Name: Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 배우세요 실크 섬유소 필름을 이용한 AAV 바이러스 벡터 뇌 전달 기법으로 옵토제네틱 단백질을 정확히 표적화하는 방법입니다. 이 기술은 별도의 바이러스 주사 없이 신경 회로 연구를 가능하게 합니다.

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저자 대 제이 바스 케 스, D. 카 플 란과 C. Preda 시 약 및 유용한 지도, 그리고 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 B. 사바 티 니 및 C. 하 비의 실험실에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 현미경 M. Ocana 지원 부분에서 신경 이미징 센터는 국립 연구소의 신경 장애의 신경 생물학 이미징 센터에 의해 가능 하 게 되었다 고 치기 (NINDS) P30 코어 센터 (NS072030)를 부여 합니다. GVR 호 가족 재단, 낸시 Lurie 마크 재단과 NIH 교부 금, NINDS R21NS093498, U01NS108177 및 W.G.R에 NINDS R35NS097284과 C.H.C.에는 NIH 박사 후 친목 F32NS101889이이 작업 지원

동물을 포함 하는 모든 실험 동물 관리 미국 NIH 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 설명 된 다음 지침에 하버드 상임 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 했다. 성인 C57BL/6 마우스 중 섹스 (나이의 6-15 주)의 모든 실험을 위해 사용 되었다.
1. 수성 실크 Fibroin을 구하십시오
<ol><li>준비 하거나 수성 실크 fibroin (5-7.5 %w / v)을 구입 합니다.</li>
</ol>2. AAV 식 벡터와 수성 실크 믹스
<ol><li>AAV 식 벡터 optogenetic 단백질 또는 선택의 형광 표시기를 선택 합니다. 참고: 여전히 강력한 식 운전 하면서 임 플 란 트를 적용 해야 하는 실크/AAV의 볼륨을 최소화 하기 위해 주식 titer AAV (재고는 10 ~13 gc/mL 주위에 일반적으로 벡터 코어에서 얻은 titers) 것이 좋습니다.</li>
	<li>코팅 임 플 란 트, 직전 AAV의 약 수를 해 동 하 고 5-7.5% 수성 실크 fibroin (이 혼합물 것 이다 라고도 실크/AAV) 결합. 200 µ L PCR 튜브에 믹스 수성 fibroin AAV (두개골 windows 사용 1:4)에 대 한 1:1 비율로 응용 프로그램 직전. 부드럽게 플라스틱 솔루션 여러 번 밖으로 철저히 fibroin AAV를 믹스 하.</li>
	<li>얼음에 실크/AAV 혼합물 계속 사용 하기 전에.</li>
</ol>3. 제조 및 실크/AAV 코팅 장치 저장 장비 준비
<ol><li>코팅 광섬유 및 그라데이션 인덱스 (미소) 렌즈 (그림 1, 2)에 대 한 장비를 조달.<ol>
<li>안정적인 아무 홀더를 생성 합니다. 잡고 세라믹 깃 봉, ¼"시트 아크릴 블록에 1.25 m m 구멍을 드릴 합니다. 구멍 세트 나사 장소에 깃 봉 잡아 측면에서 삽입을 누릅니다. 참고: 어떤 클램프는이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>서브 밀리미터 정밀도 광학 섬유 (stereotaxic 장치 또는 다른 정밀 micromanipulator)를 이동 하는 조작 위치.</li>
		<li>안정적인 홀더는 microinjector를 조립.</li>
		<li>광학 섬유와 실크 물방울을 시각화 하는 stereoscope를 사용 합니다.</li>
		<li>광학 섬유 조명 광원을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두개골 창 (그림 3) 코팅 장비를 준비 합니다.<ol>
<li>어떤 P10 pipettor를 선택 합니다.</li>
		<li>뚜껑이 있는 컨테이너를 가져옵니다. 참고: 실리콘 바닥 어떤 콘테이너 든 지 제안-부드러운 바닥 용이 두개골 윈도우를 해제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>완성 된 보 형 물 (그림 4)를 저장 하는 장비를 준비 합니다.<ol>
<li>작은 (1-5 L) 진공 챔버를 얻을.</li>
		<li>저장 공간을 4 ℃ 냉장고에 이식 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 장치를 실크/AAV 영화 적용
<ol><li>섬유 끝에 드라이브 초점 식 광학 섬유 코팅
	<ol>
<li>앞에서 설명한4만성 섬유 임 플 란 트를 준비 합니다.</li>
		<li>사용 전에 린스 에탄올, 임 플 란 트 다음 되도록 초순 광학 섬유는 깨끗 합니다. 참고: 실크 영화 유리 표면을 청소를 더 안정적으로 준수.</li>
		<li>깃 봉 섬유를 장치를 준비 합니다. 전형적인 1.25 m m 직경 깃 봉, 사용 블록 ¼ 인치 명확한 아크릴, ~1.3 mm 구멍 및 구멍 임 플 란 트 (그림 1A) 장소에 단단히에 측면에서 입력 설정된 나사를 도청.</li>
		<li>마운트는 microinjector 장착 stereotaxic 장치 (또는 어떤 조작 솔루션 submillimeter 정밀)으로 아무 홀더. 아무 소유자는 microinjector 위에 놓고 아래에서 실크/AAV 혼합물을 적용 합니다. 참고: 응용 프로그램에서 대용량의 결과 끝에 제한 되었다 실크/AAV 때문입니다. 그러나, 많은 작은 순차 볼륨에서 위 또는 아래에의 응용 (비록 우리가 아래에서 적용 하는 것을 선호) 끝에 수감 되는 AAV/실크 예금 생성할 수 있습니다.</li>
