Name: 안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 T4 리게이션과 변성 PAGE를 이용한 원형 DNA 정제 및 DNA 나노구조 분석 방법. 이 단순하고 견고한 프로토콜은 대부분의 연구실에서 활용 가능하며 1D 및 2D DNA 나노구조 시각화에 적용됩니다.

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우리는 NSFC (보조금 번호 91753134 및 21571100), 그리고 국가 열쇠 실험실의 Bioelectronics의 동남 대학에서 재정 지원에 대 한 감사.

1입니다. 원형 DNAs의 준비
<ol><li>더 정화 없이 직접 상업 회사에서 제공 하는 모든 선형 DNAs를 사용 합니다.</li>
	<li>DNA 샘플 튜브의 하단에 모든 DNA 알갱이 수집을 5 분 동안 5000 × g에서 원심 DNA를 분해 하 테 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>260에 마이크로 UV 분석기를 사용 하 여 각 ss DNA 솔루션에 대 한 "a" ng / µ L의 농도 측정 nm. "B" µ M를 "a" ng / µ L를 변환 b 다음3 × 10 = (분자량의 DNA 가닥) /. 10 µ M DNA 재고 솔루션을 만들기 위해 테 솔루션의 양을 조정 합니다.</li>
	<li>T4 DNA 리가 사용 하 여 연결 하는 5'-phosphorylated 선형 DNA 템플릿 ( 그림 1) c64nt, c74nt 및 상업 회사에서 직접 제공 하는 c84nt의 3'와 5' 끝.</li>
	<li>5'-phosphorylated 선형 DNA 가닥 (3.5 µ M)과 그 해당 부 목 DNA 가닥 (4.5 µ M) 200 µ L PCR 테스트 튜브15에서 80 µ L TE 버퍼에 혼합. 95 ° C 물이 가득한 열린 열 병에 튜브를 품 어. 실험실 분위기에서 약 2-3 시간 동안 실내 온도 (25 ° C) 뜨거운 물 식혀.</li>
	<li>10 x T4 버퍼 (660 mM Tris HCl, 66 mM MgCl2, 100mm DTT, 1mm ATP)의 10 µ L을 추가 하 고 T4 리가 (300 U / µ L) 100 µ L의 최종 볼륨을 혼합물에의 10 µ L 16 ° c.에 16 시간 동안 한 thermocycler에 혼합물을 품 어 참고: 위의 DNA 농도 반응 볼륨 ~ 100 µ L의 결 찰 높은 효율성과 올바른 올리고 단위체 cyclization의 높은 수익률에 대 한 최적화 됩니다. 실험 설계에 따라 동시에 결 찰 반응의 두 개 이상의 튜브를 실행 합니다. 결 찰 교체 단계 1.6에 대 한 대체 인큐베이션 절차는 25 ° c.에서 4 시간</li>
	<li>부 화 후 5 minminutes 95 ° C 물에 T4 리가 비활성화. 얼음 물 목욕 튜브 전송 그리고 냉각 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>10 µ L의 Exonuclease 나 버퍼링 x 10과 Exonuclease의 10 µ L 추가 나 (5 U / µ L) 담금질된 혼합물에 및 선택적으로 나머지 선형 DNAs를 소화 하 고 circularized DNAs를 그대로 30 분 물 목욕에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.</li>
	<li>페이지 젤을 변성 시키기 10%를 준비 합니다.<ol>
<li>증기 두건에서 페이지 젤을 준비할 때 고무 장갑 및 고글을 착용. 6.67 mL의 30% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (19:1), 10의 2 개 mL를 추가 x TAE· Mg 버퍼 (40 m m Tris, 40mm HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 m m Mg(Ac)2), 8.4 g의 요소 (7 M)와 이온된 물 40 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 최종 볼륨을. 주의: 30% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (19:1) 솔루션은 독성.</li>
		<li>Tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 µ L을 추가 하 고 40 mL를 염화 persulfate (AP, 10 %w / v)의 100 µ L 튜브 전송 되기 전에 젤 솔루션 전기 시스템을 즉시. 1.5 m m 두께 10-잘 빗을 삽입 합니다. 젤 솔루션 경화 될 때까지 20 분 이상 기다립니다.</li>
		<li>85 × 80 × 1.5 m m의 젤 80 V의 정 전압 설정3 (폭 × 높이 × 두께). 1 x TAE· 추가 전기 시스템 및 prerun 10 V/cm에서 20 분 동안 젤 Mg 버퍼입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>95에서 단계 1.8에서 PCR 테스트 튜브를 넣어 ° C 물 Exonuclease 비활성화를 5 분에 대 한 나. 그런 다음 얼음 물 목욕 튜브를 전송 하 고 또 다른 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>140 µ L의 최종 볼륨을 튜브에 formamide의 20 µ L을 추가 하 고 솔루션을 혼합. 잘 7-9 16-20 µ L 각 젤와 동등 하 게 변성 페이지 젤 웰 스에 솔루션을 배포 합니다. 염료 (0.05 %bromophenol 블루, 0.05% 자일 렌 cyanol FF, 60% 글리세롤, 10 mM Tris HCl, 60 m EDTA, pH 7.6 m)와 해당 전조 선형 DNA의 8 µ L 로드의 믹스 2 µ L (10 µ M) 참조에 대 한 별도 잘에 혼합물을 주입 하는 고. 참고: formamide의 추가 페이지 젤 하단에 잘 침 몰을 위한 로드 솔루션의 밀도 증가 하 고 또한 일부 이중 연관을 해제 하려면 DNA 잔류물을 좌초.</li>
	<li>10 V/cm에서 약 2 시간을 위한 젤을 실행 하 고 자일 렌 cyanol FF에서 맨 눈으로 유리 접시의 2/3 위치에 때 실행을 중지.</li>
	<li>고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 유리 접시에서 젤을 가져가 라. 젤 형광 TLC (박막 크로마토그래피) 접시에 놓습니다. 면도날에 의해 대상 젤 밴드 차단으로 정확 하 게 UV 방사선 (그림 2)에 의해 숨겨진. 주의: UV 빛은 눈과 피부에 유해 이다. 참고: 254에서 UV 방사선에서 nm, DNA는 빛을 흡수 하 고 TLC 판에 그림자. 원형 DNA의 해당 전조 선형 DNA 보다 약간 느리게 달렸다. 그들은 수집 하는 경우 일부 소화 되지 않은 선형 DNAs 및 숨겨진된 대상 밴드를 둘러싸고 소량에 원치 않는 원형 DNAs 원형 DNA를 오염 됩니다.</li>
