.5 마우스 IgG2b, 1시 40분에서 κ CD44 항 체 및 PE 마우스 IgG2a, κ 1시 10분에 isotype 컨트롤로 희석 106 셀/100 μ에서 CD24 항 체 isotype 제어로 희석. 참고: 관심의 항 체 Isotype 컨트롤 부정적인 컨트롤33으로 권장 됩니다.</li>
	<li>300 x g 에서 30 분 원심 분리기에 대 한 어둠 속에서 4 ° C에서 (1.12, 1.13 단계)에서 샘플을 품 어와 4 ° C 5 분에 대 한 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>PBS와 원심 분리기에서 300 x g 와 4 ° C 5 분의 500 μ로 두 번 펠 릿을 세척.</li>
	<li>형광 활성화 셀 정렬에서 실행 하기 전에 0.5 ml PBS 및 40 µ m 나일론 메쉬 통해 필터의 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>게이팅 및 보상 목적 MCF-7 안티-CD24 PE 활용 된 항 체와 세포 얼룩 하 고 긍정적인 컨트롤로 안티-CD44 PerCP Cy5.5 활용 된 항 체와 MDA-MB-231 셀 얼룩. 세포 (그림 1) 부정적인 컨트롤로 isotype 컨트롤과 스테인드를 사용 합니다.</li>
	<li>CD44 셀 수집-/CD24+ 컬렉션 매체 (페 놀 레드 무료 RPMI 1640 매체 20% 열 비활성화 FBS 및 2 %v / v PS 보충)의 1 mL를 포함 하는 라운드-하단 폴리스 티 렌 12 x 75 m m 튜브에 마커. 5 분에 대 한 g 와 RT x 300에 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한. 참고: 유방암 세포에서 CSC 같은 셀 CD44로 정의 된+/CD24- 셀26,,2728,29,30및 유 방 암 세포를 비 줄기 CD44로 정의 된다-/CD24+ 세포18 (그림 1).</li>
	<li>정렬된 유방암 비 줄기 세포 추가 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화에 대 한 신선한 컬렉션 매체를 포함 하는 문화 접시에 접시</li>
</ol>2. Apoptotic 유도 및 탐지
<ol><li>1 mM staurosporine12,34 DMSO에 준비 합니다. 치료 MCF-7 그룹에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 마지막 볼륨 (2.5 μ M staurosporine)의 최대 10 mL를 만들려고 MCF-7 셀의 완성 된 매체를 1 m m staurosporine의 25 μ를 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.</li>
	<li>셀에서 문화 매체를 제거, 2 mL PBS의 셀을 한 번 씻어. 6 h 세포 밀도 도달 하면 70% confluency apoptosis를 유도 하기 위한 MCF-7 셀에 2.5 μ M staurosporine와 매체의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>1mm paclitaxel35,36 DMSO를 준비 합니다. 대우 T47D 그룹에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 10 mL (5 μ M paclitaxel)의 최종 볼륨을 T47D 셀의 완성 된 매체를 1mm paclitaxel의 12.5 μ를 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.</li>
	<li>문화 매체는 셀에서 제거 하 고 2 mL PBS의 셀을 한 번 씻어. 10 h 세포 밀도 도달 하면 70% confluency apoptosis를 유도 하는 것에 대 한 T47D 셀에 5 μ M paclitaxel와 매체의 10 mL를 추가 합니다. 참고: 유도 시간 및 apoptosis를 유도 하는 inducers의 농도 새로운 셀 라인을 처음으로 사용 될 때마다 최적화 되어야 합니다.</li>
	<li>용 매 처리 MCF-7 그룹에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 살 균 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 25 μ MCF-7 셀 10 mL (즉, 0.25 v/v %DMSO)의 최종 볼륨을 완성 된 매체에 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.</li>