		<li>붕 규 산 유리에서 표준 intracranial 주입 피펫은 당겨 모 세관.<ol>
<li>쉽게 하려면</li>
			<li>원하는 직경의 깨끗 한 플랫 팁 주입 팁을 생성 하려면 각 손에 한 피 펫을 보유 하 고 한 피 펫에는 테이퍼의 두꺼운 부분을 사용 하 여 원하는 휴식 위치에서 다른 피 펫을 점수.</li>
			<li>부드럽게 문 지 르와 톱 모션 (유리에 유리 채 점 방법).</li>
			<li>피펫으로 득점 후 깨끗 한 휴식을 달성 하기 위해 다른 피 펫의 시체와 함께 득점된 피 펫의 끝에 부드러운 압력을 적용.</li>
		</ol>
</li>
		<li>광섬유의 명확한 보기를 주고 stereoscope 위치. 참고: 배율 광학 섬유의 얼굴 위에 주입 피펫으로 정확 하 게 위치 충분 해야 한다.</li>
		<li>홀더 아래쪽으로 직면 하는 광섬유의 두뇌 측면에 섬유 임 플 란 트를 삽입 합니다.</li>
		<li>모든 표준 intracranial 주입5실크/AAV 솔루션 주입 피 펫을 로드 합니다. 임 플 란 트 ~ 30% 손실 펫 막힘 때문에 맞게 추가 플러스 만들어지고 수에 필요한 금액을 로드 합니다. 예를 들어 10 이식 사항이 되 고, 다음 100 nL 예금 로드 하 고 ~1.3 µ L를 철회. 참고: 실크/AAV 피펫으로 방해할 수 분출 사이 피 펫 끝에 건조 수 있습니다. 큰 직경 펫 (50-100 µ m) 덜 방해할 가능성이 있다. 나 막 신 젖은 종이 지우기 또는 알코올 면봉으로 피 펫의 끝 아래로 부드러운 칫 솔 질에 의해 dislodged 수 있습니다.</li>
		<li>만지거나 거의 광섬유 화면 가운데의 감동까지 주입 피펫으로 기동. 실크/AAV 솔루션의 10-20 nL를 꺼냅니다. 피펫으로 철회. 참고: 배달 속도가 중요 하지만 일반 요금은 5-20 nL/s.</li>
		<li>~ 1 분 이내 평면 필름 건조 액체 돔으로 표시 되는 평평한 표면에 실크/AAV의 bolus 관찰 (그림 1B).</li>
		<li>반복 단계 4.1.9-4.1.10 때까지 실크/AAV의 원하는 금액 입금 (대부분의 응용 프로그램에 대 한 20-200 nL의 총). 여러 개의 임 플 란 트를 준비할 때 한 임 플 란 트에 실크/AAV를 적용 하 고 반환 하기 전에 다른 임 플 란 트 코트 이동 첫 번째.</li>
		<li>임 플 란 트를 이동 하기 전에 건조를 위한 1 시간을 허용 합니다.</li>
		<li>진공 desiccate 하룻밤에 ~ 125 Torr (-25에. Hg), 4 ° c. 진공 챔버에 전체 아무 홀더를 배치 하 여 이렇게 합니다.</li>
		<li>모양 및 고 전력 현미경 결과 실크 영화의 위치를 평가 합니다. 영화 광 표면 끝에 수감 된다, 상대적으로 얇은 것 (> 100 µ m), 및 대칭 (그림 1C). 참고: 크거나 비대칭 실크/AAV 영화 수 분리 하십시오 섬유에서 이식 (그림 1D) 동안. 문제의 가장 일반적인 원인은 많은 작은 볼륨의 순차 응용 프로그램 보다는 하나의 큰 볼륨의 응용 프로그램에서 발생합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>코팅 섬유 축 드라이브 식 광섬유 테이퍼
	<ol>
<li>테이퍼 광섬유 임 플 란 트를 구하는 고 테이퍼 섬유는 인젝터 (그림 2A)에 수직이 되도록 옆으로 위치를 제외 하 고 단계 4.1.2-4.1.8를 수행 합니다. 인젝터를 테이퍼 섬유 위에 놓습니다. 참고: 표면 장력 방울 주입 피 펫에 다시 하거나 마이그레이션할 테이퍼 섬유를 일으킬 경향이 있기 때문에 과제를 추가 로드 테이퍼 섬유 포즈에 액체 방울. 작은 사출 펫 (30-50 µ m 직경)이이 문제를 극복 하지만 주입 피펫으로 방해할 것입니다 위험을 증가 시킬 것을 도울. 표면 장력으로 인해 방울 큰 면적의 영역을 준수 하는 경향이, 그래서 최적의 주입 플라스틱 크기 테이퍼 섬유와의 가끔 덩어리에 대 한 허용 오차의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>광섬유의 측에 대하여 실크/AAV 주입 피펫으로 테이퍼의 시작 부분에 배치 합니다. 사출 피펫으로 광섬유를 만지고 있다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>20 꺼내기 코팅 과정을 시작 하려면 실크/AAV의 nL. 드롭릿에 광학 섬유에 고착, 섬유/피 펫의 인터페이스에 남아 확인 하십시오. 실크/AAV 마른로 부드럽게 섬유 끝의 끝으로 물방울을 심지 (~ 45 s). 피 펫 팁 막힘 방지 하려면 건조 작은 물방울 접촉 주입 피 펫을 계속. 참고: 각 보증금 테이퍼 섬유 (그림 2B)의 약 400 µ m을 코트 한다.</li>
		<li>첫 번째 bolus 거의 완전히 건조 했다, 또 다른 20를 꺼내기 nL 테이퍼 따라 물방울 wicking 계속. 참고: 액체 실크 것입니다 준수 건조 실크 피펫으로로 작은 물방울의 한쪽 끝을 고정 테이퍼를 따라 이동.</li>
		<li>적은 양의 실크/AAV, 꺼내기 및 점차적으로 테이퍼의 측면을 솔루션 그리기 여 4.2.4 단계를 반복 합니다. 5-6 분출은 2.5 m m 테이퍼의 표면을 통과 하기에 충분.</li>
		<li>더 균일 한 표현의 모든 측면 주위 섬유를, 섬유를 회전 하 고 실크/AAV의 원하는 금액 입금 되었습니다 때까지 4.2.2-4.2.5 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>매달려 물가의 경우 건조 실크/AAV 섬유 팁, 신중 하 게가 위, 가닥을 잘라 확장 하거나 방출 피 펫을 사용 하 여 다시 가닥을 구 부 섬유의 테이퍼에 고착을 합니다.</li>