	<li>2.0 mL microcentrifuge 튜브로 젤 밴드를 전송 합니다. 공기 건조 또는 타격 젤 밴드 건조 하 고 붙여넣기로 젤 주걱 또는 일반된 유리 막대에 의해 매 시. 젤은 완전히 짓 눌린 원형 DNA의 높은 수율에 중요 붙여넣기로 다는 것을 확인 하십시오. 튜브에 젤 이온된 볼륨 물의 두 번 추가 하 고 하룻밤 실 온에서 튜브를 흔들어.</li>
	<li>2.0 mL microcentrifuge 튜브에서 supernatants 수집 혼합물을 필터링 합니다. 작은 양의 이온된 물과 supernatants는 결합 하 여 다시 필터와 rinsing 하 여 모든 잔여 DNA를 복구 합니다.</li>
	<li>Eluent을 n butanol의 동일한 볼륨의 압축을 풉니다. 이 절차를 반복 하 여 수성 볼륨 약 200 µ L로 감소 된다.</li>
	<li>500 µ L 절대 에탄올 (−20 ° C)의 추가 20 µ L의 DNA 강수량에 대 한 혼합물에 3 M NaOAc (pH 5.1). 30 분 동안 −20 ° C에 튜브를 저장 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 동안 12000 × g에서 튜브 원심, 삭제는 상쾌한. 나머지 DNA 침전 관에 약 100 µ L입니다.</li>
	<li>튜브를 75% 에탄올 (−20 ° C)의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 −20 ° C에 저장. 다음 4 ° C에서 10 분 동안 12000 × g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다. 나머지 DNA 침전은 다시 튜브에 약 100 µ L 솔루션입니다. 두 번 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>마지막 원심 분리 후 상쾌한 최대한 많이 삭제 합니다. 드라이 진공 집중으로 남아 있다.</li>
	<li>−20 ° c.에 튜브에 순화 된 원형 DNA를 저장</li>
	<li>솔루션을 확인 하려면 10 µ M 원형 DNA 재고 단계 1.3 필요할 때에 따라 테 버퍼에서 원형 DNA를 resuspend.</li>
</ol>2. 어셈블리 솔루션의 어 닐 링
<ol><li>한 냄비 어 닐 링에 대 한 각 타일 또는 nanostructural 어셈블리 솔루션 c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ c64nt, HJ-c84nt, 자 c84nt, cDAO-c64nt, acDAO c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt, 및 acDAO-c64nt-E의 선형 및 원형 DNAs의 설계 된 세트를 준비 합니다.<ol>
<li>각 어셈블리 솔루션에 대 한 10의 2 µ L 믹스 x TAE· Mg 버퍼, 선형 및 원형 가닥 같은 어 금 니 비율 및 0.5 µ M와 20 µ L. 마지막 볼륨 각 가닥의 최종 농도에 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼에 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 1 µ L에서 어셈블리 솔루션 Anneal 한 95 ° C에서 25 ° c 이상 48 h 열 병.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 단계 열 처리에 대 한 선형 및 원형 DNAs의 디자인 세트 cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E, 및 cDAO-c84nt-O의 2D 무한 격자의 각 어셈블리 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>10의 2 µ L를 혼합 하 여 각 전조 하위 타일 어셈블리 솔루션을 준비 x TAE· Mg 버퍼, 동등한 어 금 니 비율은, 선형 및 원형 가닥 및 각 물가 위한 0.5 µ M의 최종 농도 20 µ L의 최종 볼륨을 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 1 µ L. 첫 번째 하위 타일 어 닐 링 단계에서 95 ° C에서 25 ° c 이상 2.5 h 빠른 선형 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 각 전조 하위 타일 솔루션 anneal.</li>
		<li>각 물가 위한 0.25 µ M의 최종 농도에 함께 두 해당 하위 타일 솔루션의 10 µ L를 혼합 하 여 위의 4 개의 무한 한 격자의 각 어셈블리 솔루션을 준비 합니다. 스텝 어 닐 링 하는 두 번째 격자에서 2 h 50 ° C에서 유지 하 고 20 ° C, 총에서 약 24 시간 5 분 당 0.1 ° C의 속도로 냉각의 느린 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 20 µ L 혼합물 anneal. 참고: 두 개의 병렬 실험 실행할 수 있습니다 동시에 또는 연속적으로 각 2D 무한 격자에 대 한 두 번째 어 닐 링 단계에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 단계 열 처리에 대 한 5 × 6 cDAO-c64nt-O 5 × 6 cDAO c74 & c84nt-O의 두 유한 사각형 어셈블리의 어셈블리 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>10의 1 µ L를 혼합 하 여 각 전조 하위 타일 어셈블리 솔루션을 준비 x TAE· Mg 버퍼, 동등한 어 금 니 비율은, 선형 및 원형 가닥 및 각 물가 위한 0.5 µ M의 최종 농도 10 µ L의 최종 볼륨을 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 0.5 µ L. 첫 번째 어 닐 링 단계에서 95 ° C에서 25 ° c 이상 2.5 h 빠른 선형 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 각 전조 하위 타일 솔루션 anneal.</li>
