Name: 미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 배우세요 hiPSC-ECs에서 백혈구 접착을 평가하는 미세유체칩 기반 프로토콜을 통해 혈관 염증 반응을 실시간으로 분석하는 방법을 익히세요.

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저자는 다음 보조금을 인정 하 고 싶습니다: 유럽 연구 위원회 (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); 네덜란드 기관-온-칩 이니셔티브, 교육, 문화 및 과학 네덜란드 (024.003.001)의 정부에 의해 투자 하는 NWO 중력 프로젝트.

1입니다. 솔루션 및 시 약의 준비
<ol><li>혈소판 가난한 플라스마 파생 된 혈 청 (1%), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF, 20 ng/mL) 및 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF, 50 ng/mL)을 인간의 Endothelial-SFM (참조 테이블의 추가 하 여 완전 한 인간의 Endothelial SFM 매체 (EC SFM 전체)를 준비 재료). 매체는 0.22 μ m 기 공 필터를 통해 필터링 하 고 최대 2 주까지 4 ° C에서 그것을 저장.</li>
	<li>소 태아 혈 청 (10%)를 추가 하 여 완전 한 RPMI 매체를 준비 2-mercaptoethanol (0.05 nM), L-글루타민 (1%), 페니실린 스 (25 U/mL) RPMI 매체 ( 재료의 표참조). 4 ° C에서 최대 3 주 동안 저장 합니다.</li>
</ol>2. 코팅의 미세 칩
<ol><li>10 cm 멸 균 페 트리 접시에 무 균 바이오를 놓습니다.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 없이 캘리포니아2 +/Mg2 + 를 50 µ g/mL의 최종 농도에 재고 솔루션을 재구성 하 여 fibronectin 작업 솔루션을 준비 합니다. 바이오 칩 당 작업 솔루션의 80 µ L을 추정 합니다.</li>
	<li>바이오 칩의 각 채널에 fibronectin 작업 솔루션의 10 µ L를 주사. 한 피 펫을 사용 하 여 작은 10 µ L 팁 그리고 채널 입구와 피 펫 팁 (그림 1C, 왼쪽) 사이의 긴밀 접촉을 형성 해야 합니다.</li>
	<li>포함 하는 바이오 페 트리 접시의 뚜껑을 닫고 습도 챔버 (그림 2B)에 배치 합니다. 밤새 4 ° C에서 챔버를 저장 합니다. 챔버 축이다, 습도 챔버의 바닥에 깨끗 한 휴지를 배치 하 고 살 균 H2o.의 5 mL을 추가</li>
	<li>다음 날, 분석 결과, 전에 미리 인큐베이터에서 37 ° C에서 바이오 따뜻한.</li>
</ol>3입니다. hiPSC-ECs의 준비
참고: 여기에 설명 된 프로토콜에서 hiPSC-ECs 분화, 정화, cryopreserved 이었고 앞서 설명한8로 해 동.
<ol><li>눈 녹은 물 및 플레이트 hiPSC-ECs 한 0.1% 젤라틴 코팅 T75 플라스 크, 3 ~ 4 일 사전 분석 결과에 완전 한 EC SFM 전체에.</li>
	<li>분석 결과, 이전 밤 EC SFM 전체 10 ng/mL TNFα 보충을 추가 하 여 TNFα와 hiPSC-ECs를 자극 하 고 품 어 앞에서 설명한 737 ° C에서 하룻밤 (h ~ 12).</li>
</ol>4. hiPSC-ECs 분리와 미세 칩에 시드
<ol><li>분석 결과의 날, 인큐베이터에서 hiPSC-ECs의 플라스 크를 걸릴 하 고 현미경 세포를 검사 하십시오. HiPSC-ECs는 80-100% 합칠 전형적인 EC와 같은 형태를가지고 확인 하십시오.</li>
	<li>셀 문화 후드에 플라스 크를 전송 합니다.</li>
	<li>HiPSC-ECs의 플라스 크에서 중간 발음</li>
	<li>짧게 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 10 mL를 추가 하 여 셀 문화를 씻어. PBS 발음</li>
	<li>1 x 분리 효소의 플라스 크 당 4 mL를 추가 합니다. 실 온 (RT) (그림 1B)에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>플라스 크 당 인간의 Endothelial SFM 매체의 8 mL을 추가 하 여 분리 반응을 중지 합니다. 부드럽게 분리 하 고 5 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브에 hiPSC-ECs 정지를 수집 합니다.</li>
	<li>현 탁 액에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다.</li>
	<li>실시간에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심</li>
	<li>발음은 상쾌한 고 107 셀/mL x 1.5의 최종 농도에 EC SFM 전체에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>인큐베이터에서 바이오와 페 트리 접시를 꺼내와 셀 문화 후드에 그것을 전송.</li>
	<li>미세 칩의 모든 채널에서 fibronectin 솔루션 발음</li>
	<li>작은 10 µ L 팁 (그림 1C, 중간)는 피 펫을 사용 하 여 각 채널에 세포 현 탁 액의 6 µ L를 삽입할. 세포 현 탁 액 주입의 앞에 잘 혼합 되어 있는지 확인 하 고 셀 강수량을 피하십시오.</li>
	<li>바이오 현미경 검사와 세포는 균일 하 게 배포 하 고 셀 밀도 높다 (그림 2C).</li>
	<li>37 ° c.에 15 분 동안 바이오 칩을 품 어</li>
	<li>각 채널의 양쪽에서 중간 저수지로의 EC SFM 전체 40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C (그림 1C, 오른쪽)에서 1 시간에 대 한 바이오를 품 어.</li>
	<li>각 채널의 양쪽에서 저수지로 EC SFM 전체의 또 다른 50 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>5입니다. 인간 백혈구의 준비
참고: 여기에 설명 된 프로토콜에서 상용 monocytic 셀 라인 (THP-1) 사용 되었다. 또는 주변 혈액 단 세포 또는 호 중구를 사용할 수 있습니다. 말 초 혈액에 monocytes 그리고 호 중구의 격리 표준 절차11를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 셀 문화 후드에이 단락에 설명 된 모든 단계를 수행 합니다.
