Name: qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 배우세요 qKAT 방법을 통해 KIR 유전자 복제수를 정량 분석하는 고처리량 기술입니다. 이 기술은 NK 세포 수용체 유전학 및 질병 연관성 연구에 활용됩니다.

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의료 연구 위원회 (MRC), 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (부여 계약 번호 695551)에서 유럽 연구 회의 (ERC)와 국립 보건원 (NIH) 케임브리지에서 자금 지원을 받은 프로젝트 생물 의학 연구 센터와 NIH 연구 혈액 및 이식 연구 단위 (NIHR BTRU) 장기 기증 및 이식 캠브리지 대학에서 보 건국 혈액과 이식 (NHSBT)와 협력 표현 되며 그 저자 반드시 보 건국에서 NIHR, 보건, 또는 NHSBT의.

1. 준비 및 DNA 중 도금
<ol><li>정확 하 게 계량 gDNA 농도 spectrophotometric 또는 fluorometric 악기를 사용 하 여.</li>
	<li>96-잘 깊은 잘 격판덮개에 4 ng / µ L에 DNA를 희석. 알려진된 복사 번호와 하나 이상의 컨트롤 gDNA 샘플 및 비-템플릿 컨트롤을 포함 합니다.</li>
	<li>2 분 동안 g 450 x 96 잘 접시 원심</li>
	<li>모든 음에 10 384-잘 정량 접시에 quadruplicate에서 각 샘플을 분배 액체 처리 장비를 사용 하 여 DNA의 ng (2.5 µ L/잘). 각 qKAT 반응 한 적어도 10 384-잘 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>GDNA 이상의 96 잘 접시에서 적절 하 게 되는, 전체 볼륨 세척 표 백제 2%와 초순 수 처리 시스템 gDNA 샘플의 96 잘 접시 각 사이 액체의 바늘을 청소를 수행 합니다.</li>
	<li>24 시간 이상 실 온에서 깨끗 한 지역에서 384-잘 접시를 배양 하 여 DNA를 건조.</li>
</ol>2입니다. 프라이 머 및 프로브의 준비
참고: qKAT 10 다중 반응 이루어져 있다. 각 반응에는 3 개의 뇌관 쌍 구체적으로 두 가지 키 르 유전자와 하나의 참조 유전자 증폭 3 형광 표시 된 프로브 포함 되어 있습니다. 장 외.27 에 프로브는 oligonucleotides 이제 표시 됩니다 거 염료 때문에 그들이 제공 하는 향상 된 photostability 및 긴 신호 수명을 수정 했다. 전 aliquoted 뇌관 조합은 상용 ( 재료의 표참조).
<ol><li>표 1에 주어진 희석에 의하여 각 반응 위한 뇌관 조합 준비.</li>
	<li>표 1에 의하여 각 반응에 대 한 프로브 조합을 준비 합니다. 결합 하기 전에 각 개별 프로브를 테스트 합니다.</li>
</ol>3입니다. 마스터 믹스의 준비
참고 아래에 언급 된 볼륨 10 x 384-잘 접시 세트에서 1 개 qKAT 반응 수행입니다.
