Name: VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 혈소판을 이용한 산화질소 고감도 검출 방법을 통해 P-VASP 인산화 측정 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 생체 내외에서 혈액 내 산화질소를 효과적으로 탐지하는 혁신적인 연구 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NIH 교내 그랜트 박사 앨런 북 아 Schechter에 의해 투자 되었다.

참고: NIH 혈액 은행에서 혈액 샘플을 가져온 (IRB 승인 프로토콜: 99-CC-0168).
1. 혈액 샘플 준비
참고: 혈소판 활성화를 방지 하려면 혈액 천천히 그리고 부드럽게 시트르산 반전 튜브 여러 번에 의해 혼합.
<ol><li>
혈소판이 풍부한 혈장 (PRP) 준비
	<ol>
<li>20 G 또는 더 큰 직경 바늘을 사용 하 여 혈액의 30-50 mL 그리고 나트륨 구 연산 염 (3.8%)는 1:9 비율 또는 산 성 구 연산 염 포도 당 (ACD) (85mm trisodium 시트르산, 66.6 m m 구 연산, 111 mM 포도 당, pH 4.5) 1: 6의 비율에 포함 된 튜브에 추가.</li>
		<li>빈 15 mL 원뿔 튜브로 갓 수집 된 전체 혈액 5 mL aliquot. 실 온에서 10 분 동안 120 x g 에서 전체 혈액 원심</li>
		<li>조심 스럽게 플라스틱 전송 피 펫으로 상단 부분에서 혈소판 (혈소판이 풍부한 혈장, PRP)를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다. 참고: 1.1.3 단계에서 PRP는 실험에 사용 하기 위해 준비 또는 준비에 추가 처리를 위해 혈소판을 세척. 세척된 적혈구 (RBC)를 정화 하 고 원심 (1.1.2 단계) 적혈구와 백혈구를 포함 하 고 더 일 수 있다 후 얻은 부드러운 펠 릿-1.3 단계. 를 참조 하십시오 실험은 혈액을 그리기 후 2 시간 이내 완료 될 필요가 있다. PRP (표면에 뜨는) 수집, PRP/RBC 인터페이스에 축적 된 버 피 코트 포함 된 백혈구의 컬렉션을 하지 않도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
씻어 혈소판 준비 (옵션)
	<ol>
<li>원심 분리기는 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g 에서 PRP를 수집. 삭제는 상쾌한 고 혈소판 펠 릿을 유지.</li>
		<li>부드럽게 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g 에서 CGS 버퍼 (120 mM NaCl, 12.9 m m trisodium 시트르산과 30 mM 포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 5 mL을 추가 하 여 펠 릿을 세척.</li>
		<li>수정 된 Tyrode 버퍼 (134 m m NaCl, 0.34 m m NaH2포4, 2.9 m m KCl, 12 m m NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2mm CaCl2, 10 m m 포도 당 pH 7.4) 3 mL와 혈소판 펠 릿 resuspend</li>
		<li>혈소판을 희석 (1: 100-예를 들어, 리스 Ecker 솔루션의 990 µ L에서 혈소판의 10 µ L) 리스 Ecker 솔루션 및 hemocytometer 여 수.</li>
		<li>Tyrode 버퍼를 추가 하 여 3 x 108 셀/mL에 혈소판의 밀도 조정 합니다.</li>
		<li>실험을 시작 하기 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 혈소판 정지를 품 어. 참고: 씻어 혈소판은 5-8 h 37 ° c.에 대 한 안정적인</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세척된 적혈구 (RBC)의 준비
	<ol>
<li>컬렉션, 후 실 온에서 10 분 동안 2500 x g 에 1.1.3 단계에서 얻은 부드러운 펠 릿 원심.</li>
		<li>상쾌한 무시 하 고 실 온에서 10 분 동안 2500 x g 에서 원심 분리 하 여 PBS의 5 mL와 RBC 펠 릿을 세척. 3 번이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>PBS를 삭제 하 고 씻어 RBCs를 사용 하 여 추가 실험을 위해.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. deoxygenation
<ol><li>PRP의 혼합물의 1 mL을 추가 (준비 단계 1.1.4에서에서. 또는 1.2.4.) 및 폴 리 프로필 렌 병 고무 마 개와 함께 폐쇄에 원하는 (1.3 단계에서에서 준비.) Rbc. 예를 들어 20%가에서 Rbc의 200 µ L PRP의 800 µ L를 추가 합니다. 참고: 제안 hematocrits는 0%에서 최대 40%까지. 혈소판 유리 표면에 고착으로 유리병 이나 플라스 크를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>닫힌된 병으로 헬륨 가스 탱크에 연결 하는 바늘을 삽입 하 고 26 G 바늘 (그림 1)를 삽입 하 여 가스 콘센트를 확인.</li>