		<li>임 플 란 트를 이동 하기 전에 건조를 위한 1 시간을 허용 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 진공 desiccate 하룻밤 전체 아무 홀더 진공 챔버에 놓일 수 있다.</li>
		<li>모양 및 고 전력 현미경 결과 실크 영화의 위치를 평가 합니다. 참고: 영화 완전히 균일 하지 않이 필요 하지만 이식 (그림 3C) 동안 조직 주위에 손상을 최소화 하기 위해 섬유의 표면 넘어 100 µ m를 확장 하는 요동 하지 말았어야. 필름 크기를 최소화 하려면 각 방울 이후의 예금 하기 전에 완전히 건조 하다 중요 하다.</li>
	</ol></li>
	<li>코팅 미소 렌즈 임 플 란 트
	<ol>
<li>미소 렌즈6,7 을 얻기 고 4.1.2-4.1.8 단계를 반복 합니다. 인젝터 위에 장착할 수 있습니다.</li>
		<li>단일 방출 (1.0 m m 직경 렌즈에 대 한 1 µ L)에 실크/AAV를 입금. 참고:이 렌즈의 얼굴에 고착 하 고 균일 한 필름 (100-200 µ m 두께) 생산 건조 액체의 돔을 얻을 것입니다. 그러나, 하나의 큰 방출 균일 하 게 건조 하 고 미소 렌즈의 가장자리 근처 두꺼운 필름을 생산 하 고, 그 시도 여러 작은 물방울 (100-200 nL) 입금 (입금 하기 전에 건조 각 방울 수 있도록 렌즈 표면의 중심에서 다음) 영화 보기의 필드의 중앙에 식 드라이브 것입니다 수 있도록.</li>
		<li>임 플 란 트를 이동 하기 전에 건조를 위한 1 시간을 허용 합니다.</li>
		<li>모양 및 영화는 렌즈의 표면을 커버 수 있도록 고 전력 현미경 결과 실크 영화의 위치를 평가 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>코팅 유리 두개골 창
	<ol>
<li>준비 유리 접착 2 3 m m 직경에 의해 두개골 창 광학 접착제로 한 5 mm 직경 창 coverslips (제 1 두께) 라운드 (자세한 내용은 Goldey 외. 20148참조).</li>
		<li>실크: 바이러스 영화에서 실크의 총 금액을 줄이기 위해 1: 4의 비율로 섞는다. 과도 한 양의 실크 할 하지 이식 후 두개골 창 아래 분해 됩니다. 적정 실험 비율 및 원하는 식 프로필을 제공 하는 볼륨을 결정 해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>손 5 µ L 방울 3mm (뇌 연결) coverslip의 표면에 플라스틱. 드롭릿에 전체 유리 표면 (그림 3)에 밖으로 전파 한다.</li>
		<li>윈도우를 이동 하기 전에 건조 하는 2-3 h를 하실 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 저장 실크/AAV 코팅 임 플 란 트
<ol><li>(그림 4A)를 사용 하 여 전에 냉각된 진공 desiccator (125 ~ 하루, 4 ° C)에 실크/AAV 코팅 광섬유를 저장 합니다.</li>
	<li>대형 실크 영화 진공 저장 실패 완전히 이식 후 해산 두개골 창과 아래 진공, 미소 렌즈를 저장 하지 마십시오. 임 플 란 트 두개골 창과 미소 렌즈 즉시 건조 후, 또는 제조 대기압와 4 ° C에 저장 하는 경우의 하루</li>
</ol>6. 이온 주입 장치
<ol><li>앞에서 설명한4동물 임 플 란 트 수술에 대 한 준비.<ol>
<li>간단히, 케 타 민/xylazine (100/10 mg/kg)의 복 주사와 쥐를 anesthetize 하 고 부드러운 발가락-핀치를 사용 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다. 이식의 영역에서 두개골을 면도 하 고 요오드와 알코올 두 피를 청소.</li>
		<li>산 동물 stereotaxic 장치와 산소와 isoflurane (1-2%)의 혼합물을 사용 하 여 보충 마 취에서. 관심의 영역 두 피에 절 개를 확인 하 고 수행 craniotomy 플을 수용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>광학 섬유9 와 microendoscope 렌즈10 이전 게시 절차에 따라 이식. 핸들 식은 주의 실크/AAV 예금은 불완전 craniotomy, 또는 임 플 란 트 두개골의 가장자리에 의해 떨어져 나 수 있습니다로. 뇌에는 임 플 란 트를 천천히 낮은 (~ 2 m m/분).</li>
	<li>8이전 설명으로 임 플 란 트 두개골 창. 윈도우의 코팅된 면을 터치 고이 바이러스를 씻어 수 있습니다 gavage, 수행 하는 경우 액체와 창을 rinsing 방지 하지. 최대한 식을 달성 하는 durotomy를 수행 합니다.</li>
</ol>7. 식의 계산 및 문제 해결
<ol><li>평가 virally 표현 단백질의 표현, 하 수 ~ 2-3 주 식 드라이브 다음 인산 염에 4 %paraformaldehyde intracardial 관류를 수행 하는 바이러스에 대 한 버퍼링 염11 및 프로세스 뇌 조직의 형광에 대 한 현미경 검사 법12.</li>
	<li>형광 현미경 fluorophore 태그 optogenetic 단백질의 표정 패턴 이미지를 사용 하 여 식을 평가 합니다.</li>
	<li>실크/AAV 코팅의 총 볼륨을 증가 하거나 선호 높은 titer 바이러스를 사용 하 여 식의 수준이 충분 하지 않을 경우 코팅에 바이러스의 양을 증가.</li>
</ol>