<ol><li>384-잘 접시에 도금 gDNA 샘플 완전히 건조 있는지 확인 하십시오. 얼음에 모든 단계를 수행 하 고 시 약 때문에 형광 표시 된 프로브는 사진 및 온도 구분 가능한 빛에 노출에서 덮여 유지.</li>
	<li>서 리 없애다 정량 버퍼, 뇌관, 및 4 ° c.에 프로브 aliquots</li>
	<li>얼음, 초순, 정량 버퍼, preprepared 뇌관 조합, 1000 µ L 및 preprepared 프로브 조합 (표 2)의 180 µ L의 20 mL의 18.86 mL을 추가 하 여 마스터 믹스 10 x 384-잘 접시에 대 한 준비.</li>
	<li>분산 마스터 믹스 균등 하 게 각 우물에 415 µ L를 pipetting 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96-깊은 잘 격판덮개. 빛에서 덮은 얼음 상자에이 접시를 유지.</li>
	<li>액체 취급 악기를 사용 하 여, 말린된 gDNA 384-잘 접시의 각 음에 마스터 믹스의 9.5 µ L 분배. 호 일 접시를 봉인 하 고 즉시 4 ° c.에 그것을 배치합니다 나머지 접시, 바늘 액체 처리 시스템의 각 판 사이 물으로 세척은 보장에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>384-잘 접시 3 분 450 x g에서 원심 고 하룻밤에 4 ° C에서 또는 사이 6-12 h DNA를 resuspend 하 고 있는 어떤 공기 거품을 없앨 수 있습니다 그들을 품 어.</li>
</ol>4입니다. 정량 분석 결과
<ol><li>야간 보육에 따라 어떤 나머지 공기 거품이 사라지고 3 분 450 x g 에서 원심.</li>
	<li>정량 Pcr 기계 (예: LightCycler 480) microplate 처리기 연결 자동화의 목적 ( 재료의 표참조). 빛에서 보호 되는 냉각된 저장 독에서 정량 Pcr 기계에 접시를 microplate 처리기 프로그램. 참고 는 분석 실험, 이론, 컴퓨터에서 작동 다른 정량 호환 광섬유 설정.</li>
	<li>다음 자전거 조건을 사용 하 여: 95 ° C의 40 주기 뒤에 5 분 동안 95 ° C 15 s와 66 ° C 50에 대 한 s, 66 ° c.에 데이터 수집</li>
	<li>실행 완료 되 면, 로봇 정량 Pcr 기계에서 접시를 수집 하 고 폐기 독에 있다.</li>
</ol>5. 실행된 후 분석
<ol><li>증폭 후 정량 컴퓨터의 소프트웨어와 함께 두 번째 파생 최대 메서드 또는 맞는 포인트 메서드를 사용 하 여 정량화 주기 (Cq) 값을 계산 ( 재료의 표참조), 다음 단계.</li>
	<li>정량 소프트웨어를 열고 탐색기 탭에서 한 접시에 대 한 저장 된 반응 실험 파일 엽니다.</li>
	<li>
두 번째 파생 최대 메서드를 사용 하 여 분석을 위해 분석 탭을 선택 하 고 Abs Quant/Second 파생 Max 메서드를 사용 하 여 새 분석을 만들.
	<ol>
<li>만들기 새로운 분석 창에서 선택 분석 종류: Abs Quant/Second 파생 Max 메서드, 하위 집합: 모든 샘플, 프로그램: 증폭, 이름: Rx-돌연 사 했을까 (여기서 x 는 반응 수).</li>
		<li>필터 빗 고 빅/16 진수/Yellow555 (533-580)를선택 하십시오. 그러면 STAT6 수집 데이터 선택.</li>
		<li>VIC/HEX/Yellow555(533-580)에 대 한 컬러 보정 을 선택 합니다. 계산을 클릭 합니다. 팸 (465-510) 및 Cy5/Cy5.5(618-660)에 대 한 반복이. 파일 저장을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
맞는 포인트 메서드를 사용 하 여 분석을 위해 분석 탭에서 Abs 양의/맞는 포인트를 선택 합니다.