<ol><li>50 mL 원뿔 튜브에 백혈구를 수집 합니다.</li>
	<li>없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 10 mL와 함께 백혈구를 씻어. RT (그림 1D)에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 셀 원심</li>
	<li>상쾌한 발음 및 DiOC6 염료와 PBS의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend (ex λ = 485 nm, λem 501 = nm) (1:5, 000). 실시간에서 10 분 동안 어둠 속에서 셀을 품 어</li>
	<li>없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 10 mL와 함께 백혈구를 씻어. 원심 실시간 반복 세척 단계에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 셀 한 번 더.</li>
	<li>현 탁 액에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다.</li>
	<li>발음은 상쾌한 고 2.5 x 106 셀/mL의 최종 농도에 완전 한 RPMI 중간에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>6입니다. 미세 펌프의 준비
<ol><li>8 채널 매니폴드와 미세 펌프를 조립 한다.</li>
	<li>펌프 설치 운영 소프트웨어를 PC에 연결 합니다.</li>
	<li>미세 소프트웨어를 시작 하 고 개방형 프로토콜 을 클릭 하 여 프로토콜을 로드할 미세 프로토콜을 선택 하려면 PC에 이동.</li>
	<li>설치 폴더를 선택 하 고 분석 결과 단계 실행을 클릭 하 여 소프트웨어와 펌프를 연결 합니다.</li>
	<li>올바른 흐름 속도 제어에 대 한 채널의 형상을 정의: 형상을 설치 폴더에 업데이트 형상 을 선택 하 고 분석 결과 단계 실행을 클릭 합니다. 참고: 주사기와 사용할 채널 형상 정보 일치 하는지 확인 (형상 ID = 1, 채널 수 = 8, 채널 폭 800.0 µ m, 채널 깊이 = 120.0 µ m, 주사기 볼륨 = = 250 µ L)와 샘플의 점도 (액체 점도 = 1.0).</li>
	<li>80%의 에탄올을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 유입 케이블 (오렌지)를 배치 하 여 펌프를 씻어. 50 mL 원뿔 빈 관 (폐기물 컨테이너)에서 콘센트 케이블 (녹색)를 배치 합니다.</li>
	<li>희미하게/펌프 희미하게 폴더 선택 하 고 분석 결과 단계 실행 을 클릭 합니다 (볼륨을 씻어 2000 µ L, 세척 볼륨 단계 = 250 µ L, 희미하게 방향 = = 출력). 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>단계 (6.6-6.7) 인간의 Endothelial SFM 문화 매체와 셀 문화 학년 물, 세척 펌프를 반복 합니다.</li>
	<li>매니폴드의 세척 단계로 진행 합니다.</li>
	<li>수동으로 올바른 위치 (표시 OFF 는 왼쪽 설정 되어)에 3 방향 어댑터를 배치 하 여 주사기와 매니폴드 사이의 밸브를 엽니다.</li>
	<li>희미하게/매니폴드 세척 폴더에서 설정 전류 채널/오픈 단계를 선택 하 고 모든 밸브 매니폴드의 열 분석 결과 단계 실행 을 클릭 합니다.</li>
	<li>뒤 셀 문화 학년 물 5 mL 주사기에서 80% 에탄올 5 mL를 눌러 수동으로 매니폴드를 씻어.</li>
	<li>인간의 Endothelial SFM 문화 매체의 5 mL 주사기에서 밀어 매니폴드를 씻어.</li>
	<li>매니폴드에 갇혀 있다 모든 큰 공기 방울을 제거 합니다. 이렇게 하려면 8 잘 핀 어댑터 10 cm는 매체와 페 트리 접시에 놓고 모든 큰 공기 방울 사라 때까지 주사기와 밀고/당기 수행 (작은 거품 문제 되지 않습니다).</li>
	<li>희미하게/매니폴드 세척 폴더에서 설정 전류 채널/닫기 단계를 선택 하 고를 닫습니다 모든 밸브 매니폴드의 분석 결과 단계 실행 을 클릭 합니다.</li>
	<li>매니폴드 어댑터에 펌프에서 녹색 콘센트 케이블을 연결 합니다.</li>