	<li>천천히 병을 실 온에서 소용돌이 친다. 참고: 혈액 준비를 통해 거품을 그 가스를 허용 하지 않습니다. 느린 가스 흐름은이 절차를 그리고 증가 혈 지나치게 빠른 그 가스 흐름 리드. 그것은 매우 실험적인 체제의 형상에 따라 가장 효율적인 가스 흐름은 재판에 의해 결정 될 필요가 있다.</li>
	<li>정기적으로 공동 산소 농도계를 사용 하 여 부분적인 산소 압력 (포2)를 측정 하 여 deoxygenation 프로세스를 따릅니다. 참고: 우리의 손에서 deoxygenation 감소 포2 아 질산염 감소 Rbc. deoxygenation 계속 필요한 25 mmHg의 10 분 않았다 더 줄일 포2 10 mmHg; 그러나, 그것은 증가 혈을 증가 셀 무료 헤모글로빈 (그림 2)에 이르렀다.</li>
</ol>3. 적혈구 아 질산염 감소
<ol><li>나노2 아 질산염의 500 m m 재고 솔루션의 0.0345 g으로 1 mL의 PBS (pH 7.4)을 추가 합니다. PBS (pH 7.4)에 직렬 희석 하 여 500 m m 나노2 250 µ M 나노2 (25 x)을 희석.</li>
	<li>microsyringe을 사용 하 여, 샘플의 총 1 mL에 10 µ M의 최종 농도 달성 하기 위해 PRP와 Rbc deoxygenated 샘플으로 심장 통해 질산염 (40 µ L) 주사. 참고: 이 실험에서 사용 하는 아 질산염의 최종 농도 10 µ M입니다.</li>
	<li>37 ° C 10 분 이상에서 샘플을 품 어. 참고: 아 질산염 최대 아 질산염 감소 실험의 다른 유형에 대 한 필요와 RBC 외피의 정확한 기간을 조정 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브에 스 토퍼와 피 펫 샘플의 1 mL를 제거 합니다.</li>
	<li>실 온에서 3 분 200 x g 에서 원심.</li>
	<li>플라스틱은 상쾌한의 상단 부분에서 혈소판의 서 스 펜 션의 300 µ L 고 ACD (pH 6.5) 1:9 비율로 혼합. RBC 펠 릿을 삭제 합니다.</li>
	<li>실 온에서 4 분 동안 500 x g 에서 혈소판 정지 원심</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 세포의 용 해 버퍼 (150 m m NaCl, 50 mM Tris, 0.5 %NP-40, pH 7.4)의 80 µ L 추가 펠 릿 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 혈소판에 칵테일 III (1: 500).</li>
</ol>4. 서 부 럽 VASP의
<ol><li>각 샘플의 단백질의 15 µ g 2 별도 10 %SDS-PAGE 젤에 로드 합니다. 참고: B-mercaptoethanol을 포함, 가혹한 스트립 버퍼 막;에서 P-VASPSer239 와 VASP 항 체를 제거할 수 없습니다. 따라서, P-VASP Ser239 와 VASP 실행 되어야 합니다 별도로.</li>
	<li>니트로 막에 120 V 1.30 h와 전송에는 젤을 실행 합니다.</li>
	<li>블록 비 특정 바인딩 5% 비 지방 건조 우유와 함께.</li>
	<li>4 ° c.에 하룻밤을 위해 P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000)와 GAPDH (1:1, 000) 멤브레인을 품 어</li>
	<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 실 온에서 45 분 막으로 이차 항 체를 품 어.</li>
	<li>영상 기계 막 하 고 계량 ImageJ를 사용 하 여 밴드 밀도.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li>
<li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li>
<li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435(2014).</li>
<li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380(2012).</li>
<li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li>
<li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li>
<li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li>
<li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+%28P-VASPSer239%29+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).</li>
<li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs%3A+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li>
<li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letter%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li>
</ol>

박사 앨런 Schechter는 심혈 관 질환의 치료에 대 한 아 질산염 소금의 사용에 대 한 건강의 국가 학회에 여러 특허에 대 한 공동 발명가로 나열 됩니다. 그는 NIH 임상 개발에 대 한 이러한 특허 하지만 다른 보상의 라이선스에 따라 로열티를 받는다.