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<li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

실크/optogentic 단백질의 표현 대상으로 AAV를 사용 하 여 현재 사용 중인 접근법의 한계를 극복 한다. 많은 연구에서는 성공적으로 AAV 주사를 사용 하 여 optogenetic 단백질을 표현 하기 위해, 비록 식 광 섬유의 끝에, 테이퍼 섬유의 길이 주변 지역 그리고 미소 렌즈의 보기 영역에 맞게 도전 이다. 광학 부품 및 optogenetic 식 사이의 부정합, 인해 stereotaxic 주사 신뢰할 수 있는, 수 고 많은 실험 실패. 실크/AAV 방법 우리가 여기 설명 라벨에이 문제를 해결 합니다. 그것은 또한 두 번째 수술 단계를 제거 하 여 및 경우에 따라 두 번째 수술에 대 한 필요성을 제거 절차를 간소화 합니다. 그것은 바이러스 두개골 창 아래 광범위 하 게 식을 사용 하 여 또한 어려울 수 있습니다 그리고 일반적으로 여러 위치에 바이러스를 주입 하 긴 수술을 수행 하는 실험. 실크/AAV와 단순히 코팅 두개골 windows에서 큰 대뇌 피 질의 영역에 광범위 한 식을 얻을 수 많은 침략 주사에 대 한 필...

