Name: 3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 조직 공학용 3D 인쇄 기법으로 구조적 합성물질과 생물학적 성분을 동시에 인쇄하는 방법입니다. 돼지 후지에서 추출한 탈세포화 기질을 활용하여 세포 배양에 최적화된 기능성 스캐폴드를 제작합니다.

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이 프로젝트에서는 소아 정형 외과 학회의 북미 지역 (POSNA) 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다 고 국립 보건원 NIBIB R21EB025378-01 (탐구 바이오 연구 그랜트)을 부여 합니다.

1. 고 스피어 전처리
<ol><li>원하는 매트릭스와 생산 스피어 캡슐화 (PLA-DM)2. 참고: 균일 한 크기의는 스피어는 필수적 이다. 이러한 이유로, 체질 스피어 이전 사용에 필수적 이다. 매트릭스 decellularization 및 캡슐화 이전 간행물2상세한 되었습니다 있지만 프로세스의 간략 한 요약 다음과 같습니다.<ol>
<li>첫째, 돼지 뒷 다리 사지에서 연골 플러그 수확. 0.05 %trypsin / 0.5 m m tetrasodium ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 세척의 시리즈에서 연골을 decellularize, Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 그리고 1.5% 초 산 2.0 %4 h 각 증류수 세척에 대 한 Triton X-100 2각 단계 전후.</li>
		<li>Decellularized 매트릭스, 동결, lyophilize, 갈기, 배수와 펩 신 솔루션으로 해산. 해산, 다음 dichloromethane에 해산 되었습니다 PLA 펩 신 솔루션 믹스.</li>
		<li>물 솔루션에서 3% 폴 리 비닐 알코올에 dropwise 혼합물을 추가 합니다. Centrifuge 결과 스피어, 린스, 드레인, 그리고 다시 lyophilize. 참고: 상세 과정에 대 한 이전 게시 프로토콜2를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>체질은 스피어.<ol>
<li>모든 체 접시 철저 하 게 청소 하 고 사용 하기 전에 건조를 확인 합니다. 필요한 경우 깨끗 한 체를 사용 하 여 초음파 청소기 모든 분야는 체에서 제거 됩니다.</li>
		<li>상단, 하단에 팬, 그리고 체 후 53 µ m 트레이 106 µ m 체 트레이와 체 통을 조립.</li>
		<li>맨 체 트레이에 건조 스피어를 놓고 상단 용지함에 뚜껑을 배치 합니다. 8 ~ 10 분 반복 8 ~ 10 분에 대 한 벌금에 대 한 거친 체질 켭니다. 참고: 체 시간 증가 하거나 일괄 처리에 따라 감소 해야 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 체 접시 하나 하나 제거 하 고 거꾸로 큰 무게 종이에 그들을 배치. 분야의 대부분은 체 그리고 종이에 졌 되도록 부드럽게 양쪽을 누릅니다.</li>
		<li>대형된 분야를 취소 (> 106 µ m)와 소형 분야 (< 53 µ m). 영역 유형 및 일괄 처리 번호 레이블이 지정 된 원심 분리기 튜브를 53 106 µ m 크기 범위에 있는 다음 추가 사용까지-20 ° C 냉동 고에 장소를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 스피어 품질 관리 평가
참고: 그림 1을 참조 하십시오.
<ol><li>거시적인/시각적 평가 스피어는 균일 하 고 구형, 아니 집계 존재 확인을 수행 합니다.</li>