		<li>32 (각 하위 타일 솔루션의 2 µ L) x ~ 15의 최종 농도 200 µ L PCR 테스트 튜브에 함께 혼합 하 여 각 유한 사각형 격자 어셈블리 솔루션을 준비 각 하위 타일과 64 µ L의 최종 볼륨에 대 한 nM. 2 어 닐 링 단계에서 2 h 50 ° C에서 유지 하 고 총 24 시간 약 20 ° C, 5 분 당 0.1 ° C의 속도로 냉각의 느린 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에 64 µ L 혼합물 anneal. 참고: 5 병렬 실험 실행할 수 있습니다 동시에 또는 연속적으로 두 번째 어 닐 링 단계에서 각 유한 사각형 어셈블리에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 기본 페이지 분석
<ol><li>10% 기본 페이지 준비 다음 단계 1.9 요소 구성 요소를 제외 하 고.</li>
	<li>C64bp 및 c84bp 컨트롤 샘플에 대 한 각 어셈블리 솔루션의 2 µ L와 별도로 염료 테 버퍼의 3 µ L 컨트롤로 로드의 1 µ L를 추가 합니다. 그림 3에 나열 된 다른 어셈블리의 각 각 어셈블리 솔루션의 1 µ L 및 염료 테 버퍼의 4 µ L 로드의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>젤을 위의 솔루션을 잘 주사. 참조에 대 한 별도 잘에 DNA 마커 (25-500 bp)의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>얼음 물 목욕에서 10 V/cm에서 약 4 시간 동안 젤을 실행 합니다. 크 실 렌 cyanol ff로 유리 접시 밖으로 실행 됩니다.</li>
	<li>고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 유리 접시에서 젤 하 고 30 분 동안 핵 산 젤 얼룩의 10 µ L로 이온 물 100ml에 담가. 주의: 핵 산 젤 얼룩 솔루션 독성이 있다.</li>
	<li>자외선 이미징 시스템에서 젤을 관찰 하 고 얼룩진된 젤 (그림 3)의 사진의 찍을.</li>
</ol>4입니다. 유한 격자의 정화
<ol><li>기본 2 %agarose 젤 전기 이동 법 정화 유한 격자의 준비.<ol>
<li>Agarose 분말, 10의 5 mL의 1 g 믹스 x TBE· Mg 버퍼 (89 m m Tris, 89 m m 붕, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 m m Mg(Ac)2), 핵 산의 2 µ L 얼룩 및 250 mL 삼각형 병에 이온된 수의 47.5 mL 젤. 작고 조밀한 거품 될 때까지 혼합물 삶아. 50 mL의 총 볼륨을 2 %agarose 농도 병에 온수를 추가 합니다.</li>
		<li>두꺼운 장갑을 착용 한다. 1 c m3 (폭 × 길이 × 두께) x 10 x 7의 플라스틱 젤 상자에 젤 솔루션을 붓는 다. 1.5 m m 두께 12-잘 젤 빗을 삽입 합니다. 실내 온도에 냉각 젤을 기다립니다. 필요한 경우 4 ℃ 냉장고에 젤을 넣어. 주의: 끓는 솔루션은 매우 뜨거운 때문에 알고 있어야 합니다.</li>
		<li>0.5 x TBE· 추가 전기 시스템에 Mg 버퍼입니다. 5 V/cm 50 V의 정 전압에서 얼음 물 탕에서 20 분에 젤을 prerun.</li>
		<li>각 agarose 젤에 2.3 단계에서 잘 준비 하는 유한 격자 솔루션의 20 µ L를 주사 하 고 잘는 별도의 DNA 마커 (100-3000 bp)의 5 µ L를 추가 합니다. 얼음 물 목욕에서 5 V/cm에서 2 h를 위한 젤을 실행 합니다.</li>
		<li>고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 컷 대상 젤 UV 빛 및 조각으로 조각 잘 고를 필터 열8로 짓 눌린된 젤 1000 bp 마커 비슷합니다 위치와 밴드입니다.</li>
		<li>2000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 열을 원심 열을 통해 샘플 솔루션을 추출 합니다. AFM 화상 진 찰에 대 한 솔루션을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>나무 못 강 수에 의해 유한 격자를 정화.<ol>
<li>준비 단계에서 유한 격자 솔루션의 믹스 50 µ L를 동등한 양의 15 %PEG8000 (w/v)와 2.3 버퍼 (20 m m Mg(Ac)2, 5mm 트리 스, 1 mM EDTA와 505 mM NaCl)22. 30 분 동안 4 ° C에서 18000 × g 에서 솔루션 원심</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 못 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 원심 분리를 반복 합니다.</li>
		<li>제거한 후에 상쾌한, 분해 1에서 펠 릿 x TAE· AFM 화상 진 찰에 대 한 Mg 버퍼입니다. 참고: 정화는 5 × 6 cDAO-c64nt-O 및 5 × 6 cDAO c74 AFM 이미지와 다른 응용 프로그램에 대 한 c84nt-O 유한 격자 필요 합니다. 수익률이 너무 낮으면, 원심 분리 속도 증가. 제품 만큼 순수 하지 않으면 4.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. AFM 이미지
<ol><li>C64nt 나노와이어, c84nt 나노와이어, acDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-E(O), 및 cDAO-c84nt-E(O), 무한 한 2D 격자 갓 쪼개진된 운 모 표면에 단련 된 샘플의 2 μ를 입금. 운 모 표면에 DNA 격자의 흡착에 대 일 분 동안 둡니다. 두 번의 이온된 수 100 µ L로 표면 세척 하 고 압축 공기에 의해 건조.</li>
	<li>탭핑 모드 아래 삼각형 AFM 프로브 운 모 표면 스캔 하 여 공기의 무한 한 DNA 격자 들의 AFM 이미지를 얻을. 검색에 대 한 다음 매개 변수를 설정: 스캔 크기 0.5 ~ 5 µ m, 512 라인의 해상도 스캔 하 고 스캔 3.5 hz (그림 4).</li>
	<li>5 × 6의 유한 DNA 격자 cDAO-c64nt-O와 5 × 6 cDAO c74 & c84nt-O 입금 1의 80 µ L x TAE· Mg 갓 쪼개진된 운 모 표면에 버퍼입니다. 다음 버퍼에 한정 된 샘플의 5 µ L를 추가 합니다. 운 모 표면에 DNA 격자의 흡착에 대 일 분 동안 둡니다. 1의 또 다른 50 µ L를 추가 x TAE· AFM 프로브에 Mg 버퍼입니다.</li>
	<li>탭핑 모드 아래 삼각형 AFM 프로브 운 모 표면 스캔 하 여 액체에서 유한 DNA 격자의 AFM 이미지를 얻을. 검색에 대 한 다음 매개 변수를 설정: 스캔 크기 0.5-1 µ m, 256 라인의 해상도 스캔 하 고 스캔 1.5 hz (그림 5).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