	<ol>
<li>만들기 새로운 분석 창에서 선택 분석 종류: Abs 양의/맞춤 포인트 방법, 하위 집합: 모든 샘플, 프로그램: 증폭, 이름: RxF-돌연 사 했을까 (여기서 x 는 반응 수).</li>
		<li>올바른 필터 및 STAT6 및 키 르 유전자 (팸/Cy5) 각각의 색상 보정을 선택 합니다. Noiseband 탭에서 배경 잡음을 제외 하려면 소음 밴드를 설정 합니다.</li>
		<li>분석 탭에서 3 에 맞는 포인트를 설정 하 고 쇼 포인트에 맞게선택 합니다. 계산을 클릭 합니다. 파일 저장을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 결과의 수출
<ol><li>정량 소프트웨어에서 탐색기 를 열고 탭 선택 결과 일괄 내보내기.</li>
	<li>실험 파일 저장 되 고 윈도우의 오른쪽 부분에는 파일을 전송할 폴더를 엽니다. 다음을 클릭 합니다. 이름 및 내보내기 파일의 위치를 선택 합니다.</li>
	<li>Abs Quant/Second 파생 Max 메서드 또는 Abs 양의/맞춤 포인트분석 유형을 선택 합니다. 다음을 클릭 합니다. 내보내기 폴더 파일과 분석 종류의 이름이 올바른지 확인 하 다음 내보내기 프로세스를 시작 하려면 클릭 합니다.</li>
	<li>내보내기 상태 확인될 때까지 기다립니다. 화면 자동으로 다음 단계로 이동 합니다. 선택한 모든 파일 성공적으로 내보낸 확인을 실패 한 파일 수 = 0. 완료를 클릭 합니다.</li>
	<li>각 접시에 대 한 개인적인 반응이 내보낸된 접시를 분할할 스크립트 split_file.pl 및 roche2sds.pl를 사용 합니다. 참고 스크립트 요청/GitHub에 제공 됩니다.</li>
</ol>7. 숫자 계산
<ol><li>복사 번호 분석 소프트웨어 (예: CopyCaller)를 엽니다. 실시간 PCR 결과 파일 가져오기를 선택 하 고 roche2sds.pl에서 만든 텍스트 파일을 로드.</li>
	<li>분석 을 선택 하 고 어느 선택 알려진된 복사 번호 보정 샘플 또는 가장 빈번한 복사본 수를 선택 하 여 분석을 실시. 일반적으로 유럽 근원 인구에서 관찰 하는 키 르 유전자의 가장 빈번한 복사 번호 표 5 를 참조 하십시오.</li>
</ol>8. 데이터 품질 검사
<ol><li>KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 R 스크립트를 사용 합니다. R 스프레드시트에 모든 접시에서 숫자 데이터를 복사를 결합 하 여. 참고 스크립트 요청/GitHub에 제공 됩니다.</li>
	<li>키 르 유전자 (표 6)에 대 한 알려진된 결합 불균형 (LD)을 따르지 않는 샘플에 대 한 복사 번호 분석 소프트웨어에 원시 데이터 확인</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li>
<li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+%2B+HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li>
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<li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li>
<li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li>
<li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li>
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<li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS1%2C+2DS5%2C+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li>
<li>Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li>
<li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 소설 반자동된 높은 처리량 메서드를 복사 키 르 유전자. 의 숫자 입력을 용이 하 게 qKAT 설명 방법은 낮은 처리량이 높은 다형성 유전자의 유무만 나타낼 수는 SSP-PCR, 같은 기존의 방법에 비해 개선 이다.
가져온 숫자 데이터 복사의 정확도 품질 및 농도-gDNA 샘플 및는 시 약의 품질의 균일성을 포함 한 여러 요인에 따라 달라 집니다. 이후 유사 농도 격판덮개의 맞은편에 복사 숫자의 계산에서 오류가 발생할 수 있습니다 품질 및 접시에 걸쳐 gDNA 샘플의 정확도 매우 중요 하다. 분석 실험 유럽 원본 샘플 세트를 사용 하 여 확인 했다, 이후 동료는 세계의 다른 부분에서에서 데이터 보다 철저 한 검사를 필요로 합니다. 이것은 대립 유전자 강하 또는 일반적인 뇌관/프로브 바인딩 인스턴스 복사 번호 유사로 오해 하지는 보장 하기 위해.
분석 실험 설계 하 고 높은 처리량으로 실행 하도록 최적화, 하는 동안 그들은 적은 샘플을 실행 하려면 수정할 수 있습니다. 적은 샘플을 분석할 때 자신감 통계 복사 번호 분석 소프트웨어에 영향을 하지만이 알려진된 키 르 유전자 복사 번호와 제어 genomic DNA 샘플에 포함 되어 있고 추가 샘플 복제는 향상 시킬 수 있습니다. 포함 되어 있습니다.
액체/플레이트-처리 로봇 없이 실험실, 멀티 채널 펫을 사용 하 여 마스터 믹스를 적절 수 있습니다 및 판 정량에 수동으로 로드할 수 있습니다.
