Name: 효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 효모를 이용한 형광 단백질 융합 파트너 영향 분석 방법으로 폴리글루타민 독성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신경퇴행성 질환 관련 단백질 응집 동역학 연구에 활용됩니다.

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이 연구 M.L.D.와 P.L. 건강 연구를 위한 캐나다 학회에서 운영 보조금에 의해 지원 됩니다. 여기에 제시 된 작품은 존 R. 에반스 지도자 기금 수상 혁신을 위한 캐나다 재단에서 지원 하 고 P.L. Y.J.에 온타리오 연구 기금에서 매칭 펀드 Schulich M 학교 학장에서 박사 전송 하는 MSc에 의해 지원 됩니다. edicine 고 치과에 웨스턴 온타리오 대학. S.D.G.는 ALS 캐나다에서 박사 학위 장학금에 의해 지원 됩니다.

1. 새로운 붙일 태그가 Httex1 효 모에는 식에 대 한 기자 들의 세대
참고:이 섹션은 프로토콜에서에 의해 수정 된 장 외. 16 및 Albakri 외. 19.
<ol><li>형광 단백질 또는 PCR에 의해 관심을 인코딩 순서를 증폭 하는 뇌관 디자인. 앞으로 뇌관 리더 시퀀스 소화 (GATC) 동안 제한 효소 SpeI 제한 사이트 (ACTAGT) 및 관심사의 형광 단백질 유전자의 ATG (ATG 제외)의 하류 20 기초를 지원 하기 위해 포함 되어야 합니다. 반전 뇌관 사리 제한 사이트 (GTCGAC)와 (를 포함 하 여 중지) FP 시퀀스의 정지 codon의 상류 20 기지의 반전 보수 지도자 시퀀스 (GATC)를 포함 해야 합니다.</li>
	<li>Thermocycler는 다음 설정을 사용 하 여 PCR 반응을 수행 단계 1.1에서에서 설계 하는 뇌관을 사용 하 여: 1 분 및 30 주기 95 ° C에서 95 ° C에 열 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 PCR 제품의 kB 당 2 분 동안 72 ° C. 18 주기를 수행 하는 것입니다 충분 한.</li>
	<li>(트리 스-아세테이트-EDTA에 0.5%)는 agarose 젤에 PCR 반응을 실행 합니다. 단일 밴드가 예상된 제품 크기에 해당 한다. 분리 젤 정화 키트를 사용 하 여 조각.</li>
	<li>프로토콜 사용 하 여 25 (저온)를 들고 Httex1 벡터 및 72 polyQ 반복 (HD-관련 된, 강한 집계를 표시). PCR 파편 및 벡터 3 h 37 ° c.에 대 한 SpeI 및 사리 금지 효소로 소화</li>
	<li>1.3 단계 에서처럼 agarose 젤에 그것을 실행 하 여 소화 벡터를 정화.</li>
	<li>PCR 정화 키트를 사용 하 여 소화 PCR 파편을 정화.</li>
	<li>선 결과 소화 PCR 파편 및 p415-GAL1-플래그-25/72QpolyQ 플라스 미드1 T4 리가 (실 온에서 1 h)을 사용 하 여. 10 µ L 반응 (T4 효소의 1 µ L, 10 X 버퍼의 1 µ L, PCR 파편의 6 µ L 및 벡터의 2 µ L)을 사용 합니다.</li>
	<li>대장균의 50 µ L로 결 찰 반응의 2 µ L 변환-유능한 세포와 30 분 동안 얼음에 그들을 품 어. 다음, 열-충격 30 42 ° C에서 셀 s. 추가 SOC 파생물 미디어의 1 mL 및 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 100 µ g/mL 암 피 실린을 포함 하는 파운드-한 천 격판덮개에 반응의 200 µ L 플레이트. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.</li>
	<li>3 개인적인 세균성 식민지를 선택 하 고 파운드-국물 통에 37 ° C에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함의 3 mL에서 하룻밤 성장 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 DNA를 추출.</li>
	<li>500을 소화 하 여 플라스 미드를 확인 실행 반응 agarose 젤 (트리 스-아세테이트-EDTA에 0.5%)에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 SpeI 및 사리 제한 효소를 사용 하 여 DNA의 ng. 벡터 (~ 7 kb) 및 삽입의 오른쪽 크기에 두 밴드 해야 (크기는 관심사의 유전자에 따라 다름). 다음, 연속으로 플라스 미드를 확인 합니다.</li>
	<li>p415-GAL1-누 룩 스트레인 W303 표준 효 모 전이 프로토콜2다음으로플래그-polyQ FP 플라스 미드를 변환.</li>
</ol>2. 분석 결과 보 이나
<ol><li>줄무늬 누 룩 운반 25Q/72Q 태그의 탄소 원으로 포도 당을 효 모 선택 미디어 (합성 완료-SC 신 없이)을 포함 한 천 배지에서 FP와 함께 복제 합니다. 동시에 또한 25Q/72Q-ymsfGFP 긍정적인 통제 역할을 행진. 참고: 형광 태그를 포함 하지 않는 25Q/72Q 구문 독성 되지 않습니다 하 고 부정적인 제어 될 수 있습니다.</li>
	<li>2-3 d 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>접시에서 최대 3 개의 단일 식민지를 선택 합니다.</li>
	<li>탄소 소스로 2% 포도 당으로 보충 하는 SC의 5 mL 접종</li>
	<li>각 숙박 문화의 200 µ L 작은 및 그것을 씻어 3 x 살 균 증류수.</li>
	<li>사우스 캐롤라이나 미디어 polyQ 융해의 표현을 유도를 탄소 원으로 2% 갈 락 토스를 포함 하는 셀 resuspend 미디어 튜브 회전에서 30 ° C에서 하룻밤 갈 락 토스를 품 어. 컨트롤, 포도 당 포함 된 미디어를 사용 하 여이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>다음날 아침, 맞춰야 600에서 광학 밀도를 셀 밀도 살 균 96 잘 접시에 SC 미디어의 0.2에서 100 µ L의 nm (OD600).</li>