작은 원형 DNA 분자의 합성 및 DNA nanostructures의 조립에이 기사 초점에 프로토콜. 무작위로 순서가 DNA 디자인의 대부분은이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 원형 DNAs의 순수성이 DNA 어셈블리의 성공을 위해 중요 합니다. 5'-phosphorylated 선형 DNA;의 농도 낮추는 방법으로 cyclization의 생산 수율을 향상 시킬 수 있습니다. 그러나,이 원형 DNAs의 동일한 금액을 생산 하기 위해 작업 부하를 증가 합니다. 부 목 DNA 물가의 길이 정확한 결 찰 반응에도 영향을, 약 20 뉴클레오티드 되도록 최적화 되어 c64nt 및 c84nt에 대 한 긴.
마그네슘 양이온의 적절 한 농도 (예., 12.5 m m) 동안 솔루션 그리고 어셈블리 형성과 DNA nanostructures의 유지 보수에 대 한 매우 중요 하다. 따라서, 12.5 m m의 마그네슘 양이온 농도의 어 닐 링 과정 동안 항상 유지, 기본 페이지, aga...

DNA 분자 년간 nanostructures의 많은 종류를 만들려고 사용 되었습니다. 전형적인 주제 포함 대 (더블 크로스 오버, antiparallel, 심지어 반 돈다) 및 DAO 타일1,2,3, 스타 타일4,5,,67, 단일 (ss) 타일8,,910및 DNA 종이 접기11,,1213좌초. 이러한 DNA 모티프와 격자는 선형 ss DNAs에서 조립 된다. 최근에, 다른 사람 그리고 우리 모티프, 1 D 나노튜브 및 2D 격자14,15,,1617구축 건설 기계로 원형 ss oligonucleotides의 사용을 보고 있다. C64nt의 센터에서 할러데이 접합 (HJ)18,,1920,21 을 삽입 하 여 두 개의 결합 된 DAO 타일의 쌍 형성된17될 수 있습니다. 이 새로운 cDAO 모티프와 그 파생 상품 안정 되며 2D를 충분히 엄밀한 DNA 격자 3 × 5 µ m2. 이 문서 사용 하 여 안정적인 DNA 복잡 한 분자 하나 원형 비 계 및 다른 선형 스테이플 ss oligonucleotides의 생성으로 정의 된 "원형 타일"의 기간과 "선형 타일", 선형의 완전 한 세트에서 건설 되는의 다른 기간 ss oligonucleotides입니다.
이 프로토콜 건설 기계로 작은 원형 DNA 분자와 DNA nanostructures의 5 종류를 구성 하는 방법을 보여 줍니다: 1) 무한 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어, 2) 무한 한 2D cDAO-c64nt-O 및 cDAO-c64nt-E (-O 5 반 돈다 고-E의 홀수를 나타냅니다 4 반-회전의 짝수 나타냅니다) 격자, 3) 무한 2D cDAO-c84nt-O 및 cDAO-c84nt-E의 격자, 4) 유한 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O 및 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 사각형, 5) 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals ( 를 참조 하십시오 그림 3-5 회로도 도면 및 DNA nanostructures의 위의 5 종류의 이미지에 대 한). 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어는 각각 두 개의 선형 스테이플와 관련 된 각 c64nt 및 c84nt 비 계에서 조립 된다. CDAO-c64nt, acDAO c64nt, cDAO-c74nt, 또는 cDAO c84nt의 각 원형 타일은 각각 c64nt, c74nt, 또는 4 개의 선형 스테이플 c84nt는 해당 비 계에서 소 둔. 무한 한 2D 격자는 동일한 유형의 다른 시퀀스를 두 개의 원형 타일에서 조립 된다. 두 개의 유한 2D 사각형 격자는 각각 32 원형 보조 타일의 두 세트에서 조립 된다. 돈을 저축 하기 위해 단 하나의 시퀀스 c64nt, c74nt, 및 c84nt는 각각 발판으로 다른 돌출부 anneal 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt, 그리고 첫 번째 하위 타일 어 닐 링 단계에서 각각 20 cDAO-c84nt 원형 하위 타일 다음 하는 데 사용 됩니다. 해당 32 원형 하위 타일을 함께 혼합 하 고 두 번째 격자 유한 5 × 6 cDAO-c64nt-O 각각 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 격자, 조립 하는 단계를 어 닐 링을 적용. 그러나 확실히, 그것은 더 많은 돈과 노동력을 요할 것 이다 다르게 시퀀싱 원형 건설 기계 유한 크기 nanostructures의 다양 한 조립 채택 될 수 있습니다. 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals 4 반-회전의 짝수의 선형 연결 한 시퀀싱 비대칭 acDAO c64nt 타일에서 단련 됩니다. CDAO c64nt 및 cDAO-c84nt, 4, 5 반 회전의 홀수는 짝수의 intertile 거리 각각 구분 되는 원형 타일에서 무한 한 2D 격자를 두 가지 방법 있습니다. 전 동일; 정렬 모든 타일을 요구 한다. 후자는 헬리컬 축 따라 두 인접 타일의 얼굴의 교체가 필요합니다. 두 방법 모두 평면 nanoribbons; 생성 됩니다 타일 엄밀 하 고 평면 cDAO c64nt 같은 경우 타일 cDAO-c84nt, 4는 짝수의 intertile 연결 등 한 방향으로 곡선 경우 절반 회전 것 생성 하는 나노튜브, 반면 5는 홀수의 intertile 연결 반 회전의 제거 때문에 평면 nanoribbons를 생산할 예정 이다 곡률 바이어스 곡선된 타일의 대체 정렬에 의해 성장. 원형 타일에서 1d 및 2D DNA nanostructures의 성공적인 어셈블리 나타냅니다이 새로운 접근법의 몇 가지 장점: 안정성 및 선형 타일 위에 원형 타일, 비대칭 nanostructures의 어셈블리에 대 한 카이 랄 타일의 강성과 같은 적용 nanorings 및 nanoribbons, DNA 역학 및 분자 구조, 등등을 이해에 새로운 비전.