지난 10 년간 모니터링 및 신경 활동1조작에 대 한 설계 빛에 민감한 단백질의 폭발을 생산 하고있다. 바이러스는 뇌에서 이러한 optogenetic 도구를 표현 하기 위한 탁월한 유연성을 제공 합니다. 유전자 변형 동물에 비해, 바이러스까지 쉽게 생산, 수송, 저장, 최신 optogenetic 도구 빠른 구현을 허용 하는. 식 유전자 뚜렷한 신경 인구를 대상 수 있습니다 그리고 역행 수송을 위해 고안 된 바이러스도 대상으로 신경 연결2를 기반으로 식에 사용할 수 있습니다.
바이러스는 일반적으로 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 stereotaxic 주사와 함께 도입 됩니다. 정확 하 게 작은 영역을 대상으로 어려울 수 있습니다, 하지만 종종 넓은 지역에 식 운전 많은 주사. 또한, 광학 장치 이후에 빛 vivo에서제공 하는 두뇌에 심은 경우는 임 플 란 트 정렬 되어야 합니다 제대로 바이러스 주입으로. 여기, 이식된 장치 실크 fibroin 영화3를 사용 하 여 주위 조직에 바이러스 성 벡터를 제공 하기 위한 쉽게 구현 하는 방법을 설명 합니다. 실크 fibroin 상용, 신경 조직에 의해 잘 용납 이며 다양 한 특성을 가진 재료를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다. 실크 영화 microinjection 펫 같은 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여 임 플 란 트에 적용할 수 또는 펫 손. 실크/AAV 영화 두 수술 절차에 대 한 요구를 제거 하 고 바이러스 중재 식 광학 임 플 란 트에 제대로 정렬입니다. 결과 식이 섬유, 그리고 stereotaxic 주사 보다 섬유 트랙을 따라 덜 원치 않는 식에는 결과의 끝에 제한 됩니다.
대상된 표현의 끝에 작은 섬유 생산, 뿐만 아니라 실크/AAV 영화를 광범위 하 게 사용할 수 있습니다 (> 3 m m 직경) 두개골 창 아래 피 질 식. 형광 활동 센서의 2 광자 영상 vivo에서 감각 및 인지 처리 운전에 신경 활동의 역할을 평가 하기 위한 필수적인 도구 되고있다. 그러나, 동일한 드라이브에 광범위 한 대뇌 피 질의 영역, 자주 경험 식 여러 주사를 수행 합니다. 이러한 주사 매우 시간이 오래 걸릴 수 있으며 보기의 필드에 걸쳐 일치 하지 않는 식으로 이어질 수 있습니다. 반면, 실크/AAV 코팅 두개골 윈도우는 매우 쉽게 제조, 크게 수술에 필요한 시간을 줄일 수 및 가장 눈에 띄게 표현 수백 미크론 대뇌 피 질의 표면 아래 드라이브.