	<li>4 준비 다음 우물에 있는 미디어의 80 µ L로 잘 이전에서 샘플의 pipetting 20 µ L에 의해 살 균 물으로 각 샘플의 오부 희석.</li>
	<li>효 모 고정 도구를 사용 하 여 선택적 접시 (포도 당 또는 갈 락 토스를 포함 하는)에 셀 고 2 d 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>이미지 문서 장치 판 이미지.</li>
</ol>3. 액체 문화에서 세포 성장의 정량화
<ol><li>세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.</li>
	<li>OD600 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>96 잘 접시에 미디어의 300에서 0.1 µ L의 OD600 셀을 희석.</li>
	<li>3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>떨고 기능 플레이트 리더/인큐베이터에 접시를 품 어. 600에서 샘플, 30 ° C에서 온도, 흡수도의 수를 설정 nm, 24 h, 실험 및 15 분을 선택 연속 진동 모드 측정 간격의 길이.</li>
	<li>성장 곡선을 만들고 과학적인 그래프 소프트웨어를 사용 하 여 곡선 아래의 영역을 계량 합니다. GraphPad Prism 7 것이 좋습니다. 3 복제 값으로 XY 테이블에 데이터를 붙여 넣습니다. 성장 곡선 그래프 폴더 왼쪽에 표시 됩니다. 곡선 아래의 영역을 계량, 왼쪽 상단에 분석 을 선택 하 고 곡선 아래의 영역 XY 분석을 클릭 합니다.</li>
</ol>4. 형광 현미경 검사 법
<ol><li>세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.</li>
	<li>셀 10 희석 성장 미디어와 전송 200 µ L 8 잘 이미징 챔버에 각 샘플의 x.</li>
	<li>실 온에서 63 X 계획 Aprochromoat 목표 (1.4 없음)을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지. 참고: 공초점 현미경의 사용은 선택 사항. 표준 넓은 분야 형광 현미경도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>최적의 이미지 수집을 위한 작은 구멍 및 레이저 파워를 조정 합니다. 72Q 집계 확산 25Q 신호 보다 훨씬 밝은 때문에, 형광 신호 포화를 방지 하기 위해 다른 플라스 미드 사이 다른 수집 설정을 사용 하려면 종종 필요 합니다.</li>
	<li>ImageJ20 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 처리 합니다. 이 단계에서 디스플레이 집계 수동으로 계산할 수 있습니다 셀의 비율은 원한다.</li>
</ol>5. 점 오 점
참고:이 프로토콜에 점 오 점 단백질 표정 수준 검사에 사용 됩니다. 세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.
<ol><li>단백질 lysates 유리 구슬 (100 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 m m dithiothreitol [DTT]) 세포의 용 해 버퍼에서 사용 하 여 생성 합니다. 프로 테아 제 억제제, 4 mM phenylmethylsulfonyl 불 (PSMF)와 프로 테아 제 억제 물 칵테일, 직접 사용 하기 전에 추가 합니다. 야간 문화의 5 mL을 작은 고 유리 구슬의 200 µ L에 세포의 용 해 버퍼의 200 µ L resuspend. 12 라운드에 대 한 소용돌이 30 s. 10 분 동안 4 ° C에서 12000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>장을 기구를 사용 하 여 니트로 멤브레인에 총 단백질의 동일한 금액을 자리. PBS 가진 막 prewet 하 고 기구를 조립. 진공 소스에 연결 하 고 나사 강화 있는지 확인 하십시오. 켜고 진공 중력에 의해 멤브레인을 통해 샘플 필터를 하자.</li>
	<li>PBS-0.05 %Tween/5% 지방 없는 우유에 막을 차단 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 하룻밤 기본 안티 플래그 항 체로 막 품 어 단일 클로 널 반대로 플래그 m 1이 좋습니다.</li>
	<li>3 막 씻고 PSB-0.05% 트윈으로 각 10 분 x.</li>
	<li>붙일 레이블된 이차 항 체 (반대로 마우스 IgG) PBS-0.05 %Tween/5% 지방 없는 우유에 실 온에서 1 h와 막 품 어.</li>
	<li>막 PSB-0.05% 트윈와 3 x 10 분 워시.</li>
	<li>이미지-오 점 immunoblot 문서 시스템을 사용 하 여.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서는, Httex1 polyQ 확장 및 효 모 성장에 미치는 영향의 집계를 측정 하기 위해 다양 한 분석 공부 어떻게 다른 형광 모델로 채택 되었다 단백질 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 퓨전 파트너 변경 . 우리이 polyQ 독성 및 집계 다른 형광 태그 사이 상당한 변화를 감지 하 고 polyQ FP 퓨전 성능에 대 한 직접적이 고 빠른 비교에 대 한 수 보여 긍정적인 컨트롤로 GFP 변형 (ymsfGFP)를 사용 하 여, GFP 태그 구문을16,19.
현재 프로토콜은 형광 단백질에 초점을 맞추고, 하는 동안 프로토콜의 다양 한 부분 다른 단백질 태그의 결과 테스트 하는 쉽게 적응 수 있습니다. 또한, 현재 프로토콜 복사 번호 (일반적으로 1 ~ 2 부) 셀25에 측면에서 다를 수 있는 낮은 복사 효 ...