<table><tbody><tr><td>T4 리가제</td>, <td>TaKaRa</td>, <td>2011A</td><td></td></tr>, <tr><td>T4 완충액</td>, <td>TaKaRa</td>, <td>2011A,</td><td></td></tr><tr><td>TE 완충액</td>, <td>Sangon</td><td>B548106</td><td></td></tr>, <tr><td>Thermo bottle</td><td>Thermos,</td><td>SK-3000</td><td></td></tr><tr><td>, Thermo cycler,</td><td>Bio Gener</td><td>, GE4852T</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td>, <td>TaKaRa</td>, <td>2650A</td><td></td></tr>, <tr><td>Exonuclease I 완충액</td><td>TaKaRa</td><td>2650A</td><td></td></tr><tr><td>30% (w/v) 아크릴/Bis 용액 (19:1)</td><td>Sangon</td><td>B546016</td><td></td></tr><tr><td>TAE 프리믹스 podwer</td><td>Sangon</td><td>B540023</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2&middot; 4H2O</td><td>난징 화학 시약</td><td>C0190550223</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Sangon</td><td>A510907</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BBI</td><td>A100761</td><td></td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>난징 화학 시약</td><td>13041920295</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>베이징 Liuyi</td><td>DYY-8C</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Sumsung</td><td>DK-S12</td><td></td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>BBI</td><td>A100314</td><td></td></tr><tr><td>DNA 마커 (25 ~ 500 bp)</td> <td>Sangon</td><td>B600303</td><td></td></tr><tr><td>DNA 마커 (100 ~ 3000 bp)</td> <td>Sangon</td><td>B500347</td><td></td></tr><tr><td>로딩 버퍼</td><td>Sangon</td><td>B548313</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 전기 영동 systerm</td><td>베이징 Liuyi</td><td>24DN</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>ASD</td><td>5010-2225</td><td>0.22 &micro; M</td></tr><tr><td>UV 이미징 시스템</td><td>Tanon</td><td>2500R</td><td></td></tr><tr><td>n-부탄올</td><td>Sangon</td><td>A501800</td><td></td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>SCR</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>난징 화학 시약</td><td>12032610459</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>에펜도르프</td><td>원심분리기 5424R</td><td></td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>CHRIST</td><td>RVC 2-18</td><td></td></tr><tr><td>자외선 스펙트럼</td><td>Allsheng</td><td>Nano-100</td><td></td></tr><tr><td>핵산 염색</td><td>Biotium</td><td>16G1010</td><td>GelRed</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Agarose 전기영동 시스템</td><td>베이징 Liuyi</td><td>DYCP-31CN</td><td></td></tr><tr><td>가열판</td><td>Jiangsu Jintan</td><td>DB-1</td><td></td></tr><tr><td>TBE 프리믹스 포드워&nbsp;</td><td>Sangon</td><td>B540024</td><td></td></tr><tr><td>필터 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>7326165</td><td>Freeze 'N Squeeze 컬럼</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Bruker</td><td>Dimension FastScan</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>BBI</td><td>A100159</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Ted Pella</td><td>BP50</td><td></td></tr><tr><td>삼각형 AFM 프로브 in air</td><td>Bruker</td><td>FastScan-C</td><td></td></tr><tr><td>삼각형 AFM 프로브 fulid</td><td>Bruker</td><td>ScanAsyst-fluid+</td><td></td></tr><tr><td>DNA strands</td><td>산곤</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