	<li>용 매 처리 MCF-7 셀에서 문화 매체를 제거, 2 mL PBS의로 한 번 씻어. 다음 sts 용 컨트롤로 0.25 %v / v DMSO 6 h에 대 한 매체의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>용 매 처리 T47D 그룹에 대 한 살 균 DMSO의 5 μ 10 mL 마지막 볼륨 (즉, 0.05 v/v %DMSO) 15 mL 원뿔 튜브에 게 T47D 셀의 완성 된 매체를 추가 합니다. 콘텐츠를 균등 하 게 혼합 플라스틱.</li>
	<li>용 매 처리 T47D 세포에서 문화 매체를 제거, 2 mL PBS의로 한 번 씻어. 그런 다음, paclitaxel에 대 한 용 매 컨트롤로 0.05 %v / v DMSO 10 h에 대 한 매체의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>치료 세포의 형태학 적 변화를 관찰, 얼룩 50 셀 Mitotracker 레드 CMXRos 및 250 ng/mL Hoechst 33342, 그리고 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37 ° C에서 또 다른 20 분 동안 품 어. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (그림 2) x 60에서 전형적인 apoptotic 세포 형태를 관찰 합니다. 참고: 전형적인 apoptosis 형태학 셀 수축, 막 blebbing, 미토 콘 드리 아 조각화 및 핵 응축을 포함 하지만 그대로 세포 막12,,1314,15 ,,1837.</li>
</ol>3. 절연 Apoptotic 세포의 Apoptosis 반전 절차
<ol><li>모두는 apoptotic 유도 및 용 매-대우 MCF-7 또는 T47D 셀 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37 ° C에서 30 분 동안 어둠 속에서 106/mL의 셀 농도에서 3 μ M Caspase-3/7 그린 감지 염료와 얼룩.</li>
	<li>40 µ m 나일론 메쉬를 통해 셀 정렬 정렬에서 실행 하기 전에 필터링 합니다.</li>
	<li>게이팅 목적, 먼저 주요 인구 (R1) 문 고 점 앞으로 분산형 및 사이드 분산형 (그림 3)에서 그래프를 그려서 파편을 제외 합니다.</li>
	<li>부정적인 지역 (R2) 게이트를 부정적인 제어로 Caspase-3/7 그린 감지 염료를 추가 하지 않고 치료 세포를 사용 하 여 (그림 3A).</li>
	<li>셀 staurosporine12,,1834 24 h에 대 한 치료와 긍정적인 컨트롤로 염료와 스테인드 긍정적인 지역 (R3) 게이트를 사용 하 여 (그림 3B).</li>
	<li>라운드-하단 폴리스 티 렌 12 x 75 m m 튜브 (동일 단계 1.18에서에서 컬렉션 매체) (그림 3C-3D) 수집 매체의 1 mL를 포함 하는 유도 치료 그룹에서 긍정적인 세포 (R3)를 수집 합니다. 5 분에 대 한 g 와 RT x 300에 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>컬렉션 단계 3.6 (그림 3E-3F)에서 매체의 1 mL와 함께 라운드 하단 폴리스 티 렌 12 × 75 m m 튜브에서 용 매 처리 그룹에서 부정적인 세포 (R2)를 수집 합니다. 참고: (예: 10000 셀) 셀의 작은 부분 수집 하 고 다시 활성 caspases 표시자의 패턴을 확인 하려면 정렬에서 실행 수 있습니다. 이상 정렬된 용 매 처리 세포의 90%는 caspase 부정적인 지역에 표시 됩니다 또는 이상의 정렬 된 유도 치료 세포의 90 %caspase 긍정적인 영역에 표시 됩니다, 이러한 수집 된 셀 비교적 순수 (그림 3 C-3 층) 될 여겨진다. 그렇지 않으면, 정렬 영역 및/또는 정렬 해야 합니다 다시 설정.</li>
	<li>신선한 수집 매체에서 정렬된 셀을 resuspend 하 고 apoptosis 반전에 대 한 일 동안 그들을 12 음 조직 문화 접시에 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37 ° C에서 문화 씨앗.</li>
</ol>4. Caspase 활성 세포 에 있는 Apoptosis의 확인
<ol><li>혼합 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 그리고 2.5 m m CaCl2 annexin 바인딩 버퍼 (pH 7.4)을 준비 하. 4 ° C에서 버퍼를 저장 하 고 빛에 노출에 버퍼를 피하십시오.</li>