	<li>스캐닝 전자 현미경 사진 (SEM)을 사용 하 여 스피어를 평가 합니다.<ol>
<li>이 위해, 장소 스피어는 SEM에 척 하 고 코트 4의 두께를 스퍼터 coater를 사용 하 여 아르곤 분위기에서 금-팔라듐을 스퍼터 nm.</li>
		<li>표면 기능, 형태, 및 10를 사용 하 여 스피어의 직경을 관찰 kV 가속 전압 및 10 m m 작동 거리 그 생산 고는 스피어의 체질은 성공적 이었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 필 라 멘 트 창조 3D 인쇄
<ol><li>측정 및 기록 2, 3; 단계에서 얻은 스피어의 질량 적어도 25 g이 필요 합니다.</li>
	<li>PCL에 스피어의 1:4 무게 비율에 대 한 스피어를 polycaprolactone (PCL) 분말을 추가 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 20 rpm에서 소형 회전 믹서에 분말 혼합을 혼합 그리고 플립 컨테이너 추가 5 분 20 rpm에서 혼합 ( 그림 2참조).</li>
	<li>많은 상용 압출 기 ( 재료의 표참조) 그들의 의도 된 작업 온도 전통적인 융합된 증 착 모델링 (FDM) 필 라 멘 트 때문에 보 온 자 켓 있다. 단 열 재료를 제거 하 여 압출 기 (필요한 경우)를 수정 하 고 사용 하 게 데스크탑 팬 (이 압출 기 및 압출 된 필 라 멘 트에 주변 공기를 날 려)와 낮은 온도에서 압출 기의 사용을. 참고: 압출 기 및 필 라 멘 트를 냉각 주위 공기는 데스크탑 팬은이 절차에 대 한 유용 합니다.</li>
	<li>돌출에 대 한 장비 설치 설치. 그림 3을 참조 하십시오.<ol>
<li>그 출구는 ~ 60 cm 입구에서 스풀러, 스풀러 인렛에 압출 콘센트에서 직접 경로와 압출 기를 설치. 참고: 스풀러 올려질 수 있다 선택적으로 벤치에서 3-4 인치는 필 라 멘 트 벤치탑 감동의 지점에 지는 경우.</li>
		<li>데스크톱 팬 난방 재킷에서 ~ 15 cm 놓고 난방 재킷 제공 하는 필 라 멘 트 생산을 통해 주변 공기 냉각을 향해 직접 합니다. 두 번째 냉각 팬 약 압출 기 및 스풀러를 짝수가 놓고 한다 필 라 멘 트 주위 공기를 냉각에 도움을 향해 직접 합니다.</li>
		<li>과정에서 필요에 따라 위치를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수정 된 압출 기 52 ° C에가 열을 설정 하 고 냉각 팬, 바탕 화면 설정 20 ~ 30 분 적절 한 노즐에서 압출 기에 연결 되어 있는지 확인에 대 한 균형에와 서 악기를 허용.</li>
	<li>그냥 시작 하기 전에, 단계 3.3에서에서 스피어/PCL 혼합물으로 압출 기의 호퍼를 채우십시오. 필 라 멘 트 압출을 시작 하는 스풀러 및 압출 기 도래 켭니다.</li>
	<li>초기 필 라 멘 트 압출 수동으로 집게 압출 출구에서 한다 내 고 필 라 멘 트 스풀러에 피드.</li>
	<li>원하는 필 라 멘 트 스풀러에서와 서 시간이 걸릴 것입니다. 필 라 멘 트 구성 시각적으로 나타나면 유니폼 마크 명확 하 게 별도 스풀 또는 테이프 using.</li>
	<li>프로세스를 자세히 모니터링 하 고 필요에 따라 매개 변수를 수정 합니다. 압출 기 온도, 압출 auger 속도, 및 스풀러를 1.75 m m 직경 멘 캘리퍼스로 측정 된 속도 조정 합니다. 제대로 비 원형 필 라 멘 트 횡단면을 피하려고 필 라 멘 트를 냉각 필요에 따라 팬 들을 조정 합니다. 혼합 하 고 필요에 따라 호퍼 리필. 참고: 주의 이후 3D 인쇄에 대 한 적절 한 필 라 멘 트를 얻으려면이 과정으로 필요 합니다. 위의 매개 변수는 주위 조건, 채우기 수준 및 호퍼에 혼합의 균일성 및 PCL와 스피어의 특정 배치의 열역학 및 흐름 역학에 따라 변경 됩니다.</li>