<table><tbody><tr><td>수성 실크 피브로인</td><td>시그마</td><td>5154-20ML</td><td>필름 제작용 수성 실크 피브로인(5% w/v)</td></tr><tr><td>실크/AAV</td><td>드러먼드</td><td>3-000-207</td><td>나노젝트 III 나노리터 주입기</td></tr><tr><td>임플란트를 보관하기 위한 매니퓰레이터</td><td>Narashige</td><td>MM-33</td><td>마이크로 매니퓰레이터</td></tr><tr><td>실크 침전물을 시각화하기 위한 입체 렌즈</td><td>AmScope</td><td>SM-6TX-FRL</td><td>3.5X-45X 링 라이트가 있는 삼안 관절 줌 현미경</td></tr><tr><td>임플란트를 보관하기 위한 진공 챔버</td><td>Ablaze</td><td>N/A</td><td>3.5쿼트 진공 진공 Vac 탈기 챔버</td></tr><tr><td>옵션, 보관용 임플란트 홀더</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>미리 만들어진 광섬유를 보관하려면 페룰 직경보다 약간 큰 직경의 ~4mm 깊이의 구멍 그리드를 플라스틱 블록에 뚫습니다.</td></tr><tr><td>광섬유</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>&Oslash; 200 &마이크로; m 섬유 임플란트용 코어 다중 모드 광섬유</td></tr><tr><td>페룰</td><td>Kientec</td><td>FZI-LC-230</td><td>LC 섬유 임플란트용 지르코니아 페룰</td></tr><tr><td>만성 섬유 임플란트 제조를 위한 다양한 재료</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td>자세한 절차는 Ung K, Arenkiel BR. 뇌 조직의 만성 광유전학 자극을 위한 광섬유 이식을 참조하십시오. 시각화 된 실험 저널 : JoVE. 2012년(68).</td></tr><tr><td>테이퍼 섬유 임플란트</td><td>Optogenix</td><td>Lambda-B</td><td>테이퍼 섬유 임플란트</td></tr><tr><td>GRIN 렌즈</td><td>GoFoton</td><td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td><td>GRIN 렌즈</td></tr><tr><td>소형 유리 두개골 창</td><td>Warner</td><td>64-0726 (CS-3R-0)</td><td>소형 원형 커버 유리, # 0 두께</td></tr><tr><td>대형 유리 두개골 창</td><td>Warner</td><td>64-0731 (CS-5R-0)</td><td>소형 원형 커버 유리, # 0 두께</td></tr><tr><td>두개골 창 제조를 위한 다양한 재료</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td>자세한 절차는 Goldey GJ et al. 깨어 있는 마우스의 장기 이미징을 위한 이동식 두개골 창을 참조하십시오. 자연 프로토콜. 2014 년 11 월; 9(11):2515.</td></tr></tbody></table>

vivo에서 실크/aav 영화를 사용 하 여 optogenetic 단백질의 표적으로 표현

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

드라이브 동작 출력 하기 위해서는 프로세스 정보를 크게 조작 하 고 신경 비보의 활동을 모니터링에 대 한 최근 개발 된 광학 방법으로 지원 되었습니다 어떻게 신경 회로 이해 하는 탐구. 두 가지 주요 구성 요소에 의존 하는 이러한 유형의 실험: 두뇌에 광 액세스를 제공 하는 1) 이식 장치 및 신경 흥분을 변경 또는 신경 활동의 판독을 제공 하는 2) 빛에 민감한 단백질. 빛에 민감한 단백질을 표현 하는 방법의 수 있지만 바이러스 성 벡터의 stereotaxic 주입은 현재 가장 유연한 접근 식 유전, 해부학, 그리고 시간적 정밀도로 제어할 수 있기 때문에. 바이러스 성 벡터의 위대한 유틸리티에 불구 하 고 제공 하는 바이러스 광학 임 플 란 트 포즈의 사이트에 수많은 도전을. Stereotaxic 바이러스 주사는 수술 수술 시간을 증가, 연구, 비용 증가 및 동물의 건강에 위험이 포즈를 요구 하 고 있다. 주입 주사기와 높은 titer 바이러스의 bolus의 갑작스러운 납품으로 인 한 면역성 염증 주변 조직은 물리적으로 손상 될 수 있습니다. 작은 영역을 대상으로 주사 광학 임 플 란 트를 정렬 하는 것은 특히 어려운 뇌에 깊은. 이러한 과제를 극복 하기 위해 여러 유형의 영화 실크 fibroin 및 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 구성된으로 광학 임 플 란 트를 코팅 하는 방법을 설명 합니다. Fibroin, 누에나방, 누에고치에서 파생 된 폴리머 캡슐화 할 수 있습니다 및 생체를 보호 하 고 수용 성 필름에서 도자기까지 양식에 처리할 수 있습니다. 뇌에 이식, 실크/AAV 코팅 식이 필요한 곳에 정확 하 게 운전 하는 광학 요소와 주변 뇌 사이의 인터페이스에서 바이러스를 해제 합니다. 이 메서드는 쉽게 구현 되며 크게 신경 회로 기능 vivo에서 연구를 촉진 하는 약속.

평가 식에서 실크/AAV 영화의 성공, 우리 끼얹는다 동물 이식 후 2-3 주 하 고 관심의 영역에서 두뇌 분할 영역을 준비. Fluorophore 태그 optogenetic 단백질 (YFP ChR2)의 형광 이미지 (그림 1D) 표현의 넓이의 측정을 제공합니다. 일반적인 광학 섬유 (230 µ m 직경) 쉽게 200을 수용할 수 있는 실크/AAV의 nL. 연습, 경험 이식된 섬유 (그림 5)의 신뢰할 수 있는 식 팁 주위를 얻을 수 있습니다.
평가 식 두개골 창 실크/AAV 코팅에 의해 구동, 이미징 이식 후 7-10 일을 시작 합니다. 우리는 시각화에 대 한 2 광자 영상을 사용 하지만 형광 이미징는 CCD와 같은 다른 방법을 사용할 수도. 코팅 두개골 ...