	<li>PI 재고 솔루션 annexin 바인딩 버퍼의 45 µ L에서 1mg/mL의 5 µ L diluting 하 여 propidium 요오드 화물 (PI)의 100 µ g/mL 작업 솔루션을 준비 합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장 하 고 빛에 노출에 대 한 해결책을 피하십시오. 참고: PI는 잠재적인 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다.</li>
	<li>2.1 ~ 2.5 단계에서 유도 치료 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>셀을 분리 하려면 3-5 x 셀 레이어 위에 매체를 pipetting으로 유도 치료 MCF-7 또는 T47D 세포를 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송.</li>
	<li>5 분 삭제는 상쾌한 g 와 RT x 300에 원심.</li>
	<li>Resuspend 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 106/mL의 셀 농도에서 완료 된 매체와 셀 및 셀 37 ° c.에 30 분 동안 어둠 속에서 3 μ M Caspase 3/7 그린 감지 염료와 얼룩</li>
	<li>5 분은 supernatants 삭제에 대 한 300 x g 와 RT에 원심.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS와 300 x g 에서 원심 분리기의 1 mL로 세포 세척 하 고 4 ℃ 5 분에 대 한 삭제는 supernatants.</li>
	<li>Annexin V 켤레의 추가 5 μ와 annexin 바인딩 버퍼의 100 μ 셀 resuspend 100 µ g/mL의 1 µ L 작업 솔루션을 각 100 μ 셀 서 스 펜 션의 파이 하 고 실 온에서 15 분에 대 한 셀을 품 어. 참고: Annexin V와 PI는 일반적으로 함께 사용 흐름 cytometry38,,3940apoptotic 세포를.</li>
	<li>부드럽게 annexin 바인딩 버퍼, 믹스의 400 µ L를 추가 합니다. 교류 cytometer에서 실행 하기 전에 얼음 샘플을 유지.</li>
</ol>5. 유 방 CSC 같은 셀 Cytometry 측정
<ol><li>0.05% 트립 신-EDTA와 두 유도 또는 용 매 처리 그룹에서 반전된 MCF 7 수확. T47D 셀 두 유도 또는 용 매 처리 그룹에서 또는 0.25 %trypsin-EDTA 단계 1.2 ~ 1.5로 수확.</li>
	<li>인간의 CD44에 대 한 단일 클론 항 체 형광 색소 활용 된 셀 얼룩 (PerCP-Cy5.5)와 단계 1.12 같이 CD24 (PE). 한편, 준비 단계 1.13에서 isotype 컨트롤.</li>
	<li>교류 cytometer 세포 실행 하 고 CD44 포함 된 셀의 비율을 감지+/CD24- 마커.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 apoptosis 반전으로 인해 유 방 CSC-같은 세포로 유방암 비 줄기 세포의 변화를 탐지 하기 위한 직접적이 고 명확한 방법을 설명 합니다. 이러한 반전된 셀의 CSC 속성의 확인 in vitro mammosphere 형성 분석 결과 그리고 vivo에서 이 종이 식 이식 immunodeficient 쥐18,24,26 사용 하 여 지원 될 수 있습니다. ,27,,4243,44,45. 여기, 우리는 두 유 방...

암 국가 전세계1무거운 부담을 일으키는 죽음의 주요 원인이 되었습니다. 유 방 암 암1의 모든 종류 중에서 여성 환자에서 모두 발생률 및 사망률 높은 순위. 암이 성분으로 인해 약물의 조합으로 암 세포 죽음2,,34를 달성 하기 위해 화학 요법에 사용 됩니다. 그러나, 일반적인 화학요법 약물은 종종 DNA5,6대상, 이후 단백질 합성7,는8 또는 microtubule 역학9, 빠르게 성장 하는 세포는 영향을 받는 동안 대부분 암 줄기 세포 (CSC) s 등 무부하 세포는 일반적으로 덜 영향을 받는10. 따라서, CSCs는 약물 내성 및 암에는 나중에 리드10,11재발 치료 후 생존 확률이. 따라서, CSCs의 암 치료에 대 한 중요 한 주제 되 고 CSCs의 기원 연구는 필요 하다.