	<li>3-방향 밸브를 닫습니다 주사기 OFF 위치로 다시 전환 합니다.</li>
	<li>희미하게/케이블 희미하게 폴더를 선택 하 고 각 케이블에서 모든 거품 제거는 보장 RPMI 매체와 각 포트를 개별적으로, 세척을 실행 분석 결과 단계 클릭 (볼륨 분배 = 100 µ L). 참고: 각 밸브 매니폴드의 열린된 한--하나, 매체의 8, 그리고 100 μ 1은 적절 하 게 각 개별 채널을 통해 폐쇄 다른 채널을 유지 하는 동안. 액체 각 핀에서 실행 하는 것 다는 것을 확인 하십시오. 아무 액체 나오는 경우에, 공기 방울이 또는 한 덩어리의 표시입니다.</li>
</ol>7. 준비에 대 한 미세 칩의 라이브 영상
<ol><li>미세 설정 준비, 라이브 이미징 챔버는 37 ° C에 미리 equilibrated 그리고 CO2 의 수준에 도달 5% (그림 3A, B) 확인 합니다.</li>
	<li>바이오 인큐베이터에서가지고 고에 현미경 칩 홀더 위치. 이미징 단계 (그림 3C) 현미경에 칩 홀더를 탑재 합니다.</li>
	<li>매니폴드를 통해 펌프에는 바이오 칩을 연결 하기 위해 칩의 콘센트 저수지 주변 8-핀 어댑터를 배치 및 매체에서 모든 핀을 깊게 (하지만 완전히 연결 하지 마십시오).</li>
	<li>희미하게 선택 | 칩에 연결 폴더와 클릭 RPMI 칩을 연결 하기 전에 매체를 분배 하 실행 분석 단계 (볼륨 분배 30 mL =). 매체는 적절 하 게, 일단 8 핀 어댑터를 바이오 칩의 콘센트에 넣습니다. 참고: 이 단계 동안 모든 채널에 (개방)로 설정 되어 하 고 매체의 30 µ L 각 채널을 통해 적절 하 게이 채널 오프 (폐쇄)으로 설정 됩니다. 그러면 그 공기 거품이 미세 칩의 채널에 소개 될 것 이다.</li>
	<li>수동으로 매체를 피펫으로와 바이오 칩의 모든 입구 저수지에서 발음.</li>
	<li>희미하게 선택 | 희미하게 칩 폴더와 클릭 실행 분석 결과 단계 각 채널에서 죽은 세포/이물질 제거 하 한 채널을 통해 EC SFM 전체 매체의 40 mL perfuse (희미하게 볼륨 40 µ L, 최대 희미하게 전단 = = 40 다 인/cm2).</li>
</ol>8. 흐름 접착 분석 결과 및 이미지 수집
<ol><li>수동으로 매체는 피 펫에 대 한 관심의 채널의 입구 저수지에서 발음.</li>
	<li>관심의 채널의 입구 저수지에 단계 5.6에서 백혈구의 100 µ L를 추가 합니다. 참고: 부드럽게 세포를 단일 세포 현 탁 액을 혼합.</li>
	<li>셀 분석 결과에서 | 설명 단계 폴더, 설정 전류 채널/단계 설명 , 채널 목록에서 관심만 현재 채널 선택 및 설정 에 (오픈) 선택한 설정 다른 모든 7 채널 오프 (폐쇄).</li>
	<li>세포 분석 실험을 선택 | 설명 단계 폴더와 클릭 분석 결과 단계 실행. 참고: 그 5 분에 대 한 채널을 통해 입구 저수지에서 백혈구 정지를 지속적인 부정적인 압력 적용 변수 흐름 율 분배 확인 (세트 전단 = 상수, 전단 응력 =-0.5 다 인/cm2, 기간 = 00시 05분: 00, 스캔 지연 = 00시: 00). 전단 응력의 음수 값 흐름의 올바른 방향을 보장합니다.</li>
	<li>입구 저수지에서 나머지 백혈구 발음</li>
	<li>입구 저수지에 완전 한 RPMI 매체의 100 µ L를 추가 합니다. 셀 분석 결과/단계 설명 폴더 선택 하 고 모든 비 점착 백혈구에 밖으로 세척 하기 위하여 5 분 RPMI 매체와 채널을 perfuse를 분석 결과 단계 실행 클릭 (설정 전단 = 상수, 전단 응력 =-0.5 다 인/cm2, 기간 = 00: 05:00, 스캔 지연 = 00시: 00).</li>
	<li>적어도 3 ~ 4 (대표 지역 캡처되는지 확인) 하 준수 백혈구의 이미지를 채널의 다른 위치에서 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>채널의 모든 나머지의 기능 평가 위한 8.1-8.7 단계를 반복 합니다. 참고: 여러 개의 채널을 한 번에 실행 가능 하다. 이렇게 하려면 단계 8.3 동안 관심의 모든 채널을 엽니다. 그리고 관심의 여러 채널에 대 한 모든 전술 단계 8.4 –8.7을 수행.</li>
</ol>9. 분석 결과 완료 하 고 미세 펌프 청소
<ol><li>실험을 완료 한 후 수출 하 고 RAW 포맷으로 모든 이미지를 저장 합니다.</li>