여기, 우리는 바이러스 성 식 벡터 실크 fibroin 영화를 사용 하 여 뇌에 전달 하는 방법을 제시. 이 메서드는 식 벡터 실크/AAV 코팅된 광섬유, 광섬유 테이퍼 및 두개골 창 사용의 대상된 배달 수 있습니다.

Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

이 방법은 시스템 신경 과학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 신경 앙상블의 활동이 뇌의 감각 및 인지 처리를 지원하는 방법과 같은. 이 기술의 주요 장점은 별도의 바이러스 주입 절차를 요구하지 않고, 관심의 뇌 영역에 찬 rhodopsin 및 GCaMP 같은 광유전학 적 단백질의 정확한 타겟팅을 용이하게한다는 것입니다.이 방법의 시각적 데모는 실크와 바이러스를 작은 광학 임플란트에 증착하는 것이 재현 가능한 결과를 달성하기 위해 몇 가지 연습을 할 수 있기 때문에 중요합니다. 먼저, 200 마이크로리터 PCR 튜브에서 AAV와 5~7%의 수성 실크 섬유신을 1대 1 비율로 혼합한다. 부드럽게 철저하게 AAV와 섬유를 혼합하기 위해 여러 번 용액을 피펫.실크/AAV를 증착하려면 파이펫 막힘으로 인한 손실을 수용하기 위해 섬유 임플란트 수에 필요한 용액의 양을 주입 파이펫으로 적재합니다. 다음으로, 마이크로인젝터가 장착된 스테레오탁스 장치에 ferrule 홀더를 장착합니다. 페룰 홀더를 마이크로인젝터 위에 놓고 아래에서 실크/AAV 혼합물을 적용합니다.분사 파이펫이 광섬유 표면의 중심을 만지거나 거의 닿을 때까지 기동하고 실크/AAV 용액의 10~20나노리터를 배출합니다. 그런 다음 파이펫을 철회합니다. 다음으로, 약 1 분 이내에 평평한 필름에 건조 액체 돔으로 나타나는 평평한 표면에 실크 / AAV의 볼러스를 관찰한다.원하는 양의 실크/AAV가 증착될 때까지 이전 단계를 반복합니다. 여러 개의 임플란트를 준비할 때 실크/AAV 용액을 한 임플란트에 적용한 다음 다른 임플란트를 코팅한 다음 첫 번째 임플란트로 돌아갑니다. 1시간 동안 건조한 후 전체 페룰 홀더를 진공 챔버에 넣고 밤새 약 125도, 섭씨 4도에 진공 데리케이트를 진공 데리케이트에 넣습니다.다음 날, 고출력 현미경으로 생성된 실크 필름의 모양과 위치를 평가한다. 필름이 광학 섬유 표면의 끝에 국한되어 있는지, 상대적으로 얇고 대칭적이지 확인합니다. 테이퍼 광섬유 코팅의 경우, 테이퍼의 시작 부분에 광학 섬유의 측면에 실크 / AAV 사출 파이펫을 배치하여 파이펫이 광섬유에 닿는지 확인합니다.실크/AAV의 20나노리터를 배출하여 코팅 공정을 시작하여 액적이 광섬유에 부착되어 섬유및 파이펫의 인터페이스에 남아 있는지 확인합니다. 실크/AAV가 건조할 때 액적을 섬유 팁 의 끝쪽으로 부드럽게 심고, 파이펫 팁을 막히지 않도록 건조 물방울과 접촉하여 사출 파이펫을 유지합니다. 첫 번째 볼루스가 거의 완전히 건조되면 다른 20 나노 리터를 꺼내 테이퍼를 따라 물방울을 계속 사수하십시오.소량의 실크/AAV를 배출하고 용액을 테이퍼 의 측면까지 점진적으로 건조시킴으로써 이전 단계를 반복하십시오. 건조 후, 고출력 현미경으로 생성된 실크 필름의 모양과 위치를 평가한다. GRIN 렌즈 임플란트코팅의 경우, GRIN 렌즈 임플란트에 단 하나의 주사로 실크/AAV를 증착하십시오.건조 후, 필름이 렌즈의 표면을 커버할 수 있도록 고출력 현미경으로 생성된 실크 필름의 모양과 위치를 평가한다. 유리 두개골 창을 코팅하기 위해 실크/AAV 5마이크로리터 액정을 3mm 원형 커버 슬립 표면에 손으로 피펫하여 액적이 유리 표면 전체를 덮습니다. 건조 후, 장치를 이식하기 전에 냉각 된 진공 건조기125 및 섭씨 4도에 실크 / AAV 코팅 광섬유를 보관하십시오.형광소 태그가 붙은 광유전학 단백질의 형광 이미지는 실크/AAV 필름의 발현 정도의 척도를 제공했으며, 전형적인 광섬유는 실크/AAV의 200나노리터를 쉽게 수용할 수 있다. 실험을 통해 이식된 섬유의 끝 부분에 대해 매우 신뢰할 수 있는 발현을 달성할 수 있습니다. 코팅 된 두개골 창의 두 가지 가능한 문제는 표현이 충분하지 않으며 녹지 않는 실크 필름이 시야를 모호하게합니다.발현을 증가시키기 위해, 동절제술은 창을 이식하기 전에 수행될 수 있고, 및/또는 필름에 바이러스의 양을 증가시킬 수 있다. 실크와 스톡 티터 AAV의 1~4개의 혼합물을 사용하여 최상의 표현을 달성했습니다. 코팅된 창문의 실크의 양은 섬유 임플란트보다 10~100배 더 많으며, 필름은 조직에 덜 내장되어 있어 실크 필름을 용해시킬 수 있는 동일한 수준의 프로테오리틱 활동에 노출되지 않을 수 있다.그러나, 일부 실크의 존재는 창 아래 표정을 달성 하는 데 필수적 이다, 바이러스 혼자 만든 필름 수술 하는 동안 중간 액체에 의해 씻겨 있기 때문에 가능성이. 이 절차를 시도하는 동안 실크 코팅 임플란트를 우리가 설명하는 방식으로 준비하고 저장하는 것이 중요합니다. 부적절한 보관은 실크 필름의 특성을 변경하거나 바이러스 성 발현 벡터의 효능을 감소시킬 수 있습니다.이 기술은 신경 활동이 마우스, 쥐, 또는 비인간 영장류와 같은 포유동물의 두뇌에 있는 감각 및 인식 처리를 어떻게 유도하는지 탐구하는 시스템 신경 과학의 필드에 있는 연구원을 위한 중대한 유용할 수 있습니다. 바이러스 성 발현 벡터로 작업하는 것은 장갑, 고글 및 실험실 코트와 같은 위험하고 개인 보호 장비가 될 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