Apoptosis 반전의 현상에 대 한 더 많은 연구는 최근 10 년간12,13,14,15,,1617,18 에서 수행 되었습니다. , 19.이 개념의 출현 하기 전에 그것은 널리 인정 되어 셀 caspase 활성화 후 apoptosis를 받아야 돌이킬 것입니다. Caspases는 apoptotic 복잡 한 형성 및 다운스트림 기판20의 분열을 포함 하 여, apoptosis의 개시 및 실행 단계에서 주요 역할을 재생 하는 단백질 효소의 가족입니다. 사형 집행 caspases caspase 3 등 7 caspase의 활성화는 "돌아올 수 없는 지점" apoptosis21로 간주 되었습니다. 그러나, 연구원은 최근 관찰 apoptosis 반전 둘 다 생체 외에서 발생 하 고 셀 동안 vivo에서, 는 caspase 활성화12,,1314 이후에 apoptosis에서 복구할 수 있습니다. , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. 또한, 적극적인 기능 반전된 암에 높은 저항 원래 apoptotic 유도 및 높은 침입을 감지와 같은 세포15. 따라서, 그것은 CSC 같은 세포의 비율 apoptosis 반전18후 더 악성 기능에 기여 하는 결국 반전 인구 치료 세포에 비해 더 높을 것 이다 제안 했다.
이전에 많은 노력 되었습니다 apoptosis 반전 생체 외에서 그리고 더 중요 한 것은, vivo에서, 추적 하이 과정16,,1719의 보편성을 확인에 도움이 크게. 그러나, 반전된 셀의 결과 대 한 체계적 연구 진정으로 apoptosis 반전 받은 셀 럽 격리 때문 부족 이다. 순수한 apoptotic 세포를 확보 하 고 추가 연구에 대 한 그들을 복구할 필요가 있다. 따라서, apoptosis에 대 한 "돌아올 수 없는 지점"21 의 표식으로 사형 집행 caspase 활성화의 전통적으로 잘 받아들여 마커를 사용 하 고 형광 활성화 셀 정렬 caspase 활성 셀 스테인드 차별 (FACS)를 활용 Caspase-3/7 그린 검출의 염료와 염료 covalently DEVD 인식 하 고 활성 caspases 3/7에 의해 죽 습 수 있는 짧은 아미노산 시퀀스에 연결 됩니다. 분열 핵 어디 그것은 DNA에 바인딩하고 강한 형광을 방출 하는 cytosol에서 이동 것 이다 염료를 해제 하는 데 도움이 됩니다. 이 절차는 일부 셀 수 없는 받은 apoptosis 대량 세포 인구를 사용 하 여 피할 수 있습니다.
CSCs 또는 종양 시작 셀 하나를 사용 하 여 많은 단단한 종양에서 발견 되었습니다 또는 여러 표면 marker(s)와이 세포의 거의 숫자의 조합 형태로 종양 immunodeficient 쥐22,23, 충분 한 24,25,,2627. CD44 CD24의 조합 일반적으로 사용 되었습니다 가슴 CSC 연구와 CD44+/CD24- 세포 유 방 CSCs26,27,,2829 으로 정의 된 , 30. 최근, apoptosis 반전와 CSCs 제안 된 관계를 확인 하 고 반전된 유방암 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서와 증가 종양 형성 능력을 얻은 것을 입증 하는 실험의 일련을 수행 했습니다 우리는 CSC 마커18셀의 높은 백분율. 우리 유 방 CSCs 더 나은 생존과 따라서 얻을 농축 apoptosis 반전 후 중요 한 것은, 우리가 비 줄기 세포 및 주제를 분리 하는 경우 가능성을 제외 하지 수 있지만 그들 apoptosis 반전, CSC는 원래 비-줄기에 나타날 것입니다. 암 세포 인구, 제안 하는 비-줄기 암 세포 apoptosis 반전 동안 CSCs의 비율에 있는 증가에 기여할 수 있다.