혈소판은 쉽게 활성화 하 고, 이후 부드러운 처리 포함 하는 혈소판의 샘플은 필요. 빠른 pipetting 및 활기찬 동요는 피해 야 한다. Prostacyclin (PGI2) 같은 혈소판 억제제는 혈소판 활성화;을 방지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나,이 혈소판 내의 일부 신호 경로 영향을 수 있습니다. 혈소판 펠 릿의 준비에 대 한 우리 혈소판 정지에 ACD를 추가 하 고 낮은 속도 원심 분리를 사용 하 여.
PRP에 갓된 혈소판, 최대 2 시간에 걸쳐 제한 된 생활을 했습니다. 높은 재현성을 달성 하기 위해 모든 실험 할 수만 신선한 혈소판 및 2 시간 이내 혈 후. 표시 데이터는 씻어 혈소판 보다 더 생리 적인 것으로 간주 됩니다 PRP의 혈소판으로 획득 했다. 수명 및 순도 씻어 혈소판 증가, 비록 씻어 혈소판의 준비 하는 동안 반복된 원심 그들의 자발적인 활성화를 이어질 수 있습니다 그리고이 혈소판 준비의 일관성 없는 품질에서 발생할 수 있습...

혈소판은 혈액 응고에 대 한 중요 한 없으며에서 파생 된 작은 디스크 모양의 세포 조각. 응고 폭포는 혈관 벽의 부상 이후에 출시 된 (콜라겐 또는 ADP) 등 다양 한 생리 활성 분자에 의해 시작 됩니다. 혈액 응고 과정 중 산화 질소 (NO)에 의해 다양 한 이펙터, 수정할 수 있습니다. 아니, 자연스럽 게 포유류 세포에 의해 생산, 가장 다재 다능 한 생리 신호 중 하나입니다. 그것은 강력한 vasodilator, 신경 전달 물질 및 많은 기능 몇 가지 이름을 면역 변조기 역할. 혈 류에서 더 또한 혈소판을 억제 함으로써 혈액 응고의 정도 조절 하기 위해 도움이 됩니다. 혈 류에서의 가장 가능성이 소스 중 하나입니다 아 질산염, 무기 이온의 선구자 역할을 표시 되었습니다. 적혈구 (Rbc)와 반응, 아 질산염 NO로 감소 되 고 deoxyHb 산화 methemoglobin (metHb)1. Rbc에서 발표 없음 vasoactive 이며 원인 vasorelaxation2. 이 아 질산염 감소 통로 이며 대체 아무 세대 통로와 함께 행동 내 피 산화 질소 synthase hypoxic 조건에 의해 생성 경로가 고아 한 보완.
스스로 혈소판 없음에 아 질산염을 줄일 수 있지만 그것의 존재에 매우 민감합니다. 그대로 혈소판에서 더는 nanomolar 범위 증가 cGMP (EC50 = 10 nM)와 VASP의 인 산화 (EC50 = 0.5 nM)3. 따라서, 혈소판 Rbc와 혈액으로 없음 릴리스 아 질산염 감소의 우수한 센서 역할을 수 있습니다. 직접 혈소판 활성화-aggregometry 및 thromboelastography (TEG) 등의 정도 측정할 수 있는 여러 방법이 있다4,5. 그러나, 이러한 방법은 고가의 전문된 계측 및 오히려 많은 양의 자료 필요합니다. 그것은 또한 이벤트를 모니터링할 수 다운스트림, 아니 후 출시 Rbc, 혈소판 표면 단백질 표정-P selectin6등의 변화를 사용 하 여에서. 아니 혈소판7에서 cGMP의 양을 증가 알려져 있다. 이전에 우리는 deoxygenated RBC8아 질산염 감소 후 혈액으로 없음 릴리스를 모니터링 하려면 cGMP를 사용. 이 매우 민감한 방법; 판명 그러나, cGMP 짧은 분자 이며 그 탐지 포함 광범위 한 노동. 제시 프로토콜에서 설명 하는 또 다른 가능성, vasodilator 자극 인 (VASP)의 인 산화를 사용 하 여-단백질 혈액에의 존재를 감지. VASP은 sGC/cGMP 통로9없이 상호 작용에 phosphorylated 단백질 키 니 아 제 G 활성화의 기판입니다. 매우 낮은 전혀 감지 VASP 인 산화 발생 농도, 혈액에서 혈소판 없음 존재의 매우 민감한 검출기 만들 수 있는. VASP는 높은 혈소판, 표현 하지만 하지 다른 혈액 세포에서는 선택적으로 혈소판10를 포함 하는 이벤트에 따라 있습니다.
이 프로토콜의 주요 목표는 VASP 인 산화11,12를 모니터링 하 여 혈소판와의 상호 작용을 사용 하 여 전체 혈액에 없는 자료의 검색에 대 한 세부 사항에 있는 메서드를 설명 하는. 설명된 메서드를 수 있습니다 낮은의 조기 발견 아무 농도를-이론적으로 현재 프로토콜 기술의 표준 서쪽 오 점 달성 대부분 실험실에서 사용 cGMP 결정 보다 더 민감한 nanomolar 범위에 설정.