	<li>결과 저장 하는 동안 미세 펌프 및 매니폴드 프로토콜을 청소를 실행 합니다.</li>
	<li>미세 펌프에 대 한 셀 문화 학년 물 4 mL perfusing에 의해 희미하게/펌프 희미하게 폴더를 먼저 실행 하는 방법, 80%의 4 mL 뒤 에탄올 6.6-6.7 단계에 설명 된 대로 몇 분 동안 공기를 실행 하 여 펌프 건조.</li>
	<li>매니폴드를 청소 하기 위해 주사기와 희미하게/매니폴드 세척 단계를 실행 합니다. 셀 문화 학년 물으로 주사기와 80% 에탄올으로 처음 단계 6.10-6.11 세척에 설명 및 다음 매니폴드 밸브를 열고 단계를 따릅니다. 주사기를 통해 공기를 밀어 매니폴드를 건조. 단계 6.10 및 6.15에 설명 된 대로 주사기 밸브와 매니폴드 밸브를 닫습니다.</li>
</ol>10. 부착 백혈구의 계산
<ol><li>다운로드 및 이미지 프로세싱 소프트웨어14 http://cellprofiler.org에서 설치. 참고: 이 연구에서 처리 하는 이미지 소프트웨어 버전 2.1.1 사용 하 여 수행 되었다. 최신 버전을 사용 하는 경우 파이프라인 부 적응이 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>파이프라인 Count_leukocytes.cpipe. 다운로드 파일을 클릭 | 가져오기 | 파이프라인 파일에서 Count_leukocytes.cpipe파이프라인을 선택 하는 PC에 이동.</li>
	<li>드래그-앤-드롭 입력 모듈에 파일 목록 창에 부착 백혈구의 인수 RAW 이미지와 폴더 | 이미지 분석에 대 한 섹션.</li>
	<li>분석 모듈을 통해 백혈구의 전형적인 크기 지정 | IdentifyPrimaryObjects. 부착 백혈구의 최소 및 최대 직경 픽셀 단위로 지정 합니다.</li>
	<li>분석 모듈을 통해 필터링 조건을 선택 | FilterObjects. 픽셀에서 개체의 최소 허용된 영역을 지정 합니다.</li>
	<li>분석 이미지 버튼을 눌러 분석을 시작 합니다. 참고: 모든 RAW 이미지 처리, 그리고 결과 기본 출력 폴더에 저장 됩니다. Image.txt 출력 파일에는 각 처리 이미지 (각 번호 하나의 이미지, 즉, 각 취득된 보기의 필드에 해당)에 부착 백혈구 수가 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 hiPSC EC 치료 프로-염증 성 자극, TNFα, hiPSC-ECs 라이브 이미징 및 부착 백혈구의 자동화 된 계산을 사용 하 여 흐름 분석 결과에서 백혈구 접착의 기능 평가 등의 특성을 설명 합니다.
HiPSC-ECs TNFα와의 하룻밤 자극 길쭉한 모양을 일반적으로 ECs에서 활성화 된 프로-염증 성 표현 형을 나타내는 결과. 최적화 단계 식 수준의 전자 selectin, ICAM-1, VCAM 1 FACs7,8, 그리고 기본 인간 탯 줄 정 맥 ECs (HUVECs)에 의해 확인 되어야 한다는 긍정적인 컨트롤로 포함 되어야 하는 것이 좋습니다.
최적의 hiPSC-ECs 분리 및 밀도 시드 confluent 단층 세포 덩어리를 형성 하지 않고 달성 하 고 나 막 신 채널을 도달 한다. 그것은 다시 중단 백혈구 직전 관류 셀 강 수를 방지 하 고 각 채널을 시 금 때 일정 농도 유지 하는 중요 한. 인간 주변 혈액 백혈구, monocytes, 호 중구 등 사용할 수 있습니다, 또는 THP-1 또는 HL-60 대 안으로 사용 될 수와 같은 monocytic 세포 라인을 설립.
미세 설정의 어셈블리 그리고 흐름 분석 결과, hiPSC-ECs 부착 백혈구의 분리 될 수 있습니다으로 미세 튜브와 채널에 갇혀에서 기포를 방지 하기 위해 중요 하다. 액체-액체 인터페이스 또는 미세 설정의 준비 하는 동안 추가 세척 단계 관 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다.
그것은 프로토콜 어디 하나 셀을 준비 하 고 두 번째 준비 미세 시스템 및 흐름 분석 결과 두 연산자에 의해 실행 되는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 ECs는 처리 하기 전에 일정 시간 창 내에서 미세 칩으로 도금 및 정확성과 결과의 재현성을 향상 시킵니다. 또한,이 또한 멀게 실험 결과에서 바이어스를 방지 하려면 설정을 수 있습니다.