이 문서는 apoptosis 반전 후 유 방 CSC 같은 셀에 유방암 비 줄기 세포에서 전환 설명 cytometry 여이 변화를 감지 하 고 목표로 하고있다. 유 방 비 줄기 암 세포는 처음 CD44 분리 하 여 준비-/CD24+ FACS에 의해 암 세포 유 방. 다음, apoptosis 유도 이며 현미경 형태학 변화에 의해 확인. 이후에, apoptotic 세포 Caspase 3/7 그린 감지 염료에 의해 긍정적으로 표시 FACS에 의해 격리 되며 추가 apoptotic apoptosis 반전에 대 한 inducers의 부재에서 경작. 반전된 셀 다음 흐름 cytometric 분석에 대 한 복구의 7 일 후 CSC 마커 얼룩이 있습니다. CD44 셀+/CD24 전환 비 줄기 암 세포에서 CSC 같은 세포 apoptosis 반전 하는 동안 발생 했습니다 제안- 마커 다시 반전된 인구에 표시.
Apoptosis 반전 여러 암에 관찰 된 세포 뿐만 아니라 정상적인 1 차 셀 체 외12,13다른 apoptotic 자극으로 치료. 이 과정 또한 초파리 에 추적 되었다 vivo에서16,,1719모델. 이 원고에 설명 된 대로 기술을 사용 하 여 다른 암 질환 모델 및 CSCs의 암 재발의 기본 메커니즘에 대 한 많은 정보를 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>미국형 배양 컬렉션(ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>미국형 배양 컬렉션(ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>미국형 배양 컬렉션(ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>인비트로겐</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 아넥신 V 접합체</td><td>인비트로젠</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent 카스파제-3/7 녹색 형광 염료</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>, Fc 블록</td>, <td>Miltenyi, Biotec</td><td>, 130-059-901</td><td></td></tr>, <tr><td>소 태아 혈청</td>, <td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>열 비활성화</td></tr><tr><td>HEPES,</td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr>, <tr><td>Hoechst 33342</td>, <td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr>, <tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td> 인간 CD24에 대한 <td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항체</td> BD <td>Biosciences</td><td>555428</td><td>PE 클론 : ML5 Lot : 5049759 RRID : AB_395822</td></tr><tr><td>인간 CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5에 대한 단일 클론 항체 : G44-26 Lot : 7230770 RRID : AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>파클리탁셀</td><td>시그마-알드리치</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE 마우스 IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone:27-35 RRID:AB_647257</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 매체</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td>페놀 무적색 아</td></tr><tr><td>지드화 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>스타우로스포린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12웰 조직 배양 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &mu; m 나일론 메쉬</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite 소프트웨어 번들 v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X 대물렌즈</td></tr><tr><td>FV10-ASW 뷰어 소프트웨어 Ver.4.2b</td><td></td> <td>Olympus-round-bottom</td><td></td></tr> <tr><td>폴리스티렌 12 &시간; 75mm 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>S3e 선별기</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 apoptosis 반전 후 흐름 cytometric 감지

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

종양학, 암 재발 오래 공부 되었습니다 기본 메커니즘 불분명 하 게 남아 있는 동안. 최근, 우리와 다른 apoptosis 반전 이라는 현상이 다른 자극 아래 다양 한 셀 모델에서 증가 tumorigenicity 리드 발견. 이전 연구 추적 생체 외에서 그리고 vivo에서;이 과정에 초점을 맞춘 되었습니다. 그러나, 진짜 반전된 셀의 절연은 아직 달성, apoptosis 반전의 결과에 대 한 우리의 이해를 제한 하 한다. 여기, 우리가 활용 Caspase-3/7 그린 감지 염료 활성화 caspases와 레이블 셀 apoptotic 유도 후. 긍정적인 신호와 셀 더 형광 활성화 된 세포 복구 (FACS)를 정렬에 의해 밖으로 정렬 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에서 형태학 시험 FACS 전에 apoptotic 상태를 확인 하는 데 도움이 됩니다. Tumorigenicity 증가 암 줄기 세포 (CSC)의 비율에 있는 상승에 종종 표시 될 수 있습니다-세포 처럼. 또한, 유방암의이 주어진,이 CSC 같은 세포의 출처를 식별 것입니다 암 치료에 중요 한. 따라서, 우리는 apoptosis를 트리거링, caspase 활성 세포를 분리 하 고 apoptosis 반전 절차를 수행 하기 전에 유방암 비 줄기 세포를 준비 합니다. 교류 cytometry 분석이 보여준다 유 방 CSC 같은 셀 유 방 CSC 같은 세포는 apoptosis 반전 동안 유방암 비 줄기 세포에서 통과할 나타내는 반전된 그룹에 다시 나타납니다. 요약 하자면,이 프로토콜 cytometry apoptotic 유방암 세포의 분리 및 반전된 셀에 CSC 비율에서 변경의 탐지를 포함 한다.