<table><tbody><tr><td>NIH 혈액 은행</td><td></td><td></td>에 의한 <td>Tri-sodium citrate</td></tr><tr><td>구연산</td><td>NIH 혈액 은행</td><td></td><td></td>에 의한 구연산 공급</tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl; 염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S-7653 1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4; 인산나트륨 monobasic, monohydrate</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl; 염화칼</td>륨 <td>Mallinckrodt Chemical</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3; 중탄산나트륨</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES; N- [2- 하이드 록시 에틸] 피페 라진 -N'- [-에탄 술폰산]</td> <td>시그마</td><td>H3375-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M); 염화 마그네슘</td><td>품질 생물학</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2; 염화 칼슘</td><td>시그마</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 좁은 입 HDPE 이코노미 병</td><td>Nalgene</td><td>2089-0001</td><td></td></tr><tr><td>Red septum 스토퍼 NO.29</td><td>Fisherbrand</td><td>FB57877</td><td></td></tr><tr><td>NaNO2-; 아질산나트륨</td><td>시그마</td><td>S2252-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIZMA 베이스; 트리스 [하이드 록시 메틸] 아미노 메탄</td><td>시그마</td><td>T8524-250G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4- 노닐 페닐 폴리에틸렌 글리콜</td><td>시그마</td><td>74385-1L</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 세트 III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-VASP (Ser239)</td><td>항체 세포 신호 기술</td><td>3114</td><td></td></tr><tr><td>VASP 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>3112</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) 토끼 mAb</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M-6250-10ml</td><td></td></tr><tr><td>과산화효소 Affini순수 염소 안티 토끼 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060-200ml</td><td></td></tr><tr><td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td><td>복사계</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasp 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

혈소판은 혈액 구성 요소를 적절 한 혈액 응고에 대 한 책임. 그들의 기능은 매우 다양 한 경로 의해 통제 된다. 하나는 가장 강력한 vasoactive 에이전트, 산화 질소 (NO), 또한 혈소판의 강력한 억제제로 작동할 수 있다. 직접 혈액에서 감지 되지 않습니다 아무 반감기 밀리초 범위를 제한 하는 셀 무료 헤모글로빈으로 그것의 높은 반응성 때문에 매우 도전 이다. 현재, 변경 개입 추정만 후 아 질산염과 질산염 (질 산-아 질산염-아니 신진 대사 통로의 구성원)의 측정된 변화 기반. 그러나 정확한이 측정은 해석 대 실제 변경, 때문에 자연스럽 게 높은 기준선 아 질산염 및 질 산 몇 배나 더 자체의 변화를 예상된 보다 높은 수준에 오히려 어렵다. 따라서, 아니오를 직접 검출 할 수 것이 직접적이 고 간단한 방법의 개발은 오래전. 이 프로토콜 주소 혈액에 아무 센서로 매우 민감한 혈소판의 잠재적인 사용 합니다. 그것은 아무 생성기로 초기 혈소판 풍부 혈장 (PRP)와 씻어 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다. VASP의 인 산화는 떠들고 239 (P-VASPSer239)에서 번호의 존재를 감지 하는 사실 VASP 단백질 높은 혈소판 표현 된 존재 하는 때 아니 그것 빠르게 phosphorylated이 통로 사용 하 여 직접 혈액에 아무 존재를 감지 하는 독특한 기회에 지도 한다.