안정적인 dna 모티프, 1d와 2d nanostructures 작은 원형 dna 분자에서 건설

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

이 문서에서는 작은 원형 DNA 분자의 합성에 대 한 자세한 프로토콜 제공 원형 DNA 모티프와 1d 및 2D DNA nanostructures의 건설의 어 닐 링. 년간, DNA 나노기술의 급속 한 발전은 원본 자료로 선형 DNAs의 사용에 기인 합니다. 예를 들어 DAO (더블 크로스 오버, antiparallel, 이상한 반 회전) 타일은 2 차원 DNA 격자;의 건설을 위한 빌딩 블록으로 잘 알려진 DAO의 핵심 구조 오른손 할머니 매듭을 만드는 2 개의 로프 같은 두 선형 단일 가닥 (ss) oligonucleotides에서 이루어집니다. 여기, DNA 타일 cDAO (결합 된 DAO) 라는 새로운 유형의 c64nt 또는 c84nt의 작은 원형 ss DNA를 사용 하 여 작성 됩니다 (원형 64 나 84 뉴클레오티드) 비 계 물가와 여러 가지 선형 ss-DNAs 주식 가닥으로. 완벽 한 1d 및 2D nanostructures cDAO 타일에서 조립 된다: 무한 나노 와이어, nanospirals, 나노튜브, nanoribbons; 그리고 유한 나노-사각형입니다. 자세한 프로토콜 설명: 1) 준비 T4 리가와 작은 원형 oligonucleotides의 페이지 (polyacrylamide 젤 전기 이동 법)을 변성 시키기 의해 정화, 3) 조립 기본 페이지 분석, 다음 2) 안정적인 원형 타일의 어 닐 링 무한 한 1d 나노 와이어, nanorings, nanospirals, 나노튜브와 nanoribbons, 그리고 유한 2D 나노 사각형의 무한 한 2D 격자 AFM (원자 힘 현미경) 이미징 옵니다. 방법은 간단 하 고, 강력 하 고, 대부분의 실험실에 대 한 저렴 한입니다.

원형 DNA 젤 섬유23,,2425원형 DNA 내부 기 공에 침투 하기 때문에 페이지 (그림 2)을 변성 시키기 및 지진의 전조 선형 DNA 보다 약간 느리게 이동 합니다. 올리고 단위체 cyclization에 대 한 올바른 결 찰 반응 효율 기판 시퀀스 및 농도, 반응 온도, 시간, 등등에 따라 달라 집니다. 선구자 농도 선형 DNA는 약 3.5 μ M, c64nt (또는 c84nt)의 cyclization 제품에서 충분히 높은 고이 프로토콜에 전조 참조 될 수 있습니다 직접 죽어 없이 UV 빛에서 TLC 판에 있는 악대로 그림자. 원형 DNA의 밴드 막연 한 또는 보이지 않는, 결 찰 반응 또는 훨씬 낮은 제품 수율의 실패를 나타내는...

이 문서 T4 결 찰 및 어 닐 링 작은 원형 DNA 분자의 변성 페이지 정화에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 원형 타일, 조립 및 1d 및 2D DNA nanostructures agarose의 AFM 이미지의 기본 페이지 분석 젤 유한 DNA nanostructures의 전기 및 원심 분리 정화입니다.