전환 가슴에서 유 방 CSC 같은 셀, CD44의 첫 번째 정렬 비 줄기 암 세포를 관찰 하기 위해-/CD24+ 유방암 세포 필요 했다. MCF-7 셀 라인을 약 0.15% 원래 인구 (그림 1),이 단계에서에서 CSC 표식이 있는 셀 있었습니다 apoptosis 반전 하는 동안 CSC 농축의 가능성을 제외. 그와 반대로, 원래 인구에서 CSC 표식이 있는 셀을 확인 하 고 있었다와 같은 T47D 세포 (그림 1)에 대 한이 정렬 절차 수 있습니다. 생략할 수 있습니다. 실제로, gating 긍정 부정적인 결국 CSC 결정의 비율에 영향을 미칠 것입니다 각 마커의 정의 영향을. 따라서, 적절 한 컨트롤의 항 체 isotype 컨트롤을 포함 하 여, 각 표식에 대 한 단일 스테인드 컨트롤 해야 신중 하 게 선택 되며 게이트 조정...

여기, 선물이 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 유방암 apoptotic 세포를 분리 하 고 추가 cytometry에 의해 apoptosis 반전 후 유방암 줄기 세포와 같은 세포에 유 방 비 줄기 암 세포의 전이 감지 하는 프로토콜.

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

apoptotic 반전 세포의 진정한 인구의 고립은 크게 세포 사멸 반전의 결과에 대한 우리의 이해를 제한하는 이전에 문제가되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 세포 반전 세포의 순수한 인구를 생성 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용되는 재료와 장비가 다른 기관에서 널리 사용할 수 있다는 것입니다.이 기술은 세포 의 반전을 겪은 세포의 순수한 인구를 격리하기 위해 쉽게 적용 할 수 있습니다. 이전에 보고된 바와 같이, 정상 세포는 또한 유방암 세포, 상이한 화학세포, 정상 세포뿐만 아니라, 개시될 수 있고 각종 세포 자극을 사용할 수 있다는 것을, 세포 사멸 반전을 겪을 수 있다. 반전 셀은 세포가 세포사멸과 빠른 정렬을 거쳤기 때문에 회복율은 일반적으로 낮습니다.더 큰 시작 셀 수는 최종 수율을 높이기 위해 재조합됩니다. 시작하려면, 문화 MCF-7, MDA-MB-231, 시작하려면, 문화 MCF-7, MDA-MB-231, 및 T47D 셀, 텍스트 프로토콜에 따라. 그 후, PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 0.05%의 트립신-EDTA의 2밀리리터를 MCF-7에 0.05% 트립신-EDTA에 추가합니다. MDA-MB-231 세포, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포, T47D 세포에 0.25%의 트립신-EDTA와 2밀리리터의 2밀리리터.T47D 셀에. 5%의 이산화탄소 세포 배양배에서 섭씨 37도에서 5분간 세포를 배양합니다. 세포가 배양하는 동안, 트립신-EDTA에 의한 과다 소화를 방지하기 위하여 현미경으로 세포의 분리를 확인하십시오.세포의 90% 이상이 분리되면 완성된 RPMI 배지 5밀리리터를 접시에 넣고 셀 층 표면에 여러 번 파이펫을 넣습니다. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 원내 튜브 및 원심분리기로 이송합니다. 상체를 버리고 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리구에서 FACS 버퍼로 펠릿을 다시 중단하십시오.그런 다음 세포를 여러 튜브로 나눕니다. 튜브를 다시 한 번 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오. 