이 프로토콜은 광유전학적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 성공적으로 수행하는 데 필요한 단계와 데이터 분석을 설명합니다. ofMRI는 고자기장 fMRI 판독과 광유전학적 자극을 결합한 새로운 기술로, 살아있는 뇌 전체에 걸쳐 기능적 신경 회로와 그 역학의 세포 유형별 매핑을 가능하게 합니다.

Optogenetic 기능 MRI

여기에서, 우리는 마카크 두뇌에 있는 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적 표현을 달성하기 위한 효율적이고 간단한 접근으로 피질로 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도된 대류 강화한 납품 (CED)를 보여줍니다.

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

현재 시행 된 바와 같이, 인간이 아닌 영장류의 광유전학은 바이러스 벡터를 뇌에 주입해야합니다. 최적의 주입 방법은 신뢰할 수 있어야 하며 많은 응용 분야에서 사후 조직학에서 쉽고 명확하게 식별되는 임의의 깊이의 개별 부위를 표적으로 삼을 수 있어야 합니다. 이러한 특성을 갖는 주입 방법이 제시된다.

마취 및 깨어 있는 행동하는 비인간 영장류 뇌에서 광유전학을 위한 AAV 벡터 주사

이 프로토콜은 새로운 rAAV 기반 과도 인핸서-리포터 분석을 설명합니다. 이 분석은 마우스 뇌 에서 생체내에서 인핸서 구동 발현을 유도하는데 사용될 수 있다.

마우스 뇌 에서 생체 내 인핸서 기반 발현 구조체의 AAV 배포

생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

망막하 주사는 광수용체 및 RPE 질환에 대한 치료제의 전임상 개발에 없어서는 안 될 기술입니다. 우리는 수술 중 성공률을 향상시키고 망막 손상을 최소화하는 마우스에서 최적화된 경공막 망막하 주사 기술을 설명합니다.

마우스에서 최적화된 최소 침습 경공막 망막하 주사 기술

배우세요 실크 섬유소 필름을 이용한 AAV 바이러스 벡터 뇌 전달 기법으로 옵토제네틱 단백질을 정확히 표적화하는 방법입니다. 이 기술은 별도의 바이러스 주사 없이 신경 회로 연구를 가능하게 합니다.

Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현

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