이후 Aequorea 빅토리아1, 유전자 인코딩된 FPs의 넓은 팔레트에서에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 초기 특성을 개발 하 고, 허용 동시에 지역화 및 추적 세포 생물학 여러 생활에서 셀룰러 이벤트/단백질 세포2,3. FPs는 산호, 그리고 그러므로, 표시 특정 생물 속성을 광범위 하 게 그들의 각각 형광 스펙트럼 넘어 전환에 해파리에서 여러 유기 체에서 파생 됩니다. 이러한 속성에는 밝기, photostability, 및 다른 사람의 사이에서 oligomerize2,4경향이 포함 됩니다. 부적절 한 상호 작용 및 융합 파트너의 기능 변경 최소화 하 고 대 한 기자 효율 극대화 형광 기자를 설계할 때 적합 한 태그의 선택에 중요 한 측면 이다 단위체 FPs를 선택 하는 주어진 세포 구획4,,56. GFP는, 시간이 지남에 진화 되었습니다 융합 파트너5,,78형광 태그를 추가 하는 효과 최소화 하기 위해 하는 동안 GFP 남아 평가 하기 어려운 새로운 FP의 변종에 비해 수행 하는 방법.
FPs의 동작에 몇 가지 방법이 존재 한다. 그들의 대부분 ultracentrifugation 같은 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 프레임의 생물 속성 테스트를 포함 하 고 젤 여과 프로토콜9,10,,1112. 이러한 메서드는 그대로 셀에 그들의 행동에 약간의 통찰력을 제공 하는 솔루션에서 순화 된 프레임을 사용 하 여 경고. 조직된 부드러운 바인딩과 그물 (OSER) 분석 결과 제공의 개발 FPs' 경향이 생활에서 oligomerize의 정량 평가에 떠다니고 그물 tubules를 재구성 overexpressed FPs의 능력을 테스트 하 여13 세포 OSER whorls14. 이 기술을 성공적으로 GFP의 단위체 및 oligomeric 변형 및 다른 프레임 간의 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나, overexpression 뚜렷이 transfected 세포에 주로 의존 하 고 정량 및 이미지 분석 시간이 걸릴 수 기술을 자동화 된 데이터 수집 및 분석 워크플로우로 채택 하지 않는 한.
이러한 접근을 보완 하기 위해 효 모15,16에서 독성에 형광 태그의 효과 및 polyQ 확장의 집계의 이용 하는 분석 결과 설립 했습니다. 이상 36와 polyQ 스트레치의 확장 huntingtin 단백질 (Htt)이 헌팅턴 병17,18연관 유전자 인코딩 첫 번째 엑손에서 반복 됩니다. 가혹한 성장 결함을 결합 misfolded Htt 단백질의 강한 집계에 효 모 결과에 확장된 Htte x 1 의 식입니다. 흥미롭게도,이 고기 FPs15,16를 포함 하 여 polyQ 스트레치 측면 시퀀스에 의해 강하게 좌우 된다. 그것은 프레임의 다른 속성 polyQ 독성 누 룩에 영향을 미칠 차동 수 합리화 했다. 실제로, GFP 같은 FPs에 비해 붉은 형광 단백질 및 그들의 진화 형태 나타났습니다 감소 독성 및 집계16. 이 원고는 polyQ 독성과 효 모에 집계에 FPs의 다음 세대의 효과 평가 하기 위해 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 분석 결과 이전 특징을 동시에 사용할 수 있는 FP의 변종의 신속 하 고 잠재적으로 하이 콘텐츠 분석에 대 한 새로운 FPs 고 수의 최적의 특성에 대 한 기술 평가 어떻게 그들이 수행 GFP에 비해 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>5-alpha 유능한 대장균(고효율)</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>R3133</td><td>고충실도 효소가 선호됨</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>R0138</td><td>고충실도 효소가 선호</td></tr>됨 <tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra 고충실도 DNA 중합효소</td><td>애질런트 기술</td><td>600382</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2 마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>BioTek Instruments inc</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>효모 핀 복제기</td><td>V& 주식회사 P 사이언티픽</td><td></td><td></td>VP407AH</tr><tr><td>SPI 이미저</td><td>S& P 로보틱스 Inc.</td><td>spImager-M</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>8 well Lab-Tek 이미징 챔버</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Chemi Doc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M1 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3040</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG alexa 555 보조 항체</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>A32727</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 MiniPrep 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 겔 추출 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0831</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Prizm</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13354</td><td></td></tr></tbody></table>