그런 다음 희석된 Fc 블록을 샘플에 추가합니다.샘플을 다시 원심분리하기 전에 20분 동안 어둠 속에서 얼음에 샘플을 배양합니다. 이 후, 상체를 폐기. 다음으로, 인간 CD44 및 CD24에 대하여 불소크롬-공주된 단일클론 항체를 인간 CD44 및 CD24에 대하여, 각각 1-40, 및 1-10 희석제에 대하여, 이중 염색 단에 추가한다.양성 대조군을 위해, CD44 항체를 첨가하여 양성 대조군을 위해, MDA-MB-231 세포에 CD44 항체를 추가하고, MDA-MB-231 세포에, CD24 항체를 MCF-7 세포 및 CD24 항체에 1~40, 1-10희석제, 각각 1~10개의 희석제에 첨가한다. PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b 카파를 추가하고, CD44 항체에 대한 동위원소 대조군으로서 세포에 대한 1 대 40 비율로 희석된 PerCP-Cy5.5 마우스 IgG2b 카파를 추가합니다. 이어서, PE 마우스 IgG2a Kappa를 추가한 다음, CD24 항체에 대한 동위원소 대조군으로서 세포에 1 대 10 비율로 희석된 PE 마우스 IgG2a Kappa를 첨가한다.30 분 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에서 샘플을 배양. 그런 다음 300g'sThen에서 샘플을 원심분리하고 샘플을 300g및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 500 마이크로 리터의 PBS로 펠릿을 두 번 씻으십시오.그런 다음 이전에 설명한 대로 원심분리를 반복합니다. PBS의 0.5 밀리리터에 펠릿을 다시 일시 중단하고 40 마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 그런 다음 형광 활성화 셀 선별기를 통해 서스펜션을 실행합니다.CD44 음성, CD24 양성 마커를 수집하여 수집 배지의 1밀리리터를 포함하는 둥근 바닥 튜브에서 세포를 수집합니다. 그런 다음 튜브를 원심 분리하고 상체를 폐기합니다. 다음으로, 선별된 유방 비줄기 암세포를 신선한 수집 배지를 함유하는 배양 접시에 플레이트하여 추가 배양에 대한 배양.먼저, DMSO에서 1밀리머 스타우로스포린을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 2.5 마이크로 어금니 스타우로스포린을 매체로 준비한다. 그런 다음, 세포로부터 배양 배지를 제거한다. PBS의 2 밀리리터로 세포를 한 번 세척한 후, 6시간 동안 MSF-7 세포에 staurosporine 배지의 10 밀리리터를 추가하여 세포가 70% 컨실수일 때 세포가 석멸을 유도합니다.다음으로, DMSO에서 밀리머 파클리탁셀 1개를 준비한다. 그런 다음 12.5 마이크로 리터를 추가한 다음 1밀리미터 파클리탁셀의 12.5 마이크로 리터를 T47D 세포의 완성된 배지에 추가하여 15 밀리리터 원컬 튜브에서 10 밀리리터의 최종 부피를 구성합니다. 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척하십시오.이어서, 세포가 70%의 합류에 도달할 때 세포가 세포에 10시간 동안 세포에 첨가하여 세포가 70%의 합류에 도달할 때 세포가 세포에 도달할 때 세포가 세포에 세포가 세포에 서멸을 유도하도록 유도한다. 그 후, 용매 처리 MCF-7 그룹에서 배지를 제거하고 PBS의 2밀리리터로 세척한다. 그런 다음, 0.25% DMSO 배지의 10 밀리리터를 추가한 다음, Staurosporine용 용매 제어로 6시간 동안 0.25% DMSO 배지의 10밀리리터를 추가합니다.용매 처리 된 T47D 그룹에서 배양 배지를 제거하고 PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척하십시오. 