	<li>계속 모든 파우더는 사용 하 고 호퍼는 거의 비어 때까지 압출 한다. 스피어 혼합물을 압출 기에 현재는 살아 가기 위해 호퍼를 PCL (스피어) 없이 파우더를 추가 합니다. 계속 더 더 스피어는 한다에 표시 될 때까지 호퍼에 PCL 파우더를 추가 합니다.</li>
	<li>레이블을 고 별도 필 라 멘 트 후에 필 라 멘 트 그것 냉각으로 원하는 농도에 스피어를 포함 하는 균일 하지 않은 필 라 멘 트에서 균일 한 필 라 멘 트를 구별 하기 어렵게 합니다.</li>
	<li>압출 최소한의 파우더는 호퍼에 남아 있을 때까지 계속 다음 스풀러, 압출 기 도래, 압출 기 난방 요소, 그리고 팬 들을 해제 합니다.</li>
</ol>4입니다. 인쇄는 필 라 멘 트와 함께
<ol><li>원하는 모양 및 컴퓨터 원조 설계 소프트웨어를 사용 하 여 폼의 형상을 디자인. 다음 모델 슬라이스와 슬라이스 호환 소프트웨어는 사용 중인 3D 인쇄 기계와를 사용 하 여 공구 경로 지시.</li>
	<li>로드는 필 라 멘 트 어떤 표준 FDM 프린터에 3 단계에서 원하는 직경 (일반적으로 0.4 m m)의 표준 노즐 장착. 사용자 정의 필 라 멘 트는 예금 된 레이어-의해-레이어 기계에 의해 (65-70 ° C, 300 mm/min 선형 속도)에서 일반적으로 인쇄를 시작 합니다.</li>
	<li>첫 번째 계층에 특별 한 관심을 지불 하 고 좋은 품질 인쇄 필요에 따라 설정을 조정 해야 합니다. 참고: 조정 인쇄 속도, 인쇄 온도, 플랫폼 온도, 압출 배율 및 기타 매개 변수를 만들 수 있습니다. 프린터 및 추가 지원에 대 한 조각화 제조업체의 문제 해결 가이드를 참조 하십시오.</li>
</ol>5. 품질 관리 평가
<ol><li>Sem의 물림 쇠에 인쇄 된 구조를 놓고 코트 4의 두께를 스퍼터 coater를 사용 하 여 아르곤 분위기에서 금-팔라듐을 스퍼터 nm.</li>
	<li>10을 사용 하 여 현미경 관찰 kV 가속 전압 및 거리는 10 m m 표면 기능을 확인 하 고 스피어 경우의 유무에 대 한.</li>
</ol>6. 기능 테스트의 인쇄 된 구문
참고: 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 사용할 수 있습니다 decellularized 매트릭스에 대 한 대리로 캡슐화 된 단백질 필 라 멘 트 생산 과정 후 생물학적으로 활성 인지 확인 하. ALP는 기판, p-nitrophenyl 인산 염, 무색에서 노란색 부산물, p-nitrophenol와 무기 인산 염, 변경에서 반응 catalyzes 하지만 ALP 기능 구조에 있는 경우에 사용 됩니다.
<ol><li>인쇄는 형상 (n = 3) PLA-DM/PCL 공중 발판으로 동일한 인쇄 매개 변수를 사용 하 여 높은 산 스피어 멘 (PLA-알프/PCL)와 적어도 400 밀리 그램의 최종 질량 있다. PCL 인쇄-유일한 (PCL(-)) 건설 기계 PLA-알프/PCL 공중 발판으로 동일한 기하학의. 1 mL Tris HCl 버퍼에 잠수함 하 고 37 ° C, 110 rpm 회전 효소 보급 수 있도록 24 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>1 mg/mL p-nitrophenyl 인산, 트리 스에 disodium hexahydrate의 1 mL을 추가-37 ° C, 추가 10 h. 415에서 표면에 뜨는 흡 광도 읽고에 대 한 110 rpm에서 HCl. 품 nm.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