자동화 이미지 처리 파이프라인으로 성공적인 셀 검출, 높은 신호 대 잡음 비율 초점에서 이미지 하 고 셀 덩어리 같은 일반적인 개체의 autofluorescence를 피하기 위하여 중요 하다. 중요 한 중요성 확인 될 필요가 있는 부착 백혈구의 전형적인 크기의 최소 및 최대 한계의 정확한 사양이 이다. 하나 ImageJ의 선 측정 도구를 사용 하 여 백혈구의 일반적인 크기를 예측할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 분석에서 우리는 10.3-17.1 µ m (그림 4C)의 실제 크기에 해당 하는 9-15 픽셀의 범위를 사용. 잘못 된 범위, 예를 들어, 3-15 픽셀 (3.4-17.1 µ m)를 사용 하는 경우 단일 백혈구 하나의 셀으로 식별 됩니다 하지만 오히려 그 분할할 별도 개체 (그림 4D)로 식별 됩니다. 이것은 개체의 잘못 된 번호를 식별할 수 있습니다.
많은 개체의 낮은 강도 및 작은 표면 지역 보다 백혈구 제공된 적응형 임계 처리 방법을 사용 하 여 검색 될 수 있습니다. 이 때문에 autofluorescence 또는 다른 일반적인 형광 신호를 걸릴 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 일반적인 개체, 그들의 지역 단일 백혈구의 일반적인 영역 보다 작은 경우 필터링 수 있습니다 최소 허용된 표면 영역 (그림 4C)를 정의 하 여.
여기에 설명 된 흐름 분석 결과 수 elucidating이 두 세포의 상호 작용 하는 EC 단층에 백혈구 접착의 직접 평가 유형, 하지만 다른 세포 유형, pericytes는 혈관 벽에 존재와 같은 및 또한 수를 고려 하지 않습니다. 백혈구 넘쳐 흐름15의 규정에 참여 합니다. 다른 세포 유형 3 차원 문화 microenvironment 통합 시스템의 생리 적인 관련성 향상 시킬 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 여기에 설명 된 선 동적인 응답의 평가 대 한 흐름 분석 결과 제공 합니다 유용한 도구 기본 특성 및 질병에 대 한 hiPSC-ECs의 모델링 응용 프로그램을.

염증은 많은 병 적인 조건, 포함 심장 혈관 및 신경 퇴행 성 질환, 패 혈 증 및 불리 한 약물 응답 (ADRs)에서 중추적인 역할을 한다. 내 피 세포 (ECs) 전자 selectin, 세포 접착 분자 1 (ICAM-1) 등 혈관 세포 접착 분자-1 (VCAM-1) 그들의 표면에 프로 접착제 수용 체의 유도 통해 선 동적인 응답 조절에 필수적인 역 1 , 2. 다른 직물에 microvascular ECs 전시 선 동적인 응답3,4이 알려져 있습니다. 또한, 유전적 배경이 나 특정 유전 조건이 발생할 수 있습니다 개인; 염증 성 반응 차이 그러므로 다른 개인에서 ECs의 접근이 중요 하다. 최근, 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)5, 거의 모든 개인에서 파생 될 수 있는, 더 안정적이 고 재생 소스 ECs6,,78, 의 역할을 표시 했다 9. 따라서, 선 동적인 응답 및 hiPSC-ECs에 백혈구 신규 모집의 평가 뿐만 아니라 특정 유전 질환의 모델링을 위한 귀중 한 뿐만 아니라 간 개별 다양성의 표시를 제공 하 고를 위한 도구로 사용 하 맞춤된 의학 미래.
흐름 분석 공부 내 피 백혈구 상호 작용에 대 한 유용한 도구를 제공 합니다. 미세 장치에 진보 혈관 침대 전용 전단 응력 레벨의 정확한 제어와 생리 유체 흐름 조건의 재생산 가능 라이브 이미징 백혈구 캡처, 압 연, 크롤링, 접착 및 환생의 이벤트의 캐스케이드의 모니터링 가능 그러나 내 피-백혈구 상호 작용 연구를 몇 가지 흐름 분석 실험 개발 되었습니다, 그리고, 그들은 모두 기본 ECs10,11,,1213활용. 여기, 우리는 자세히 설명 hiPSC-ECs 생리 흐름 아래에 인간 백혈구 접착의 평가 대 한 분석 결과. 이 절차에서는 우리는 8 개의 병렬 채널 미세 칩에 시드 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα), 분리, 같은 프로-염증 성 자극으로 hiPSC EC 자극의 최적화 조건 설명 합니다. 우리는 미세 칩에 붙일 레이블된 백혈구 중단 hiPSC-ECs의 관류에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 하 고, 라이브 셀 이미징 부착 백혈구의 계산 자동화.
이 프로토콜은 hiPSC-ECs 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 개인된 재생 의학에에서 선 동적인 응답의 평가 대 한 유용 합니다.