효 모에 polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

단백질 지 방화 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 매매의 수사에 대 한 연구는 종종 형광 기자에 게 관심사의 그들의 단백질을 융합에 의존 합니다. 끊임없이 진화 목록이 유전자 인코딩된 형광 성 단백질 (FPs) 형광 퓨전 디자인에 관해서 여러 대안을 가진 사용자를 선물 한다. 각 FP는 특정 광학 및 생물 속성이 결과 형광 융해의 생화학, 세포, 및 기능 속성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 여러 FPs 융합 파트너의 기능에 방해에 취약 일반 올리고를 형성 하는 경향이 있다. 불행히도, 몇 가지 방법만 형광 기자의 행동에 FPs의 영향을 테스트 위해 존재 합니다. 여기, polyglutamine (polyQ) 독성 분석 실험을 사용 하 여 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 FPs의 영향의 급속 한 평가 가능 하 게 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 확장 huntingtin 단백질 확장된 huntingtin 독성 올리고 포함 시체로 집계 Huntington의 질병 (HD)의 증상과 연결 됩니다. 집계 및 효 모에 polyQ 확장의 독성은 높은 FPs의 행동에 미치는 영향을 공부 하는 이상적인 실험 플랫폼을 제공 하는 형광 태그의 존재를 포함 하 여 polyQ 지역 측면 시퀀스에 따라 그들의 퓨전 파트너입니다.

FPs는 다른 생물 속성, oligomerize에 그들의 추세를 포함 하 여 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 융합 파트너의 동작에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에는 여러 FPs 독성 polyQ 확장을 융합 하는 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 독성 측면 polyQ 스트레치15시퀀스에 상당히 의존 때문에,이 분석 결과 형광 polyQ 퓨전 기자 (그림 1)의 신속 하 고 직접적인 비교를 허용 한다. HD 관련 된 polyQ 길이 (25Q) 부정적인 제어로 사용 되 고 중요 한 독성 또는 집계15,16,,2122표시 하지 않습니다....