두 행렬을 decellularized 하 고 3D 인쇄 PCL 건설 기계는 독립적으로 접착 및 osteochondral에 대 한 그들의 사용의 유효성을 검사 하는 셀의 확산 복구10,,1112수 있도록 하지 표시 되었습니다. 조직 복구 엔지니어링 접근에서 decellularized 매트릭스를 사용 하 여 많은 관심과 최근2,3,,1415과거에 성공의 주제 되었습니다. 우리는 이전 증가 마이그레이션, 접착, 확산, 및 전반적인 유지 보수 결과 조직의 전통적인 기법2,,...

뼈, 연골, 힘 줄, 인 대 재건 등 임상 응용 프로그램에 대 한 현재 조직 공학 기술을 사용 하 여 자동-이식 손상 된 조직을 복구 하. 이러한 기술 각각을에서 수행 됩니다 정기적으로 "금 표준"으로 임상 연습으로 먼저 기증자 조직 환자 또는 일치 하는 시체에서 수확 후 기증자 조직 결함 사이트2에. 그러나, 이러한 전략은 기증자 사이트 사망률, 기증자 사이트 부족 큰 결함, 감염, 그리고 어려움 원하는 형상을 일치 하는 이식의 위험에 의해 제한 됩니다. 또한, 연구 재건을 위해 사용 하는 이식 기계 및 생물 학적 속성 기본 조직3에 비해 감소 했다 나타났습니다. 염두에 두고 이러한 고려 하 여 조직 엔지니어 최근을 아닙니다 생산을 생물학적으로 활성 결함 크기와 모양 제공 하면서 충분 한 수용 하도록 설계 된 사용자 지정, 복잡 한 형상의 3 차원 (3D) bioprinting 기계적 생물 학적 개장 완료 될 때까지 속성입니다.
이상적으로, 3D 인쇄 비 계 이루어져 있을 것입니다 통합된 biologics 세포, 그들의 이동, 확산에 지도 주변에 생 화 확 적인 신호를 제공 하는 동안 네이티브 조직의 필요한 기계적 안정성을 유지할 수 있는 고분자 백본 차별화, 그리고 조직 생산2,5. 불행 하 게도, 생물 학적 구성 요소를 포함 하는 대부분의 구문 젤 또는 vivo에서 세력 자동/이식 재건에 대 한 대상된 조직에 의해 경험을 견딜 수 있도록 너무 약한 폴리머로 만들어집니다. Polylactic 산 (PLA) 등 다른 고분자 bioresorbable, 3D 인쇄 및 구조적으로 소리, 하지만 그건 불가능 biologics 되어야 공동 제작 중-210 ° C 이상 온도에서 인쇄 됩니다. Polycaprolactone (PCL)는 다른 FDA 허가 bioresorbable 폴리머 3D 복잡 한 형태학5,6 환자 특정 이식 조작에 점점 더 인기 끌고있다는 낮은 온도 (65 ° C)에서 인쇄 될 수 있는 ,7,,89. 그러나, 대부분 bioprinters 공 압 기술을 사용 하 여 낮은 온도 생물 학적 활동 무사 히 보관에서 PCL 인쇄 불가능 한 만들. 날짜 하려면, 새로운 인쇄 소재 자동/이식으로 이러한 고분자의 통합 아직 수행할 수 있다. 이러한 자료의 부재, 조직 재건에 대 한 진정한 조직 설계 접근 가능성이 크다. 따라서, 우리 PCL, PLA를 결합 하고자 하 고 이식 행렬 (DM) 복잡 한 조직 재구성의 가능한 구조를 제조 하기 위해서는 각 재료의 장점을 활용 하는 것을 decellularized. 이 프로세스는 vivo에서 힘 및 첨가제 제조 원하는 조직의 형성을 유도 하는 구문에 맞게 열 안정성에 저항 하는 데 필요한 초기 기계적 강도 제공할 것 이다.
전술한 장애물을 해결 하기 위해 최근 시도, 우리 보여주 가능한 내 열 PLA 보호벽 PCL 필 라 멘 트, 내 돌출 될 수 있는 decellularized 연골 세포 외 매트릭스를 캡슐화 하는 것의 능력을 유지 하 주변의 호스트에 영향을 DM2세포. 이 우리 조직 재건에 대 한 임상적으로 효과적인 접근을 추구 하는 영감 하고있다. 현재 연구에서 우리는 PLA, DM, 및 PCL (PLA-DM/PCL)를 포함 하는 모든-에-하나의 공중 발판을 구축 하는 플랫폼 기술을 활용 합니다.
우리의 목표는 개선 효능과 궁극적으로 다양 한 응용 프로그램에서 그들을 사용 하 여 기본 조직, 더 정확 하 게 정리를 제안 된 새로운 biofabrication 기술을 사용 하 여 이식의 유틸리티입니다.