QKAT의 발달의 뒤에 주요 목표를 만드는 간단 하 고, 높은 처리량, 고해상도, 고 비용 효율적인 방법을 유전자 KIRs 질병에 대 한 협회 연구 했다. 이것은 성공적으로 달성 이후 qKAT 감염 증, 자기 면역 조건, 그리고 임신 장애4, 의 범위를 포함 하 여 몇몇 큰 질병 협회 연구에 키 르 의 역할 조사에서 고용 되어 24 , 25 , 26.

인간에서는, 살인자 같은 면역 글로불린 수용 체(키 르) 로커 스는 백혈구 수용 체 복합물 (LRC) 내의 염색체 19의 긴 팔에 매핑됩니다. 이 로커 스 길이 약 150 kb 고 15 키 르 유전자 배열 머리-투-꼬리를 포함 한다. 현재 알려진 키 르 loci는 KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR2DL4 KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3 그리고 두 pseudogenes, KIR2DP1 및 KIR3DP1. 키 르 유전자 2 차원 (2D)에 대 한 인코딩 및 짧은 (S; 활성화) 3 차원 (3D) 면역 글로불린과 같은 도메인 수용 체 또는 긴 (L; 억제) 세포질 꼬리, 자연 킬러 (NK) 세포와 T의 하위 집합으로 표현 되는 셀입니다. 복사 번호 유사 키 르 로커 스 양식 내의 변수 진 콘텐츠1다양 한 haplotypes 전시. 비-유전자 동종 재결합 (NAHR), 가까운 머리-투-꼬리 유전자 배열 및 높은 순서 상 동에 의해 촉진 된 haplotypic 변화에 대 한 책임을 질 것을 제안 하는 메커니즘입니다. 100 개 이상의 다른 haplotypes 인구 전세계1,2,,34에 보고 되었습니다. 이러한 모든 haplotypes 두 가지 주요 그룹으로 분할 될 수 있습니다: A와 B haplotypes. A haplotype 포함 7 키 르 유전자: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1및 KIR3DL2, 억제 키 르 유전자, 그리고 활성화 키 르 유전자 KIR2DS4. 그러나, 최대 70% 유럽 근원 개인의 키 르 haplotype를 위해 homozygous 독점적으로 수행 KIR2DS45,6의 비 기능 "삭제" 형태. 다른 모든 키 르 유전자 조합을 형성 그룹 B haplotypes, 특정 키 르 유전자 KIR2DS1, 중 적어도 하나를 포함 하 여 KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, 그리고 KIR2DL5, 일반적으로 두 개 이상의 활성화 키 르 유전자를 포함 하 고.
HLA 종류 I 분자 특정 금지 수용 체 (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3및 KIR3DL1) 활성화 수용 체 (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, 에 대 한 ligands로 확인 되었습니다 KIR2DS5, 및 KIR3DS1), 그리고 KIR2DL4에 대 한 고유 키 르 다른 억제 키 르 수용 체 처럼 긴 세포질 꼬리를 포함 하지만 또한 긍정적으로 위탁된 한 잔류물은 일반적인 세포 외 도메인 근처에 있다 다른 활성화 키 르 수용 체의 기능입니다. 키 르 유전자와 HLA 유전자 이체의 조합 그 모양 잠재적인 NK 세포 응답 개별 레벨7,8수용 체 ligand 상호 작용을 좌우 한다. 유전 협회 학문에서 증거는 키 르 에 역할 (예:., 인간 면역 결핍 바이러스 [HIV]9 , C 형 간염 바이러스 [HCV]10), 바이러스 성 저항 표시는 이식 의 성공 11, 임신 장애, 생식 성공12,13, 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)14,15, 후 재발에 대 한 보호의 위험 16, 그리고 암17의 위험.