이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

이 방법은 형광 단백질이 융합 파트너에게 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 형광 단백질 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 단백질과 융합 파트너의 효과에 대한 신속하고 쉽게 확장 가능한 평가를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 형광 단백질 행동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 다른 유전자 인코딩 태그에도 적용 할 수 있습니다.또한이 절차를 시연하는 것은 웨스턴 대학의 대학원생인 소냐 디 그레고리오입니다. 이 방법에 의해 시험되는 각 형광 단백질은 먼저 비독성 25Q 반복 또는 헌팅턴 질병 관련 독성 72Q 반복을 수용하는 플래그 태그 HTT 엑온의 갈라토세 유도 할 수 없는 버전을 인코딩하는 효모 발현 벡터로 복제된다. 클론은 시퀀싱에 의해 선택되고 검증되고 이어서 효모로 변환됩니다.다양한 애사에 대한 세포 배양을 준비하기 위해, 25Q 또는 72Q 태그를 운반하는 효모 클론을 탄소원으로 포도당으로 효모 선택 배지를 함유하는 한천 판에 관심 있는 형광 단백질을 적어 놓는다. 동시에, 25Q 또는 72Q 효모를 운반하는 줄무늬 효모는 양성 제어 역할을 하기 위해 단황 슈퍼폴더 GFP를 최적화했다. 2~3일 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다.각 플레이트에서 최대 3개의 단일 콜로니를 선택하고 탄소 원으로 2%의 포도당으로 보충된 합성 완전 배지의 5밀리리터를 접종한다. 하룻밤 사이에 30도에서 문화를 배양하십시오. 다음 날, 각 야간 배양200마이크로리터를 미세원심분리기 튜브및 원심분리기로 이송하여 세포를 펠릿화한다.멸균 증류수로 적어도 세 번 씻으라. GAL1 프로모터의 유도를 억압하는 데 기여할 수 있는 포도당의 모든 흔적을 제거하기 위해 세포를 잘 씻는 것이 중요합니다. 이전에 입증된 바와 같이 세포를 준비하고 폴리Q 융합의 발현을 유도하기 위해 탄소 원으로서 2%의 갈라토스를 함유한 합성 완전 배지에서 세포를 다시 중단한다.대조군으로서 포도당 함유 매체에서 세포를 다시 중단한다. 하룻밤 동안 튜브 회전기에서 섭씨 30도에서 세포를 배양하십시오. 다음 날 아침, 분광광계를 사용하여 각 배양의 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.세포 밀도를 멸균 96웰 플레이트에서 합성 완전 배지 의 100 마이크로리터 에서 2의 광학 밀도 600으로 균등화한다. 이전 우물에서 샘플의 20 마이크로리터를 파이프팅하여 각 샘플의 4개의 5배 희석제를 다음 우물에서 80 마이크로리터의 미디어로 배관하여 준비합니다. 효모 고정 도구를 사용하여 셀을 선택적 플레이트에 발견하고 2 일 동안 섭씨 30도에서 배양하십시오.이미지 설명서 장치로 플레이트를 이미지화합니다. 이 분석법에 대한 세포 배양을 준비한 다음 분광계를 사용하여 각 배양의 OD600을 측정합니다. 96웰 플레이트에서 300 마이크로리터의 미디어 중 1개 중 OD600으로 세포를 희석시 희석시다.각 샘플을 삼중으로 준비합니다. 흔들리는 기능을 사용하여 플레이트 판독기 인큐베이터에 플레이트를 배양합니다. 시료 수, 섭씨 30도의 온도, 흡광도 600 나노미터, 실험 의 길이를 24시간으로 설정하고 측정 간격을 15분으로 설정합니다.연속 흔들림 모드를 선택합니다. 실험이 완료되면 성장 곡선을 만들고 과학 그래프 소프트웨어를 사용하여 곡선 아래 영역을 정량화합니다. 데이터를 세 개의 복제 값으로 XY 테이블에 붙여 넣습니다.성장 곡선은 왼쪽의 그래프 폴더 아래에 표시됩니다. 곡선 아래 영역을 정량화하려면 왼쪽 위에서 분석하고 XY 분석에서 곡선 아래 영역을 클릭합니다. 