<table><tbody><tr><td>체 기계</td><td>Haver & Boecker Tyler</td><td>Ro-Tap RX 29-E Pure</td><td></td></tr><tr><td>Sieve 90 um</td><td>Fisherbrand</td><td>170328156</td><td>No. 170</td></tr><tr><td>Sieve 53 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162513588</td><td>No. 270</td></tr><tr><td>Sieve 106 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162018121</td><td>No. 140</td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>주사전자현미경</td><td>Hitachi, USA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filabot EX2</td><td>Filabot.com</td><td>FB00061</td><td></td></tr><tr><td>Filabot 스풀러</td><td>Filabot.com</td><td>FB00073</td><td></td></tr><tr><td>CAPA 6506</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>6" 팬</td><td>컴포트 존, 아마존</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>초음파 수조</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-08895-13</td><td></td></tr><tr><td>Dreamer</td><td>FlashForge</td><td>드럼</td><td></td></tr><tr><td>믹서</td><td>맞춤 제작</td><td>n/a</td><td>유사한 장비: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no& gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Micro Balance</td><td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td><td>01-913-851</td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D</td><td>Simplify3D</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>솔리드 웍스</td><td>해당</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 스피어</td><td>사내에서 생산, 동시 참조 제출된 JoVE 제출</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate</td><td>Millipore</td><td>4876-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase, alkaline</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10 713 023 001</td><td></td></tr><tr><td>흡광도 리더</td><td>Tecan</td><td>Sunrise</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455-100ML</td><td></td></tr><tr><td>가열식 쉐이커</td><td>New 브런즈윅 사이언티픽</td><td>엑셀라 E24</td><td></td></tr></tbody></table>

3d 인쇄에 대 한 새로운 과정 decellularized 행렬

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting 사용자 정의 건설 기계는 생물학적으로 활성화 되며 원하는 크기 및 형상을 만드는 것을 목표로. 생물 학적 요원 원래 조직 reconstitute 그들의 이동, 확산, 그리고 차별화 선도 조상 세포, 작곡 단서 제공 열가 소성 백본 기본 조직에 유사한 기계적 안정성을 제공할 수 있습니다 / 장기1,2. 불행히도, 많은 3D 인쇄 호환, bioresorbable 고분자 (polylactic 산, PLA) 등 210 ° C의 온도에서 인쇄 또는 높은-온도 인터 루 킨에 해로운. 다른 한편으로, polycaprolactone (PCL), 폴 리 에스테 르의 다른 종류는 bioresorbable, gentler 인쇄 온도 65 ° c.의 3D 인쇄 자료 따라서, 가상 했다 decellularized 세포 외 매트릭스 (DM) 열 보호벽 PLA에 포함 된 PCL 필 라 멘 트 내에서 인쇄할 수 및 그것의 기능 형태에 남아. 이 작품에서는, osteochondral 복구 가설을 테스트 하는 응용 프로그램을 했다. 이와 같이, 돼지 연골 decellularized 고 3D 구문을 통해 됐 증 착 모델링 생산 하 필 라 멘 트로 polycaprolactone (PCL)와 다음 압출 했다 polylactic 산 (PLA) 스피어에 캡슐화. 구조는 스피어의 유무에 관계 없이 (PLA-DM/PCL와 PCL(-), 각각) 표면 기능에서 차이 대 한 평가 했다.