정 맥 혈액 샘플 50-80 mmHg 사이 포2 값을 가질. 헬륨에 의해 deoxygenation는 급속 하 게 포2 10 분 증가 deoxygenation 시간 약간 더 감소 포2이내 25 mmHg 감소합니다. 그러나, deoxygenation의 시간을 증가 또한 셀 무료 헤모글로빈 (시각적으로 플라즈마의 점점 붉은 채색으로 그림 2 에서 본 공동 속도도 결정)의 크게 증가 수준에 연결 (그림 2A-B). 증가 된 혈은 감동 감동 deoxygenation 없이 혈 (그림 2C)을 유도 하지 않습니다 때문에 연관 된다.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

여기, 우리 혈액에 산화 질소 매우 민감한 센서로 혈소판의 잠재적인 사용을 해결 하기 위해 프로토콜을 제시. 그것은 산화 질소 생성기로 초기 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다.

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

이 프로토콜은 혈소판의 잠재적 사용을 혈액 내의 시험관 내 및 생체 내 모두에서 매우 민감한 산화 질소 센서로 다룹니다. 혈소판 산화질소의 인포이성 혈관 확장제-자극인 계포단백질 또는 P-VASP 세린(239)은 나노몰라 계보에서 산화질소의 존재를 검출하는 기능을 포함하여 몇 가지 장점이 있다. 건강한 기증자로부터 30~50밀리리터의 전혈을 수집한 후 2시간 이내에, 원심분리를 위해 15밀리리터 원추형 튜브의 적절한 수에 혈액의 5밀리리터 알리쿼트를 추가합니다.플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 슈퍼나티의 상부에서 혈소판이 풍부한 플라즈마를 조심스럽게 수집합니다. 두 번째 원심분리로 플라즈마가 풍부한 혈소판을 펠렛과 부드럽게 CGS 버퍼의 다섯 밀리리터에 펠릿을 세척. 상온에서 10 분 동안 400g의 원심 분리기.원심분리가 끝나면 수정된 티로드 버퍼의 3밀리리터로 펠릿을 재차한다. 혈류계를 사용하여 혈소판 서스펜션의 밀도를 신선한 티로드 버퍼에서 밀리리터당 8번째 세포로 3배 10으로 계산하고 조정한다. 그런 다음 혈소판 서스펜션을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.한편, 전체 혈액 샘플의 플레이트 프리 플라즈마 층에서 적혈구를 수집한 다음 세척당 PBS 5밀리리터에서 4개의 세척을 한다. 마지막 세척 후, 슈퍼 나츠제를 버리고 고무 스토퍼로 닫혀 폴리 프로필렌 병에 적절한 실험 적혈구에 플라즈마가 풍부한 혈소판의 1 밀리리터와 적혈구를 혼합. 각 격막에 헬륨 가스 탱크에 연결된 바늘을 삽입하고 가스 배출을 만들기 위해 26 게이지 바늘을 삽입합니다.그런 다음 천천히 실온에서 병을 소용돌이고 산화계를 사용하여 탈산소 공정을 모니터링하기 위한 부분 산소 압력을 측정합니다. 산소 감소속도는 헬륨 유량및 교반 속도에 따라 달라집니다. 따라서 실험 시작 전에 산소화 시간을 최적화해야 하므로 실험 설정의 형상에 크게 의존해야 한다.적혈구 아질산염 감소를 위해, 10 마이크로몰라 최종 농도가 달성되도록 중격을 통해 아질산염을 주입하여 PRP 및 RbC의 탈산소 샘플에 아질산염을 주입하십시오. 샘플을 섭씨 37도에서 최소 10분 동안 배양하고 각 샘플의 1밀리리터를 원심분리기를 위한 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 300 마이크로리터의 혈소판 현탁액을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 1~9비율로 각 튜브에 산성 구연산 덱스트로스를 첨가한다.혈소판을 다시 원심분리하고 각 튜브에 3개의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 얼음 냉용 리시스 완충제 80마이크로리터에서 펠릿을 재분리한다. 다음으로, 각 샘플에서 15 마이크로그램의 단백질을 별도의 10%SDS-PAGE 젤 2개로 로드합니다. 젤을 1.3시간 동안 120볼트에서 실행합니다.실행의 끝에서, 개별 아산화 질소 셀룰로오스 막에 젤을 전송하고 5 % 비지방 건조 우유의 적절한 부피와 비특이적 결합을 차단합니다. 적절한 1 차 항체와 함께 멤브레인을 4섭씨에서 하룻밤 동안 배양한 다음 실온에서 45 분 동안 적절한 이차 말 무 과산화항체로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 적절한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 밴드 밀도를 정량화하기 위해 이미저로 멤브레인을 노출합니다.건강한 정맥 혈액 샘플은 수은의 50 ~80 밀리미터 사이의 부분 산소 압력 값을 갖는다. 헬륨에 의한 탈옥은 산소의 부분 압력을 10분 이내에 25밀리미터의 수은으로 빠르게 감소시다. 부분 산소 압력의 추가 감소는 증가 된 탈산소 시간으로 달성 될 수있다.증가 된 탈산소는 점점 적색 플라즈마에 의해 표시된 바와 같이 용혈의 증가 수준으로 이어집니다. 이것은 탈산소의 효과이며 헬륨없이 교반 된 샘플에서 용혈의 부족으로 표시된 대로 교반하여 발생하지 않습니다. 혈관 확장제-자극 인포프로틴 또는 VASP 및 포스포리드-VASP 발현 수준은 서부 블롯에 의해 검출된 바와 같이 산소분해된 시료에서 혈소판에서 혈소판의 혈소판에서 의 혈소판에서 의증가와 함께 감소하였다.단명한 산화질소 기증자를 가진 처리는 처리의 10 초 안에 혈소판에 있는 인광질 혈관 확장제 자극인 자극인 인단 발현을 증가합니다. 또한, 인포리드-VASP 또는 P-VASP의 수준은 기존의 P-VASP 수준에 영향을 주지 않고 혈소판에서 RbC를 분리하기에 충분한 시간이 있음을 나타내는 혈소판이 풍부한 혈장으로 NO 기증자의 인큐베이션 후 최대 10분까지 안정적으로 유지되었다. 아질라이트는 또한 산소가 많은 RbC의 존재에서 혈소판의 P-VASP 수준을 증가시킵니다.여기서 총 VASP에 대한 P-VASP의 비율은 헤마토크릿의 수준에 따라 다릅니다. VASP는 혈소판에서 높게 발현되고 산화질소의 존재에서 급속하게 인포화된다. 따라서, 본 프로토콜은 다양한 생리자극에 의한 산화질소의 유도를 연구하는 방법을 제공한다.이 방법을 통해, 우리는 성공적으로 생체 내에서 흡입 아질산염에 의해 산화 질소 자극의 마커로 혈소판에서 증가 P-VASP를 사용했다. 생물학적 표본을 가진 혈소판으로 일하는 것은 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행되어야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