높은 순서 상 동의 조합 유전자 그리고 정확 하 게 유전형 키 르 유전자의 작업에서 haplotypic 다양성 선물 도전. 키 르 유전자 입력을 기존의 방법 순서 특정 뇌관 (SSP) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)18,,1920, 시퀀스 특정 oligonucleotide 조사 (SSOP) PCR21, 그리고 매트릭스 보조 레이저 이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)22desorption. 이러한 기술의 단점은 그들은 단지 부분에 통찰력을 제공 개인의 유전자 형 또한 수행 하는 힘이 드는 되 고 하는 동안 있습니다. 최근 차세대 시퀀싱 (NGS) 키 르 로커 스를 구체적으로 입력에 적용 되었습니다. 이 메서드는 매우 강력 하 고, 하는 동안 실행, 비쌀 수 있다 그리고 그것은 심층 분석 및 데이터 검사를 수행 하면 시간이 많이 소요.
qKAT는 높은 처리량 정량 PCR 방법입니다. 기존의 방법 힘들고 시간이 걸리는 반면, 두 일에 거의 1000 게놈 DNA (gDNA) 샘플을 실행할 수 있게 메서드와 키 르 유전자 유전자 복사 번호 제공. 10 다중 반응, 두 키 르 loci를 대상으로 각각의 이루어져 있다 qKAT 그리고 고정된 복사본 번호 게놈 (STAT6) 키 르 유전자의 상대적 정량화에 대 한 사용에 한 참조 유전자 복사 번호23. 이 분석 결과 유전자 제공 뿐만 아니라 큰 인구 패널 및 HCV, 타입-1 당뇨병 같은 면역 조건 등 전염 성 질환 및 자간 전 증, 같은 임신 장애 질병 동료 연구 성공적으로 사용 되었습니다. NK 세포 기능1,4,,2425,26를 이해 하기 위한 연구에 underpinning.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Sigma</td><td>Custom</td><td>order SEQUENCES: 표 4에 나열</td></tr>됨 <tr><td>ATTO 염료로 표시된 프로브</td><td>Sigma</td><td>Custom</td><td>order SEQUENCES: 표 3에 나열됨</td></tr><tr><td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-86020</td><td>&minus;</td></tr><tr><td>MilliQ 물</td><td>&마이너스;</td><td>&빼기;</td><td>&빼기;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td><td>Eppendorf(또는 동급)</td><td>Eppendorf 5810R 또는 동급 시스템</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuBit 형광측정기</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Hydra</td><td>Thermo Scientific</td><td>109611</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td><td>Roche</td><td>05015243001</td><td></td></tr><tr><td>Twister II 마이크로플레이트 핸들러(M&eacute 포함); Cour 열 플레이트 스태커(M&eacute; Cour)</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>204135</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Biosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>단일 채널 피펫 (부피 범위: 0.5&ndash; 10 & 마이크로; L, 2&ndash; 20 & 마이크로; L, 20&ndash; 200 &마이크로; L, 200&ndash; 1,000 &마이크로; L; 1-10 mL)</td><td>Gilson(또는 동급)</td><td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td><td></td></tr><tr><td>RNase- 및 DNase-free 피펫 팁 여과(10 &micro; L, 20 &마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1,000 &마이크로; L, 10 mL)</td><td>Starlab (또는 동급)</td><td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td><td></td></tr><tr><td>StarTub PS 시약 저장용기, 55 mL</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>STARLAB</td><td>E1450-0200</td><td></td></tr><tr><td>96-well deep well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12194162</td><td></td></tr><tr><td>LC480 384 Multi-well plates</td><td>Roche</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 씰링 포일</td><td>Roche</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 480 소프트웨어 v1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems CopyCaller 소프트웨어 v2.1</td><td></td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td></tr><tr><td>KIR 일배체형 식별자</td><td></td><td></td><td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td></tr></tbody></table>

qkat: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

킬러 세포 면역 글로불린 같이 수용 체 (KIRs) 금지 및 활성화 면역 수용 체의, 자연적인 살인자 (NK) 및 T 세포, 유전자의 다형성 클러스터 염색체 19에 의해 설정 됩니다. 그들의 가장 특징이 ligands는 염색체 6에 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 로커 스 이내 인코딩됩니다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자. 그들은 면역, 재생산, 및 이식, 유전자 형을 정확 하 게 할 수 있는 기술을가지고 중요 한 만드는 중요 한 역할을 재생 하는 실질적 증거는 그들. 그러나, 높은 순서 상 동, 뿐만 아니라 유전자 및 복사 번호 유사, 어렵게 정확 하 게 할 수 있는 디자인 방법 및 효율적으로 유전자 형을 모든 키 르 유전자. 전통적인 방법 일반적으로 가져온 데이터의 해상도, 처리량, 비용 효과성, 및 시간 설정 및 실험을 실행에 제한 됩니다. 우리 설명 양적 키 르 반 자동 입력 (qKAT) 라는 메서드는 키 르 로커 스에 있는 모든 유전자의 유전자 복사 번호를 확인할 수 있는 높은 처리량 다중 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 방법입니다. qKAT은 고해상도 키 르 숫자 데이터 복사, 그들을 포함 하는 구조적 다형성 haplotypes의 변화를 추정 하는 것 더 사용 될 수 있는 제공할 수 있는 간단한 높은 처리량 방법. 이 복사 번호와 haplotype 데이터에 대규모 질병 협회, 집단 유전학, 표현과 키 르 와 HLA간의 기능 상호 작용에 대 한 조사 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.