준비된 세포를 성장 배지에서 10배 희석하여 이 절차를 시작합니다.각 샘플의 200마이크로리터를 8웰 이미징 챔버로 옮기습니다. 표준 와이드 필드 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지합니다. 이미지 수집을 위한 이미징 설정을 조정합니다.72Q 응집체는 확산된 25Q 신호보다 훨씬 밝기 때문에 형광 신호의 포화를 피하기 위해 다른 플라스미드 간에 다른 획득 설정을 사용해야 하는 경우가 많습니다. 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 이 프로토콜에서, 닷 블롯은 단백질 발현 수준을 검사하기 위하여 이용됩니다.페닐메틸설포닐 불소의 4마이크로몰라와 리시스 완충제에 프로테아제 억제제 칵테일을 추가하여 단백질 용액생성을 위한 완충액을 준비한다. 펠릿 원심 분리에 의해 각 하룻밤 문화의 다섯 밀리리터. 유리 구슬의 200 마이크로 리터와 200 개의 용해 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다.12라운드 동안 30초 동안 소용돌이가 회전합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 12, 000배 G로 10분 동안 상주합니다. 마이크로 여과 장치를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에서 동일한 양의 총 단백질을 발견하십시오.PBS로 멤브레인을 미리 적시고 장치를 조립합니다. 진공 소스에 연결하고 나사를 조여 있는지 확인합니다. 시료를 적재하고, 진공을 켜고, 시료가 중력에 의해 멤브레인을 통해 필터를 할 수 있도록 합니다.PBS 05%Tween 5%의 무지방 우유를 30분 동안 막에 블롯합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1 차적인 항플래그 항체로 막을 배양하십시오. 다음 날, PBS 05%Tween으로 각각 10분 동안 멤브레인을 세 번 씻는다.PBS 05%Tween 5%의 지방 이차 항체에서 1시간 동안 실온에서 형광으로 표시된 이차 항체로 멤브레인을 배양합니다. PBS 05%Tween으로 멤브레인을 각각 10분 동안 세 번 씻으시다. 그 후, 아미노 블롯 문서화 시스템을 사용하여 멤브레인을 이미지.효모는 효모에 융합된 25Q 또는 72Q HTT 엑슨 1개를 효모에 최적화된 단량형 슈퍼폴더 GFP 또는 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 하룻밤 사이에 포도당 또는 갈라토스 배지에서 배양하여 한천판에서 발견되거나 액체 매체에서 더 많이 배양하였다. 반면 72Q 효모최적화 단황 슈퍼폴더 GFP는 상당한 성장 결함을 유도한다. 72Q 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 형광 태그의 특성이 세포에서 폴리Q 확장 거동을 방해할 수 있음을 나타내는 비독성 25Q 대응과 유사한 성장 표현형을 나타낸다.형광 현미경 검사법에 의한 형광 폴리Q 융합의 집계 평가는 72Q 효모최적화 된 단황 슈퍼폴더 GFP가 상당한 응집을 표시하는 반면, 72Q 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 무독성 25Q 대응과 유사한 확산 된 세포질 신호를 표시합니다. 다양한 폴리Q 퓨전의 발현 수준이 독성에 영향을 줄 수 있기 때문에, 도트 블롯은 단백질 수치를 평가하기 위해 수행되었다. 세포 용양의 5 배 희석의 결과가 표시됩니다.이 기술은 GFP 이체와 특징되지 않은 형광 단백질의 신속한 비교를 허용하지만, 직접 올리고머화를 평가할 수 없다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 이어, 다른 측정, 예를 들어, 포유류 세포내궤양 분석체는 형광 단백질의 단황 상태와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.

