Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현

이 방법은 시스템 신경 과학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 신경 앙상블의 활동이 뇌의 감각 및 인지 처리를 지원하는 방법과 같은. 이 기술의 주요 장점은 별도의 바이러스 주입 절차를 요구하지 않고, 관심의 뇌 영역에 찬 rhodopsin 및 GCaMP 같은 광유전학 적 단백질의 정확한 타겟팅을 용이하게한다는 것입니다.

이 방법의 시각적 데모는 실크와 바이러스를 작은 광학 임플란트에 증착하는 것이 재현 가능한 결과를 달성하기 위해 몇 가지 연습을 할 수 있기 때문에 중요합니다. 먼저, 200 마이크로리터 PCR 튜브에서 AAV와 5~7%의 수성 실크 섬유신을 1대 1 비율로 혼합한다. 부드럽게 철저하게 AAV와 섬유를 혼합하기 위해 여러 번 용액을 피펫.

실크/AAV를 증착하려면 파이펫 막힘으로 인한 손실을 수용하기 위해 섬유 임플란트 수에 필요한 용액의 양을 주입 파이펫으로 적재합니다. 다음으로, 마이크로인젝터가 장착된 스테레오탁스 장치에 ferrule 홀더를 장착합니다. 페룰 홀더를 마이크로인젝터 위에 놓고 아래에서 실크/AAV 혼합물을 적용합니다.

분사 파이펫이 광섬유 표면의 중심을 만지거나 거의 닿을 때까지 기동하고 실크/AAV 용액의 10~20나노리터를 배출합니다. 그런 다음 파이펫을 철회합니다. 다음으로, 약 1 분 이내에 평평한 필름에 건조 액체 돔으로 나타나는 평평한 표면에 실크 / AAV의 볼러스를 관찰한다.

원하는 양의 실크/AAV가 증착될 때까지 이전 단계를 반복합니다. 여러 개의 임플란트를 준비할 때 실크/AAV 용액을 한 임플란트에 적용한 다음 다른 임플란트를 코팅한 다음 첫 번째 임플란트로 돌아갑니다. 1시간 동안 건조한 후 전체 페룰 홀더를 진공 챔버에 넣고 밤새 약 125도, 섭씨 4도에 진공 데리케이트를 진공 데리케이트에 넣습니다.

다음 날, 고출력 현미경으로 생성된 실크 필름의 모양과 위치를 평가한다. 필름이 광학 섬유 표면의 끝에 국한되어 있는지, 상대적으로 얇고 대칭적이지 확인합니다. 테이퍼 광섬유 코팅의 경우, 테이퍼의 시작 부분에 광학 섬유의 측면에 실크 / AAV 사출 파이펫을 배치하여 파이펫이 광섬유에 닿는지 확인합니다.

실크/AAV의 20나노리터를 배출하여 코팅 공정을 시작하여 액적이 광섬유에 부착되어 섬유및 파이펫의 인터페이스에 남아 있는지 확인합니다. 실크/AAV가 건조할 때 액적을 섬유 팁 의 끝쪽으로 부드럽게 심고, 파이펫 팁을 막히지 않도록 건조 물방울과 접촉하여 사출 파이펫을 유지합니다. 첫 번째 볼루스가 거의 완전히 건조되면 다른 20 나노 리터를 꺼내 테이퍼를 따라 물방울을 계속 사수하십시오.

소량의 실크/AAV를 배출하고 용액을 테이퍼 의 측면까지 점진적으로 건조시킴으로써 이전 단계를 반복하십시오. 건조 후, 고출력 현미경으로 생성된 실크 필름의 모양과 위치를 평가한다. GRIN 렌즈 임플란트코팅의 경우, GRIN 렌즈 임플란트에 단 하나의 주사로 실크/AAV를 증착하십시오.

건조 후, 필름이 렌즈의 표면을 커버할 수 있도록 고출력 현미경으로 생성된 실크 필름의 모양과 위치를 평가한다. 유리 두개골 창을 코팅하기 위해 실크/AAV 5마이크로리터 액정을 3mm 원형 커버 슬립 표면에 손으로 피펫하여 액적이 유리 표면 전체를 덮습니다. 건조 후, 장치를 이식하기 전에 냉각 된 진공 건조기125 및 섭씨 4도에 실크 / AAV 코팅 광섬유를 보관하십시오.

형광소 태그가 붙은 광유전학 단백질의 형광 이미지는 실크/AAV 필름의 발현 정도의 척도를 제공했으며, 전형적인 광섬유는 실크/AAV의 200나노리터를 쉽게 수용할 수 있다. 실험을 통해 이식된 섬유의 끝 부분에 대해 매우 신뢰할 수 있는 발현을 달성할 수 있습니다. 코팅 된 두개골 창의 두 가지 가능한 문제는 표현이 충분하지 않으며 녹지 않는 실크 필름이 시야를 모호하게합니다.

발현을 증가시키기 위해, 동절제술은 창을 이식하기 전에 수행될 수 있고, 및/또는 필름에 바이러스의 양을 증가시킬 수 있다. 실크와 스톡 티터 AAV의 1~4개의 혼합물을 사용하여 최상의 표현을 달성했습니다. 코팅된 창문의 실크의 양은 섬유 임플란트보다 10~100배 더 많으며, 필름은 조직에 덜 내장되어 있어 실크 필름을 용해시킬 수 있는 동일한 수준의 프로테오리틱 활동에 노출되지 않을 수 있다.

그러나, 일부 실크의 존재는 창 아래 표정을 달성 하는 데 필수적 이다, 바이러스 혼자 만든 필름 수술 하는 동안 중간 액체에 의해 씻겨 있기 때문에 가능성이. 이 절차를 시도하는 동안 실크 코팅 임플란트를 우리가 설명하는 방식으로 준비하고 저장하는 것이 중요합니다. 부적절한 보관은 실크 필름의 특성을 변경하거나 바이러스 성 발현 벡터의 효능을 감소시킬 수 있습니다.

이 기술은 신경 활동이 마우스, 쥐, 또는 비인간 영장류와 같은 포유동물의 두뇌에 있는 감각 및 인식 처리를 어떻게 유도하는지 탐구하는 시스템 신경 과학의 필드에 있는 연구원을 위한 중대한 유용할 수 있습니다. 바이러스 성 발현 벡터로 작업하는 것은 장갑, 고글 및 실험실 코트와 같은 위험하고 개인 보호 장비가 될 수 있다는 것을 잊지 마십시오.