체질, 후 스피어 유니폼 표시 하 고 집계에서 무료로 해야 합니다. SEM, 아래 체질된 스피어 그들의 표면에 작은 숨 구멍을 있을 수 있습니다 하지만 그렇지 않으면 되며 구형 부드러운, 그림 1에서 보듯이. 모든 압출 된 필 라 멘 트 균일 한 직경의 원형 단면 이어야 한다. 필 라 멘 트 스피어 (PLA-DM/PCL)를 포함 하는 약간 더 매트는 PCL 전용 동안 마무리 해야한다 (PCL(-)) 필 라 멘 트 더 광택 보이는 것 이다. PLA-DM/PCL 필 라 멘 트 또한 PCL(-) 필 라 멘 트 보다 터치 coarser 느낄 것 이다. 건설 기계 4.1 단계에서 소프트웨어에 의해 쓰게 했다 원하는 형상을 인쇄 되어야 한다. 반복 하 고 다른 한 인쇄에서 균일 한 비 계 품질 및 모양 이어야 한다. 인쇄, 후 건설 기계와 스피어 없이 거시적, 구별 하기 어려울 것입니다 하지만 SEM, 아래 스피어와 구문을 통해...

이 프로토콜의 구조 조직 구조 엔지니어링 3D 인쇄를 decellularized 행렬 (DM)를 포함 하는 임베디드 polylactic 산 (PLA) 스피어와 polycaprolactone (PCL) 필 라 멘 트의 생산을 설명 합니다.