그런 다음, 0.05% DMSO 배지의 10 밀리리터를 추가한 다음, 파클리탁셀용 용매 제어로 10시간 동안 0.05% DMSO 배지의 10밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 세포를 얼룩지게 하고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.60배의 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 처리된 세포의 형태학적 변화를 관찰한다. 염색은 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도에서 30분 동안 어둠 속에서 세포 멸폐 유도제 및 용매 처리 MCF-7 및 T47D 세포와 용매 처리 MCF-7 및 T47D 세포를 모두 염색한다. 형광 활성화 세포 선별기를 사용하여, 수집 배지의 1 밀리리터를 포함하는 둥근 바닥 튜브에서 유도자 처리 된 그룹에서 양성 세포를 수집한다.그런 다음, 이전에 설명한 바와 같이 튜브를 원심분리하고 상신을 폐기한다. 수집 배지의 1 밀리리터와 둥근 바닥 튜브에서 용매 처리 된 그룹에서 음의 세포를 수집합니다. 튜브를 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.그런 다음 정렬된 셀을 신선한 수집 배지에서 다시 중단합니다. 12웰 조직 배양 판에 세포를 시드하고, 세포 배양 반전에 대한 7 일 동안 배양. 0.05% 트립신-EDTA를 유도하는 유도제 및 용매 처리 군 모두에서 반전된 MCF-7을 수확한다.0.05%의 트립신-EDTA. 이어서, T47D 세포를 유도자 에서 수확한 다음, 0.25%의 트립신-EDTA를 유도하는 유도제 및 용매 처리 군 모두에서 T47D 세포를 수확한다. 인간 CD44 및 CD24에 대한 불소-공주 단일 클론 항체를 가진 세포를 얼룩.세포 얼룩 동안, 이전에 설명한 대로 등색형 컨트롤을 준비한다. 마지막으로, 유동 세포계에서 세포를 실행하고 CD44 양성 및 CD24 음성 마커를 가진 세포의 백분율을 감지합니다. 이 프로토콜에서, 유방 비줄기 암세포에서 유방 CSC 같이 세포로의 전이가 관찰되었다.비줄기 암세포의 분리는 MCF-7 세포에서 처음 수행되었다. 전형적인 형태학적 변화는 세포 유도제를 첨가한 후 관찰되었고, 세포는 약물 철수 후 유사한 형태를 가진 세포로부터 회복되었다. 카스페이스 활성화 된 세포는 카스페이스 활성화없이 세포보다 높은 형광 강도에 기초하여 표지및 분류되었다.세포유도 과정에서 용매는 사실 절차 또는 용매 자체가 전환의 원인이 될 가능성을 배제하는 데 사용되었다. 세포-유도제 치료 군에서 Caspace 활성화 세포는 넥신 5 양성 및 PI 음성으로 발견되었으며, 이는 세포 세포임을 시사한다. 상기 세포세포는 용매 처리군에 비해 회복을 위해 수집및 배양되었고, 유동 세포측정 분석은 CD44 양성 및 CD24 음성 사분면에 나타나는 세포가 반전된 원래 유방암 비줄기암 세포 집단에서 나타나는 것으로 나타났다.재갈은 유량 분석 및 세포 정렬에서 중요하며 실험실에서 충분한 제어를 준비해야합니다. 이 시험관 내 세포 세포 반전 절차는 순수한 세포 암세포를 분리하기 때문에, 생체 내 종양 발생 자산과 같은 실험은 실제 세포의 결과를 이해하기 위해 수행 될 수있다. 이 기술은 암 재발의 원인에 빛을 비추므로 암 환자의 재발을 잠재적으로 예방하기 위해 조사 될 수 있습니다.기관에서 생물 안전 계층 규정에 따라 세포 배양 실험을 수행 할 때 제대로 자신을 보호해야합니다.

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