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

이 방법은 선형 올리고뉴클레오티드, DAS의 소스 재료로부터 DNA 나노기술을 좀 더 원형 DAS로 확장한다. 이러한 기술의 주요 장점은 대부분의 실험실에서 간단하고 견고하며 저렴하다는 것입니다. 원형 DNA 정제를 위해, 20 마이크로리터의 포머미드를 신선하게 준비된 원형 DNA용액에 넣고, 혼합이 있는 140마이크로리터의 최종 부피에 넣습니다.원형 DNA 용액의 16~20마이크로리터를 7~9개의 데나링 PAGE 젤 웰에 로드합니다. 해당 전구체 선형 DNA의 8개의 마이크로리터와 염색제 를 적재하는 2개의 마이크로리터를 혼합하고, 혼합물을 별도의 기준체에 잘 주입한다. 그런 다음 젤을 10볼트퍼센트에서 약 2시간 동안 실행하여 자일렌 시안올 FF가 젤 아래약 3분의 2를 관찰할 수 있을 때 달리기를 중단한다.고무 장갑과 고글을 착용하고 젤을 형광 박층 크로마토그래피 플레이트에 옮기고 면도날을 사용하여 UV 조사에 의해 가려진 대상 젤 밴드를 차단합니다. 젤 밴드를 건조를 위해 2밀리리터 미세원심분리기 튜브에 넣은 다음 말린 젤을 페이스트에 넣고, 실온에서 하룻밤 동안 흔들리기 위해 젤의 두 배에 이온화 물을 넣습니다. 다음 아침, 혼합물을 2밀리리터 미세원심분리기 튜브로 필터링하여, 잔류 DNA를 복구하기 위해 소량의 이온화 된 물로 첫 번째 튜브의 측면을 헹구고, 다시 여과하여 슈퍼네이트를 결합합니다.그런 다음 에탄올 강수량을 통해 원형 DNA를 정화하고 DNA를 섭씨 영하 20도에 저장합니다. 한 냄비 어닐링의 경우, 10배 의 Tris 아세테이트 EDTA 마그네슘 버퍼의 마이크로리터 2개, 선형 및 원형 가닥 세트의 각 10마이크로리터 DNA 스톡 솔루션 1개, 200마이크로리터 PCR 테스트 튜브에 추가 Tris EDTA 버퍼를 200 마이크로리터 PCR 테스트 튜브에 혼합하여 20마이크로리터의 최종 부피에 넣습니다. 그런 다음 48시간 이상 95~25도의 열병에 조립 용액을 음결합니다.무한 격자의 2 단계 어닐링의 경우, 10 배 Tritate EDTA 마그네슘 버퍼의 두 마이크로 리터, 동일한 어어 비에 선형 및 원형 가닥의 각 10 마이크로 리터의 마이크로 리터, 추가 트리스 EDTA 버퍼 200 마이크로 리터 PCR 테스트 튜브, 최종 볼륨 20. 첫 번째 하위 타일 어닐링 단계에서, PCR 써모사이클러의 각 전구체 하위 타일 용액을 2시간 반 이상 95~25도의 빠른 선형 냉각 방법을 사용하여 음막. 조립 용액을 준비하려면, 4개의 무한 격자 각각에 대해, 각 두 개의 해당 하위 타일 용액각각의 10 마이크로리터를 각 가닥에 대해 0.25 마이크로몰라의 최종 농도로 혼합한다.제2 격자 어닐링 단계에서, 느린 냉각 방법을 사용하여 PCR 써모사이클러에서 20 마이크로리터 혼합물을 음닐한다. 두 개의 유한 사각형 격자의 두 단계 어닐링의 경우, 10 배 트리시테이트 EDTA 마그네슘 버퍼의 마이크로 리터 1 개, 선형 및 원형 가닥 세트의 각각 10 마이크로 리터의 0.5 마이크로 리터와 200 마이크로 라이트 PCR 의 마이크로 라이트 PCR 테스트R 에 추가 Tris EDTA 버퍼를 혼합합니다. 첫 번째 어너링 단계에서, PCR 써모사이클러의 각 전구체 서브 타일 용액을 빠른 선형 냉각 방법을 사용하여, 입증된 바와 같이, 95~25도, 2시간 반 이상, 200마이크로리터 PCR 시험관에 함께 2마이크로리터를 혼합한다.이어서, 제2 어닐링 단계에서, 써모사이클러내의 64 마이크로리터 혼합물을 음침하여, 느린 냉각 방법을 사용하여, 입증하였다. 유한 격자의 전기포고 정화를 위해, 원토2%아가로즈 젤을 준비하고 유한 격자 용액의 20 마이크로리터를 각 우물에 적재하고, 100 내지 3000베이스 페어 DNA 사다리의 5마이크로리터를 별도의 우물로 첨가한다. 얼음 수조에서 5볼트퍼센트에서 2시간 동안 젤을 실행한 후, 목표 젤 밴드를 UV 빛 아래 1000베이스 페어 마커의 약 수준으로 자르고 젤 밴드를 미세한 조각으로 자른다.분쇄된 젤을 필터 컬럼에 넣고 컬럼을 원심분리하여 격자를 추출합니다. 그런 다음, 원자력 현미경 이미징용 솔루션을 수집한다. 폴예탈렌 글리콜 또는 PEG에 의한 유한 격자 정제의 경우, 유한 격자 용액의 50 마이크로리터를 15%PEG 8000 버퍼의 동일한 부피로 혼합하고, 원심분리용액을 원심분리하고, 페그 버퍼의 100마이크로리터에 펠릿을 다시 일시 중단하여 추가원심분리를 한다.두 번째 원심 분리 후, 원자력 현미경 이미징을 위해 Tris 아세테이트 EDTA 마그네슘 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다. 무한한 2D 격자 원자력 현미경 이미징의 경우, 신선한 형태의 운모층을 갈라서 안래 샘플의 마이크로리터 2개를 깨끗한 표면에 증착하십시오. DNA 격자가 2분 동안 현미경 표면에 흡수하여 표면을 두 번 세척하기 전에 세척당 100 마이크로리터의 이온화 된 물을 사용하여 두 번째 세척 후 압축 공기로 표면을 건조시십시오.공기 중의 무한DNA 격자의 원자력 현미경 이미지를 얻으려면 이미징 소프트웨어에서 태핑 모드를 열고 스캔 크기를 0.5 내지 5 마이크로미터로 설정하고 스캔 크기를 512줄로 설정하고 1내지 3.5 Hertz 사이의 스캔 속도를 설정합니다. 그런 다음 삼각형 원자력 현미경 프로브로 운하 표면을 스캔합니다. 유한 DNA 격자 이미징의 경우, 입증된 바와 같이 신선한 형태의 운모층을 갈라내고, 1겹 의 80마이크로리터를 1겹의 트리시테이트 EDTA 마그네슘 버퍼를 깨끗한 운하 표면에 보관하십시오.다음으로, 완충에 유한 한 샘플 의 5 마이크로 리터를 추가하고, DNA 격자가 프로브에 TRIs 아세테이트 EDTA 마그네슘 버퍼의 또 다른 50 마이크로 리터를 추가하기 전에, 마이카 표면에 흡수 하는 2 분 허용. 이어서, 스캔 크기를 0.5~ 1마이크로미터로 설정하고, 스캔 해상도를 256선으로 설정하고, 스캔 속도를 1.5 Hertz로 설정하고, 삼각형 프로브로 표면을 스캔하기 전에, 입증된 바와 같이. 원형 DNA는 서투른 PAGE에서 전구체 선형 DNA보다 약간 느리게 움직이며, 이는 원형 DNA 내부의 모공이 젤 섬유에 의해 침투되고 지연되기 때문입니다.원형 64 뉴클레오티드 어셈블리 제품군은 각 어셈블리에 대해 단 하나의 명확하고 깨끗한 대역을 가지고 있으며, 단일 모티프의 안정성을 확인합니다. 그러나 타일의 원형 84 뉴클레오티드 어셈블리 제품군은 주요 대역 주변에 얼룩이 있으며, 이는 사소한 부산물의 존재를 나타냅니다. 잘못된 동료의 제품에 의해 사소한에 관계없이, 높은 수율을 가진 우수한 격자는 대상 단조량 모티브에서 조립 될 수있다.각 어셈블리는 나노와이어, 나노튜브, 나노나선형, 나노리본 및 나노사각형과 같은 마이크로미터 스케일에 고유한 형태학적 특징을 가지고 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 특히, 단계 중 또는 오프 파편 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 DNA 나노 기술 분야의 연구를 위한 길을 열어 좀 더 원형 DNA 나노 기술의 새로운 가족 구성원을 탐구합니다.