내피 기능을 평가하기위한 비침 투 절차는 엔도 - PAT 2000을 사용하는 증명이다.

엔도 - PAT 2000 내피 Vasodilator 기능을 평가

질소 산화물 (NO)의 내생적인 생산은 생물 학적 기능의 다양한 조절. 그것은 어떠한 기반 시그널링의 장애 또는 dysregulation이 많은 사람이 질병에 연루되어 있는지 점점 더 분명 해지고 있습니다. 메소드는 더 이상 metabolites 인간 질병에 대한 소설 진단 또는 전조 생체 자료를 제공할 수 없습니다 관련된 계량합니다.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다.  여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.

적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출

우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.

인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출

과산화물 음이온의 생성은 혈소판의 자극에 필수적이며, 조절이 잘 되지 않는 경우 혈전성 질환에 매우 중요합니다. 여기에서는 과산화물 음이온의 선택적 검출과 산화 환원 의존성 혈소판 조절 연구를 위한 세 가지 프로토콜을 제시합니다.

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법 

조정 가능한 밀도를 가진 RGD 기능화된 avidin-biotin tethers를 사용하여 단일 이동 혈소판을 이미징하기 위한 자세한 프로토콜이 제공되어 혈소판이 avidin-biotin 결합을 파열하기에 충분한 힘을 생성한다는 것을 밝혔습니다.

RGD 기능성 Avidin-Biotin 테더를 사용한 혈소판 이동을 연구하기 위한 In vitro 분석

프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

이 프로토콜은 동시적이고 시간 측정된 트롬빈과 플라스민 생성을 가능하게 하여 응고와 섬유소용해를 통합적으로 평가할 수 있는 나이메헌 혈류 측정법을 설명합니다. 이 검사는 기존 정혈성 검사의 범위를 넘어 연구 및 임상 환경에서 정혈 균형의 특성 규명을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

나이메헌 혈류 분석 분석: 단일 웰에서 트롬빈과 플라스민 생성의 동시 형광 생성 측정

학습하세요 혈소판을 이용한 산화질소 고감도 검출 방법을 통해 P-VASP 인산화 측정 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 생체 내외에서 혈액 내 산화질소를 효과적으로 탐지하는 혁신적인 연구 도구를 제공합니다.

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

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