3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

이 방법을 사용하면 조직 으로 설계된 스캐폴드를 위한 구조적 합성 및 생물학적 성분을 공동 인쇄할 수 있습니다. 이 발판은 배양된 세포에 유익할 수 있는 네이티브 조직 환경을 보다 정확하게 복제할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 공학을 위한 올인원 기술로 스캐폴드 내에 캡슐화된 생물학적 물질을 손상시키지 않고 기계적으로 건전한 구조를 인쇄할 수 있다는 것입니다.캡슐화된 원하는 매트릭스를 가진 마이크로스피어를 생성합니다. 이 마이크로스피어는 돼지 뒷다리에서 세포탈화 된 연골로 만들어졌습니다. 크기가 다양합니다.체기계와 협력하여 균일한 크기의 마이크로스피어를 구합니다. 사용하기 전에 세 개의 체 트레이를 철저히 청소하고 건조했는지 확인하십시오. 체 셰이커를 위에 더 큰 메시 트레이와 중간에 작은 메시 트레이로 조립합니다.체 팬을 바닥에 놓습니다. 마른 마이크로스피어를 가장 상단 의 트레이에 놓습니다. 그런 다음 뚜껑을 트레이에 놓습니다.8~10분 동안 거친 체. 그런 다음 8~10분 동안 미세한 체로 세입니다. 기다리는 동안 체체 구체에 대한 계량 용지를 정렬합니다.체질이 완료되면 체 트레이를 조심스럽게 제거하십시오. 트레이를 계량 용지에 거꾸로 놓습니다. 측면을 부드럽게 탭하여 대부분의 구체가 빠져나갈 수 있도록 합니다.모든 체판이 계량 용지에 비워져 대형 구와 언더사이즈 구를 버리십시오. 나머지 구는 후속 단계에서 사용하기에 적합한 크기를 갖습니다. 이 구체를 표기된 원심분리기 튜브에 넣습니다.필요할 때까지 튜브를 섭씨 20도 에 보관하십시오. 필라멘트 소재를 만드는 데 필요한 재료를 계량합니다. 적어도 25 그램의 마이크로스피어를 가진 폴리카폴락톤 분말에 마이크로스피어의 1-4 중량 비를 만듭니다.분말 혼합물을 소형 롤링 믹서로 옮습니다. 파우더를 분당 20회전에서 5분간 섞는다. 5분 후 회전을 멈추고 용기를 뒤집습니다.그런 다음 20 rpm에서 추가로 5 분간 섞습니다. 계속하려면 혼합물을 압출기 및 스풀러 설정으로 가져 가라. 압출기를 설치하여 콘센트가 스풀러 입구에서 약 60cm 떨어져 있습니다.그런 다음 압출기 가열 요소에서 절연 재킷이 없는지 확인하십시오. 압출기와 스풀기 중간에 데스크톱 팬을 배치하여 압출을 식힙니다. 가열 재킷 근처에 다른 팬을 넣어 주변 공기로 냉각합니다.다음으로 적절한 노즐이 압출기에 부착되어 가열 요소 온도를 설정합니다. 냉각 팬을 시작하고 기기가 안정된 상태에 도달할 수 있도록 합니다. 20~30분 후에, 마이크로스피어 PCL 혼합물을 얻고 압출기 호퍼를 채웁니다.스풀러와 압출기 어기를 켜서 필라멘트 압출을 시작합니다. 집게를 사용하고 수동으로 초기 압출 필라멘트를 당깁니다. 필라멘트 스풀러에 필라멘트를 공급합니다.압출될 때 필라멘트를 관찰하여 그 구성을 식별합니다. 얼마 후 필라멘트 조성물은 원하는 균일하게 나타납니다. 필라멘트 주위에 테이프를 감싸균일한 영역의 시작을 표시합니다.스풀러 롤러 를 넘어 필라멘트의 직경을 모니터링합니다. 캘리퍼를 사용하여 직경이 원하는 1.75mm에 가까우면 테스트합니다. 필요에 따라 스풀러와 압출기 속도와 온도를 조정합니다.필라멘트 직경을 조정하려면 먼저 스풀러및 압출기 속도를 변경합니다. 일반적으로 필요하지는 않지만 압출기 온도도 변경할 수 있습니다. 모든 분말이 사용될 때까지 호퍼를 다시 채우고 압출하십시오.호퍼가 거의 비어 있을 때 호퍼에 PCL 파우더를 추가하여 마이크로스피어 혼합물을 플러시합니다. PCL 파우더를 추가하는 동안 압출물을 모니터링합니다. 처음에는 압출시 미세구가 계속 표시됩니다.결국 더 이상 마이크로스피어가 보이지 않을 때PCL 추가를 중지합니다. 필라멘트를 원하는 농도의 마이크로스피어로 분리하고 라벨을 부착합니다. 호퍼에 최소한의 분말이있을 때, 압출을 중지하고 장비를 끕니다.필라멘트는 표준 융합 증착 모델링 프린터에서 사용할 수 있습니다. 필라멘트를 원하는 직경의 노즐이 장착된 프린터에 로드합니다. 모델이 로드되면 인쇄의 온도 및 선형 속도를 설정하고 필라멘트를 증착하기 시작합니다.사용자 지정 필라멘트는 레이어별로 계층별로 증착됩니다. 첫 번째 레이어에 특별한 주의를 기울이고 필요에 따라 설정을 조정합니다. 이 두 개의 3D 인쇄 비계는 이 스케일에서 구별하기 어렵다.하나는 폴리 카프랄락톤, PCL만 포함하는 필라멘트가 있습니다. 다른 하나는 폴리락산과 탈셀루아화된 행렬의 임베디드 마이크로스피어를 함유한 PCL 필라멘트가 있습니다. 스캔 전자 현미경 검사를 사용하여 본 PCL 전용 비계는 대부분 매끄럽게 나타납니다.대조적으로, 다른 필라멘트의 경우 PCL에 내장된 마이크로스피어는 샘플 전체에서 볼 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 오버 사이즈 또는 언더 사이즈 마이크로 스피어압압기의 재료의 흐름 역학에 영향을 미칠 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로 사용하기 전에 마이크로스피어를 올바르게 준비해야 합니다.폐기물을 최소화하기 위해 작은 배치를 더 자주 만드는 대신 모든 실험에 필요한 하나의 큰 필라멘트를 만드는 것이 좋습니다. 필라멘트 생산에 대한 전문 지식은 시간이 지남에 따라 올 것입니다. 이 절차에 따라 생산된 스캐폴드는 다른 바이오 프린트 스캐폴드에 비해 향상된 유도 및 기계적 강도에 대한 추가 질문에 답하기 위해 시험관 및 생체 내에서 추가로 평가할 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 조직 공학 분야의 연구원들이 3D 스캐폴드 내에서 탈구된 돼지 매트릭스의 항변 유도를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 작은 미립자와 함께 일하는 것은 호흡 위험을 초래할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차 중에 작은 미립자 마스크를 착용하는 것이 좋습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