effect-fluorescent-proteins-on-fusion-partners-using-polyglutamine

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

본 원고는 효모에 polyglutamine의 독성 (polyQ) - 확장 단백질을 평가 삼 보완적인 프로토콜을...

성장 Assays은 효모에서 Polyglutamine 독성을 평가하기 위해

이 비디오는 노화로 인한 단백질 단백 감소를 결정하기 위한 생체 내 이미징 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 체벽 근육에서 폴리글루타민 YFP-융합 단백질을 발현하는 Caenorhabditis elegans를 사용하여 폴리글루타민의 연령 관련 응집과 단백질 독성 유도를 측정하여 마비를 유발합니다.

형광 리포터 기반 마비 분석: 예쁜꼬마선충에서 폴리글루타민 형광 리포터의 연령 관련 진행성 형성 및 관련 마비를 평가하는 기술

이 문서에서는 조사 반딧불 루시 페라 제 - GFP 융합 단백질의 사용을...

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

우리는 핵분열 효모 성 수명 주기의 장기 현미경을 위한 재현 가능한 기본 방법을 제공합니다. 설명된 사소한 조정과 함께 제시된 프로토콜은 생식 과정의 여러 단계에 대한 연구의 초점을 맞출 수 있도록 합니다.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

PCR 매개 유전자 변형은 시각화 및 효모 세포 및 단백질의 정량을 용이 칸디다 종의 형광 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 칸디다에서 형광 단백질 융합 (Eno1-FP)을 구축하기위한 전략을 제시한다.

에 형광 단백질 융합의 시대<em&gt; 칸디다</em&gt; 종

이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.

모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

배우세요 효모를 이용한 형광 단백질 융합 파트너 영향 분석 방법으로 폴리글루타민 독성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신경퇴행성 질환 관련 단백질 응집 동역학 연구에 활용됩니다.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

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