양적 살인자 세포 수용 체 면역 글로불린 같이 (키 르) 반자동 입력 (qKAT) 인구와 질병 협회 연구에 그들의 응용 프로그램에 대 한 숫자 형식 키 르 유전자를 복사 하는 간단한, 높은 처리량 및 비용 효율적인 방법입니다.

qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

이 방법은 haplotype 다양성과 같은 NK 세포 수용체 유전학에 대한 주요 질문에 대답 할 수 있으며 이것이 질병과 어떻게 관련이 있는지. 이 방법의 시각적 데모는 자동화 프로세스 및 데이터 분석을 포함하여 실험실에서 프로토콜을 설정하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 방법과 달리 정량적인 KIR 자동 타이핑을 의미하는 qKAT이 높은 처리량이며 유전자 복사 번호를 제공한다는 것입니다.qKAT은 질병 협회에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 HIV와 C형 간염과 같은 바이러스 성 감염, 암, 줄기 세포 이식 및 임신 장애와 같은 치료에 유용 할 수 있습니다. qKAT는 또한 KIR와 HLA 분자 사이 발현 그리고 기능적인 상호 작용을 탐구하는 것 뿐만 아니라 인구 유전학을 공부에서 적용될 수 있습니다.qKAT는 2개의 KIR 유전자 및 1개의 참조 유전자의 exons를 구체적으로 표적으로 하는 10개의 멀티플렉스 반응으로 이루어져 있습니다. 이 프로토콜에서, 특정 프라이머는 주어진 유전자의 진동을 검출하도록 설계되고 PCR 결과는 짧은 앰플리톤에서 초래된다. 그 후 이중 표지된 특정 가수분해 프로브를 사용하여 PCR 증폭을 실시간으로 모니터링합니다.복사 번호 분석은 기준 유전자에 대한 표적 KIR 유전자의 상대적 정량화를 사용합니다. qKAT은 고처리량 기술로 설계 및 설정됩니다. 따라서, 각 반응은 단지 1, 000 샘플 에서 수행 될 수있다.다음 단계는 각 96웰 DNA 플레이트의 제조 및 도금에 관련된 단계를 보여줍니다. 먼저, DNA를 정량화 한 후, 96 잘 깊은 우물 접시에 DNA를 희석. 알려진 복사 번호와 템플릿이 아닌 컨트롤이 있는 하나 이상의 컨트롤 샘플을 포함합니다.2 분 동안 450 gs에서 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음 각 샘플을 384웰 qPCR 플레이트로 네 배로 분배합니다. 그 후, 공기는 24 시간 동안 실온에서 깨끗한 영역에서 DNA를 건조.10 384웰 플레이트에 대해 하나의 qKAT 반응을 설정하려면 먼저 qPCR 버퍼, 프라이머 및 프로브 알리쿼트를 섭씨 4도에서 해동합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 멀티 채널 파이펫을 사용하여 마스터 믹스를 96웰 의 딥 웰 플레이트에 고르게 분배합니다.말린 gDNA 샘플로 9.5 마이크로리터의 마스터 믹스를 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 그런 다음 접시를 호일로 밀봉하고 즉시 섭씨 4도에 보관하십시오. 하나 이상의 384 웰 DNA 플레이트에 마스터 믹스를 분배하는 경우 액체 처리 시스템의 바늘을 청소하기 위해 짧은 물 세척을 수행하는 것을 기억하십시오.3 분 동안 450 gs에서 gDNA 샘플로 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음, 4섭씨에서 플레이트를 배양하여 DNA를 다시 중단하고 기포를 분산시합니다. 하룻밤 동안 접시를 배양 한 후, 모든 기포를 분산원심분리를 반복합니다.