<table><tbody><tr><td>Vena8 내피 + 바이오 칩</td><td>Cellix Ltd</td><td>V8EP-800-120-02P10</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo 나노 펌프</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-EVO-PUMP</td><td>1 x 주사기 펌프; 1 x VenaFluxAssay 소프트웨어; 1 x 튜빙 키트; 전원 공급 장치 및 케이블.</td></tr><tr><td>8채널 매니폴드 MultiFlow8</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-MULTIFLOW8</td><td></td></tr><tr><td>Humidified box</td><td>Cellix Ltd</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>형광 이미징 시스템 Leica AF6000</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 증식 전하 결합 장치 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 작업대/층류 후드</td><td>Cleanair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 세포 배양 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Hitachi</td><td>himac-CT6EL</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 피펫맨 (P-10 (10 mL), P-200 (200 &micro; L), P-1000 (1,000 &마이크로; L)</td><td>Gilson international</td><td>4807 (10&마이크로; l), 4810 (200&micro; l), 4809 (1000&마이크로; l)</td><td></td></tr> <tr><td>멸균 플라스틱 피펫</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180 (5ml), 607180 (10ml)</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR / Duran Group</td><td>391-0860</td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크 (75 cm2)</td> <td>CELLSTAR</td><td>658,170</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기 튜브 (15 mL)</td><td>CELLSTAR</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>돼지 껍질의 젤라틴, A형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin (소 혈장)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>인간 내피-SFM</td><td>생명 기술</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF 165 IS, 프리미엄급</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-386</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-2, 프리미엄급</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-842</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 부족 혈장 유래 혈청, 소</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-214</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-&알파;</td><td>Tebu-bio</td><td>300-01A-A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Life Technologies</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6(3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(50mM)</td><td>Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(5,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td>Life Technologies</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>Merck</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB5649P</td><td></td></tr><tr><td>E-Selectin</td><td>R & D 시스템</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D 시스템</td><td>BBA20</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>소프트웨어 버전</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cellrofiler</td><td>CellProfiler</td><td>2.1.1</td><td></td></tr><tr><td>VenaFluxAssay Software</td><td>Cellix Ltd</td><td>2.3.a</td><td></td></tr></tbody></table>

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hipsc-ecs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

내 피 세포 (ECs) 제한 하거나 upregulated 인 프로 접착제 수용 체의 특징이 잘 캐스케이드를 통해 영향을 받는 조직으로 백혈구 신규 모집을 촉진 하 여 선 동적인 응답의 규칙에 대 한 필수적입니다에 염증 성 방 아 쇠에 따라 백혈구 세포 표면입니다. 과 선 동적인 응답 다 인구에 있는 개인 사이 유전 배경이 이러한 차이에 기여할 수 있다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 따라서 셀 유전자 id와 어떤 유전 이체의 무제한 소스 또는 기증자의 변이 나타내는 ECs (hiPSC-ECs)의 신뢰할 수 있는 원본으로 표시 되었습니다. hiPSC-ECs 따라서 기증자 특정 셀에 선 동적인 응답 모델링에 대 한 사용할 수 있습니다. 선 동적인 응답 생리 흐름 아래 hiPSC ECs에 백혈구 접착을 결정 하 여 모델링할 수 있습니다. 이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

첫째, hiPSC-ECs의 TNFα를 시험 한다, 프로-염증 성 에이전트와 함께 자극 응답은 이전7을 설명 합니다. 12 h에 대 한 TNFα 치료는 치료 시작 후 6 h에서 피크와 전자 selectin의 upregulation를 트리거합니다. 또한, ICAM-1 upregulated 6-12 h 후 처리입니다. 비록 우리가 VCAM-1의 예상된 upregulation를 관찰 하지 않았다, 일반적으로 기본 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)에서 관찰 된다. 우리는 백혈구 접착 분석 결과 대 한 가장 편리한 수에 하룻밤 (12 h) TNFα 치료를 발견.
최적의 hiPSC-ECs 분리 한 단일 세포 현 탁 액 셀 덩어리의 무료 발생 한다. 그림 2C 주입 후 바로 최적의 hiPSC-EC 밀도를 보여 줍니다. 일반적으로, 주입 후 15 분, hiPSC-ECs 채널의 하단에 첨부 고 (그림 2D)을 확산 시작 합니다. 1 h 주입 후 hiPSC-ECs는 채널에 따라 잘 확산된 단층을 형성 하 고 흐름 분석 결과 (그림 2E)를 시작할 준비가 될 것입니다.
형광 추적기와 백혈구의 라벨은 도움이 단계에서 이미지 자동 이미지 정량화에 대 한 그것은 쉽게 셀 식별 단계, ECs의 단층에 준수는 백혈구 특히 있기 때문에 그것은 종종 어려운 다른 종류를 구별 하는 소프트웨어에 대 한
무료 오픈 소스 이미지 프로세싱 소프트웨어 부착 백혈구의 자동화 된 정량화에 대 한 매우 유용 합니다. 프로토콜 여기에 설명 된 파이프라인 백혈구 (그림 4A)의 형광 이미지의 적응형 임계 처리를 사용 하 여 기본 개체 식별을 기반으로 합니다. 또한 최소한의 영역을 기반으로 개체를 식별의 필터링 세포 파편, autofluorescence 또는 어떤 다른 일반적인 형광 신호 (그림 4 C, D) 등 잘못 식별 된 개체를 필터링.