stable-dna-motifs-1d-2d-nanostructures-constructed-from-small

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

3DNA 소프트웨어 패키지, 분석 구축, 3 차원 핵산 구조를 시각화하는 기능을 갖춘 인기있는 다양한 생물 정보학 도구입니다. 이 문서에서는 각각의 구조 및 관련 구조의 앙상블에 모두 적용 3DNA에서 사용할 수있는 새로운 대중적인 기능의 하위 집합에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

DNA 종이 접기 DNA 분자의 자기 조립을 프로그래밍하여 정확한 나노 물체를 제조하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 DNA 종이 접기는 생물학적 신호를 감지하고 모양이 연속적으로 원하는 효과를 전달, 이동하여 응답 할 수있는 로봇 로봇을 설계에 활용 될 수있는 방법에 대해 설명합니다.

DNA 종이 접기에서 바이오 반응 로봇을 설계

DNA 종이접기는 DNA 분자의 자기 조립을 프로그래밍하여 정밀한 나노 크기의 물체를 제작하는 강력한 방법입니다. 여기에서는 DNA 종이접기에서 생체 반응성 로봇을 접는 프로토콜, 투과 전자 현미경 이미징(TEM)을 위한 정제 및 음성 염색에 대해 설명합니다.

DNA 접기에서 바이오 응답 로봇의 폴딩 및 특성화

DNA 타일링은 프로그래밍 가능한 나노 구조를 만드는 효과적인 접근 방식입니다. 우리는 단일 가닥 DNA 타일의 자체 조립에 의해 복잡한 2차원 모양을 구성하는 프로토콜을 설명합니다.

단일 가닥 DNA 타일에서 단지 두 차원 모양의 자기 조립 (self-assembly)

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

우리는 디자인, 시뮬레이션, 젖은 실험실 실험 및 아코디언 랙 6으로 6 메시의 DNA의 재구성에 대 한 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

재구성 가능한 DNA 아코디언 랙의 설계 및 합성

여기, 키토 산 천연 양이온 다 당 류 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI) 코팅을 사용 하 여 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 보호를 위한 프로토콜 제공 됩니다.

유전자 치료 DNA 종이 접기 Nanostructures의 보호를 위한 Polycation 코팅을 영감

우리는 DNA 종이 접기 기반 어셈블리 골드 nanorods의 강한 chiroptical 응답 랄 plasmonic metamolecules에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜 랄 구성에 국한 되지 않습니다 하 고 다양 한 plasmonic 아키텍처의 제작을 위해 쉽게 적응 시킬 수 있다.

DNA 종이 접기 서식 파일을 사용 하 여 키 랄 Plasmonic Metamolecules로 금 Nanorods의 조립

여기서, 우리는 DNA 종이 접기 모양을 안내 템플릿으로 사용하여 기판에 이산적이고 정확한 무기 나노 구조를 만드는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 투명 기판 (사파이어)에 플라스모닉 골드 나비 넥타이 모양의 안테나를 만들어 입증된다.

감지 응용 을 위한 무기 구조물의 DNA 종이접기 중재기 나노patterning

이 문서는 유기 용매 혼합물에서 감마 변형 펩타이드 핵산 올리고머로부터 나노 구조의 설계 및 자체 조립을 위한 프로토콜을 제공합니다.

감마 변형 펩타이드 핵산의 자가 조립을 유기 용매 혼합물의 복잡한 나노 구조로

우리는 구성 DNA 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 양친매성 DNA 나노스타로 구성된 합성 생체 분자 응축물을 제조하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 응축물은 단일 nanostar 구성 요소 또는 두 가지 구성 요소로 생성되며 내장된 DNA 템플릿에서 RNA의 시험관 내 전사를 유지하도록 변형됩니다.

양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조

배우세요 T4 리게이션과 변성 PAGE를 이용한 원형 DNA 정제 및 DNA 나노구조 분석 방법. 이 단순하고 견고한 프로토콜은 대부분의 연구실에서 활용 가능하며 1D 및 2D DNA 나노구조 시각화에 적용됩니다.

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

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