조직 특이 적 세포 외 기질 (ECM)는 세포 기능의 중요한 매개체이다. 이 문서에서는 순수 ECM 파생 폼 및 체외 세포 배양 모델에서 고급 3D 애플리케이션 또는 프로 재생 bioscaffolds 화학적 가교 결합을위한 필요없이 문화에 안정 마이크로을 합성하는 방법을 설명합니다.

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

Decellularized 연골 파생 된 건설 기계 osteochondral 조직을 재생 하 가이드 연골 수리를 발판으로 및 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 종이 decellularization 프로세스를 자세히 설명 하 고 생체 외에서 설정에서 이러한 건설 기계를 사용 하 여 제공 합니다.

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

세포외 세포외 매트릭스(dECM)는 엔지니어링된 구조에서 표적 조직의 고유 기능을 재량화하기 위한 적절한 미세 환경 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기사는 췌장 조직의 탈세포화, 췌장 조직 유래 dECM 바이오 잉크의 평가 및 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 생성을위한 프로토콜을 설명합니다.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

이 작업에서, 태아 마우스 골격근의 탈세포화된 매트릭스를 얻기 위해 탈세포화 프로토콜이 최적화되었습니다. C2C12 근모세포는 이러한 매트릭스를 식민지화하고 증식하며 분화할 수 있습니다. 이 시험관 내 모델은 근이영양증과 같은 골격근 질환의 맥락에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비

이 프로토콜은 토착 소 폐 조직에 적용되는 두 가지 뚜렷한 탈세포화 방법론을 설명하여 각각의 특성화에 대한 포괄적인 설명을 제공합니다.

탈세포화된 폐 세포외 기질 하이드로겔의 개발 및 특성 분석

탈세포화된 비장 매트릭스(DSM)는 간 조직 공학 분야에서 유망한 응용 분야를 보유하고 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 비장 채취, 관류를 통한 탈세포화, 결과 DSM을 평가하여 특성을 확인하는 것을 포함하는 쥐 DSM을 준비하는 절차를 간략하게 설명합니다.

Rats에서 유래한 Decellularized Spleen Matrix의 제작

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

배우세요 조직 공학용 3D 인쇄 기법으로 구조적 합성물질과 생물학적 성분을 동시에 인쇄하는 방법입니다. 돼지 후지에서 추출한 탈세포화 기질을 활용하여 세포 배양에 최적화된 기능성 스캐폴드를 제작합니다.

3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

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