8 개의 병렬 채널 미세 칩에 한 두 개의 독립적인 그룹의 비교, 예를 들어, ECs 독립적인 hiPSCs, 건강 한 기증자 등 유전 질환을 가진 환자에서에서 분화. 치료 ECs, 또는 전처리 ICAM-1 차단 항 체와 같은 추가 컨트롤 잘10,11으로 포함 될 수 있습니다. 2 ~ 3 미세 칩은 한 번에 처리할 수 있습니다. 결론의 견고성, 최소 3 개의 독립적인 생물 실험 독립 일에 수행 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig1.jpg"> 그림 1 : HiPSC-ECs 및 백혈구의 흐름 분석 결과 대 한 준비. (A)의 hiPSC-ECs 프로-염증 성 자극 (TNFα)과 사전 치료. (B) hiPSC-ECs 효소 분리, 원심 분리, 및 물의 resuspension의 도식 적인 표현입니다. (C) hiPSC-EC 정지 (C, 중간)의 주입 채널 (C, 왼쪽), 코팅의 도식 표현 세포 미세 칩 첨부 파일 hiPSC-ECs 후 문화 매체 추가. (D) 백혈구 세척 단계, 형광 성 염료 DiOC6와 물의 resuspension 라벨의 도식 적인 표현입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig2.jpg"> 그림 2 : HiPSC-ECs와 미세 칩. (A) 미세 칩 10 cm 배양 접시에에서. (B) 습도 챔버는 부 화에 대 한 사용. (C, D, E) HiPSC-ECs는 미세에서의 대표 이미지는 주입 후 0 분 (C), 15 분 (D), 1 h (E) 채널. 눈금 막대 = 200 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig3.jpg"> 그림 3 : 라이브 셀 이미징 및 백혈구 관류 분석 결과의 실험 설정. (A, B) (B)의 라이브 셀 이미징 및 흐름 분석 결과의 실험 설치 사진 (A) 및 회로도 표현: (1)-마운트 라이브 이미징 챔버 (5% CO2, 37 ° C, 습도), (2) 거꾸로 형광 현미경-미세 펌프, (3)-8 채널 매니폴드의 (4)-현미경 제어 및 이미지 수집, (5)-미세 펌프 제어용 PC 대 PC (C) 미세 칩 8 채널 매니폴드에 플레이트 홀더 고정 및 현미경의 전동된 스테이지에의 삽입된 튜브와 함께. (D)의 흐름 분석 결과의 주요 단계 도식 적인 표현입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig4.jpg"> 그림 4 : 이미지 분석 및 부착 백혈구의 자동된 감지. (A) 백혈구의 식별에 대 한 지정 된 설정으로는 소프트웨어를 처리 하는 이미지의 대화 창. (B) 지정 된 필터링 된 이미지 프로세싱 소프트웨어의 대화 창을 기준 확인 된 개체에 따라 최소한의 허용 표면 영역 (SA분 = 70 px). 백혈구의 올바른 식별 및 작은 표면 영역 (SA)의 일반적인 개체의 필터링의 (C) 예 (픽셀 (최소, 최대)에서 전형적인 직경 = (9, 15); 필터링 기준 SA분 = 70 px). 허용된 개체는 녹색으로 묘사 되 고 버려진된 개체는 바이올렛에 묘사 된. 전형적인 직경의 잘못 된 범위 때문에 백혈구의 잘못 된 식별의 (D) 예 (픽셀 (최소, 최대)에서 전형적인 직경 = (3, 15); 필터링 기준 SA분 = 70 px). 허용된 개체는 녹색으로 묘사 되 고 버려진된 개체는 바이올렛에 묘사 된. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

이 방법은 인간 유도만능 줄기 세포 유래 내피 세포의 기능성 및 염증 반응에 대한 인간 만능 줄기 세포 생물학 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 유도만능 줄기 세포 유래 내피 세포에 대한 백혈구 접착의 평가를 위한 실험 설정 및 데이터 분석에 대한 상세한 설명을 제공한다는 것이다. 미세 유체 칩 코팅의 경우 멸균 바이오 칩을 10센티미터 멸균 페트리 접시에 넣고 10 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 갓 준비된 fibronectin 작동 용액 10 마이크로리터를 바이오칩의 각 채널에 주입합니다.페트리 접시를 덮고 밤새 4도의 가습챔버에 놓습니다. 다음날 아침, 바이오칩을 섭씨 37도 인큐베이터로 미리 데우고, 신선한 내피 세포 혈청이 없는 배지에서 원하는 농도에서 80~100%의 원소 세포 배양에서 수확된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 내피 세포를 다시 중단한다. 다음으로, 마이크로유체 칩의 모든 채널에서 섬유네틴 용액을 흡인시키고, 세포를 철저히 혼합하여 10마이크로리터 파이펫 팁을 사용하기 전에 균질세포 현탁액을 획득하여 각 채널에 6마이크로리터의 세포를 주입한다.현미경의 밑에 바이오칩을 검사하여 세포가 높은 세포 밀도로 균일하게 분포되어 있는지 확인합니다. 