그런 다음 냉각 된 저장 도크에 접시를 놓습니다. qPCR 기계를 마이크로플레이트 처리기에 연결합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 플레이트 처리기를 프로그래밍합니다.실행이 완료되면 로봇이 qPCR 기계에서 플레이트를 수집하고 폐기 도크에 배치해야합니다. 증폭을 완료한 후 qPCR 소프트웨어를 엽니다. Navigator 탭에서 플레이트에 대해 저장된 반응 실험 파일을 엽니다.다음으로 새 분석 만들기 창을 열고 2차 파생 최대 값 메서드에 적합한 설정을 선택합니다. 그런 다음 필터 빗을 선택하고 STAT6에 대해 수집된 데이터가 선택되었는지 확인합니다. 적절한 색상 보정을 선택합니다.계산을 클릭한 다음 파일을 저장한 다음 클릭합니다. 맞춤 점 메서드를 사용하여 데이터를 분석하려면 새 분석 창 만들기를 열고 맞춤 점 메서드에 적합한 설정을 선택합니다. 그런 다음 STAT6에 대한 올바른 필터 및 색상 보정을 선택합니다.노이즈 밴드를 설정하여 배경 노이즈를 제외합니다. 이 후에는 분석 탭을 열고 적합 점을 세 가지로 설정하고 맞춤 점수 표시를 선택합니다. KIR 유전자에 맞는 점 및 2차 유도체 분석을 위한 적절한 설정으로 변경 사항을 저장하고 단계를 반복합니다.qPCR 소프트웨어에서 네비게이터 탭을 열고 결과 일괄 내보내기를 선택합니다. 그런 다음 실험 파일이 포함된 폴더를 열고 창의 오른쪽으로 전송합니다. 다음을 클릭하고 내보내기 파일의 이름과 위치를 선택합니다.이 후 관심 의 분석 유형을 선택하고 다음을 클릭합니다. 다음을 클릭하여 내보내기 프로세스를 시작하기 전에 파일 이름, 내보내기 폴더 및 분석 유형이 올바른지 확인합니다. 내보내기 상태가 확인으로 변경되면 화면이 자동으로 다음 단계로 이동합니다.선택한 모든 파일이 성공적으로 내보내고 완료를 클릭했는지 확인합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 스크립트를 사용하여 내보낸 플레이트를 개별 반응으로 분할하고 파일을 복사 번호 분석 소프트웨어에서 읽을 수 있는 소프트웨어로 변환합니다. 그런 다음 복사 번호 분석 소프트웨어를 열고 실시간 PCR 결과 파일 가져오기를 선택하여 스크립트에서 만든 텍스트 파일을 로드합니다.마지막으로 가장 빈번한 샘플 복사 번호를 선택하여 분석 을 선택하고 분석을 수행합니다. 이 프로토콜에서 반자동 타이핑 또는 qKAT은 숫자 유형 KIR 유전자를 복사하는 데 사용되었습니다. KIR2DL4의 가장 빈번한 복사본 번호는 두 복사본이었고 KIR3DS1의 가장 빈번한 복사본 번호는 0이었습니다.이 절차를 시도하는 동안 DNA가 정확하게 정량화되었는지 확인하고 얼음의 모든 단계를 수행하고 시약이 빛에서 덮여 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. KIR 유전자에 대한 알려진 LD 규칙을 준수하지 않는 샘플에 대한 원시 데이터에 대한 철저한 검사를 수행하는 것도 중요합니다. 이 절차에 따라, 시퀀싱과 같은 다른 방법은 융합 유전자의 존재 또는 새로운 항제의 식별과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.개발 후, 이 방법은 면역 유전학 분야의 연구원들이 NK 세포 생물학, 질병 내성 및 인간 생식에서 KIR의 역할을 탐구할 수있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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