섭씨 37도에서 15분 후, 각 채널의 양쪽에 있는 중간 저수지에 내피 세포 혈청 없는 매체 FULL 40 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 바이오칩을 인큐베이터에 1시간 동안 반납한다.그런 다음 내피 세포 혈청없는 배지 FULL 50 마이크로 리터를 각 채널의 양쪽에 있는 저수지에 추가합니다. 시드 세포의 라이브 이미징의 경우, 미세 유체 설정이 준비되고, 라이브 이미징 챔버가 섭씨 37도로 평형화되고, CO2 수준이 5%에 도달하여 바이오칩을 현미경 칩 홀더에 넣고 칩 홀더를 현미경 이미징 단계에 장착하는지 확인합니다. 매니폴드를 통해 바이오칩을 펌프에 연결하려면 8핀 어댑터를 칩의 콘센트 저장소 에 가깝게 놓고 핀을 완전히 연결하지 않고 매체의 모든 핀을 깊게 합니다.미세 유체 펌프 소프트웨어에서 Washout/Connect 칩을 선택하고 실행 분석 단계를 클릭하여 각 핀을 통해 RPMI 배지 30 마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 바이오칩의 콘센트에 8핀 어댑터를 삽입합니다. 파이펫을 사용하여 바이오칩의 모든 입구 저장소에서 배지를 수동으로 흡인하고, 워시아웃/칩 워시아웃 및 런 분석 단계를 선택하여 내피 세포 혈청 이음새 가 없는 배지 40마이크로리터로 한 번에 하나의 채널을 배분하여 죽은 세포와 잔해를 제거합니다.모든 채널이 세척되면 관심있는 채널의 입구 저장소로부터 배지를 100 마이크로리터로 대체하여 RPMI 배지에서 밀리리터 농도당 2.5배 10배10로 희석된다. 셀 분석/단계 설명을 클릭하고 현재 채널/단계 설명을 설정하고 관심 있는 채널을 켜기로 설정하고 다른 7개 채널을 끄기로 설정합니다.입구 저장소의 나머지 백혈구를 완전한 RPMI 배지 100 마이크로리터로 교체하십시오. 그리고 셀 분석 단계 설명 및 실행 분석 단계는 RPMI 매체와 5 분 동안 채널을 perfuse 어떤 비 부착 백혈구를 제거합니다. 그런 다음 채널에서 3~4개의 서로 다른 위치에서 이미지를 획득하여 부착된 백혈구를 시각화합니다.준수 백혈구를 정량화하려면 CellProfiler 이미지 처리 소프트웨어를 열고 백작 백작 파이프라인 파일을 가져옵니다. 입력 모듈 에서 이미지를 선택하고 폴더를 파일 목록 창에 부착된 백혈구의 원시 이미지와 함께 폴더를 드래그 앤 드롭합니다. 분석 모듈에서 기본 개체 식별을 선택하고 픽셀에서 부착백백세포의 최소 및 최대 직경을 나타냅니다.분석 모듈에서 필터 오브젝트를 선택합니다. 그런 다음 필터링 조건을 선택하고 픽셀단위로 개체의 최소 허용 영역을 입력하고 이미지 분석을 클릭하여 분석을 시작합니다. 최적의 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포 해리는 세포 덩어리가 없는 단일 세포 현탁액을 초래한다.전형적으로, 주입 후 15분 동안 내피 세포가 채널의 바닥에 부착되어 퍼지기 시작합니다. 주입 후 1시간 이내에 내피 세포는 채널 전반에 걸쳐 잘 퍼진 단층층을 형성해야 하며, 이 때 흐름 분석에서 사용할 준비가 되어 있습니다. 입증된 바와 같이 무료 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어를 사용하면 최소한의 영역에 따라 식별된 물체를 필터링하고 셀 이물질, 자동 형광 또는 기타 비특이적 형광 신호와 같은 거짓 식별 된 물체를 제외 할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 프로 염증 성 사이토카인으로 자극을 최적화하고 양성 대조군으로 1 차적인 인간 적인 심부 정맥 내피 세포를 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 1 차적인 포유류 세포 및 세포주를 가진 일하는 것은 극단적으로 위험할 수 있고 실험실 외투, 장갑 및 눈 보호를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs) 본질을 표시하는 강력한 clonal proliferative 잠재력과 내피 세포를 순환하고...

내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

여기에서는 만능 줄기 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포로 분화할 수 있는 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이들 세포는 내피 세포 부착 분자 발현을 보여주므로 시험관 내에서 면역 세포 상호작용을 연구하기에 적합한 인간 혈액-뇌 장벽 모델입니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

배우세요 hiPSC-ECs에서 백혈구 접착을 평가하는 미세유체칩 기반 프로토콜을 통해 혈관 염증 반응을 실시간으로 분석하는 방법을 익히세요.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

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