Name: 마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 학습하세요 마우스 조직에서 B 세포를 분리하고 차세대 시퀀싱으로 항체 레파토리를 분석하는 방법을. 이 기술은 면역 반응 동역학을 평가하여 백신 효능 연구와 질병 병인론 이해에 활용됩니다.

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이 작품 아메드 보조금 번호 JP18fk0108011 아래에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (코와 SI) 및 JP18fm0208002 (TS, 코, 그리고 요), 그리고 코를 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (15 K 15159)에서 특정. 우리는 귀중 한 기술 지원에 대 한 사유리 야마구치와 리코 사사키 감사합니다. 우리는 영어 편집 Editage (www.editage.jp)를 감사 하 고 싶습니다.

모든 동물 실험과 국립 연구소의 전염 성 질병 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 기관 지침에 따라 수행 했다. 이 보고서에서 대표적인 결과의 국립 연구소의 전염병, 도쿄, 일본, 윤리 위원회의 승인으로 수행 되었고 동의 서 면으로 사용 하는 건강 한 성인 자원 봉사자에서 PBMCs의 샘플링 얻은 각 참가자에서 윤리 위원회 승인 양식을 사용 하 여.
1. 뇌관 디자인
<ol><li>CDNA는 면역 글로불린을 증폭 하는 보편적인 앞으로 뇌관 디자인에서 PCR 뇌관, 5'-경주11,12 및 스마트 PCR13 기법에서 사용 되는 바이어스 없이 mRNA.</li>
	<li>면역 글로불린 VH 유전자 증폭에 대 한 역방향 뇌관8,14 (그림 1A)로 일정 지역에서 면역 글로불린 클래스 특정 시퀀스를 디자인 합니다. 참고: 다중 태그 시퀀스 다른 샘플 소스에서 라이브러리 분자를이 뇌관에 추가할 수 있습니다. 중첩된 한 PCR 위한 시퀀스 또한 추가할 수 있습니다,15키트 사용 설명서에 따라.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유니버설 앞으로 뇌관</td>
			<td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">마우스 면역 글로불린 (Ref.8)에 대 한 역방향 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM_CH1:</td>
			<td>CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG1_CH1:</td>
			<td>CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG2c_CH1:</td>
			<td>GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG3_CH1:</td>
			<td>5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA_CH1:</td>
			<td>5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ_CH1:</td>
			<td>GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ_CH1:</td>
			<td>CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">인간의 면역 글로불린 (Ref.14)에 대 한 역방향 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM_CH1:</td>
			<td>GGGAATTCTCACAGGAGACG-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG_CH1:</td>
			<td>AAGACCGATGGGCCCTTG-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgD_CH1:</td>
			<td>GGGTGTCTGCACCCTGATA-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA_CH1:</td>
			<td>GAAGACCTTGGGGCTGGT-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgE1_CH1:</td>
			<td>GAAGACGGATGGGCTCTGT-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgE2_CH1:</td>
			<td>TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ_CH1:</td>
			<td>TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3-5' '</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ_CH1:</td>
			<td>AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3-5' '</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 면역 글로불린의 PCR 확대를 위한 뇌관 순서
2. 핵 산 격리 면역 세포와 조직에서
참고: 아래에 주어진 프로시저 마우스 비장에서 핵 산 추출입니다. 그러나, 그것은 다른 면역 조직 및 림프절 등 인간의 세포 또는 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) (그림 1B)에 적용 됩니다.
<ol><li>Dissect는 조직, 예를 들어, 8 주 된 C57BL/6 마우스에서 비장 하 고 분산 된 세포를 PBS 버퍼의 2 mL와 스테인레스 스틸 메쉬 (200에서 400 µ m) 통과. 세포 현 탁 액 2.0 mL microcentrifuge 튜브, 그리고 600 × g 및 4 ˚C에서 5 분 동안 원심 분리기에 전송. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>펠 릿에 ACK lysing 버퍼 (150mm NH4Cl, 1 m m KHCO3, 0.1 m m 나2EDTA, pH 7.2)의 800 µ L을 추가 하 고 조직에서 붉은 혈액 세포를 lyse를 2 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>2 mL PBS 3의와 함께 조직 세포를 씻어 x, 600 × g 및 4 ˚C에서 5 분 동안 원심 분리에 의해 따라.</li>
	<li>펠 릿, 페 놀/guanidine isothiocyanate 시 약의 800 µ L 추가 소용돌이 철저 하 게, 그리고 5 분 동안 약 25 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>클로 프롬 (200 µ L)를 추가, 15 수동으로 흔들어 s, 그리고 다음 2 분 약 25 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>12000 × g 25 ˚C에 15 분 동안 원심 분리에 의해 단계를 구분 하 고 신선한 튜브를 위 수성 단계를 전송 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올, 짧게 소용돌이의 한 볼륨을 추가 하 고 실리 카 스핀 열을 적용.</li>
	<li>물 30-100 µ L로 RNA elute</li>
	<li>Fluorometer (테이블의 재료)를 사용 하 여 초기 RNA 농도 quantitate</li>
	<li>-80 ˚C에서 순화 된 RNA를 저장 합니다.</li>
</ol>3. cDNA 합성 및 PCR 증폭
참고: 아래 설명 하는 방법은 5'-경주11,12 , 스마트 PCR 기법13에 근거한 다. 세부 사항 및 반응의 최적화 키트 15의 설명서에 설명 되어 있습니다. 마우스의 면역에 대 한 시작 물자는 단계의 2.10 샘플. 인간의 면역에 대 한 시작 물자는 샘플에서 인간의 조직, 출 PBMC, 처리 단계 2.3 2.10에서에서 설명한 대로.
<ol><li>5'-레이스 CD 뇌관 (올리고-dT-포함) 및 제조 업체의 지침15에 따라 스마트 PCR oligonucleotide (자료 테이블)를 사용 하 여 전체 RNA 템플릿의 10 µ g에 2에서 첫번째 물가 cDNA를 음성 합성.<ol>
<li>마우스 면역, 보편적인 앞으로 뇌관 및 면역 글로불린 클래스 전용 역방향 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 고 충실도 DNA 중 합 효소로 cDNA PCR 증폭에 대 한 로 열 순환 조건 설정: 2 분, 그리고 30 대 94 ˚C의 40 주기 94 ˚C s, 30 59 ˚C s, 그리고 30 대 72 ˚C s, 5 분 동안 72 ˚C에서 최종 확장 단계 뒤. 참고: 일반적인 실험 증폭 IgM, IgG1, IgG2c, Igk Igl 면역 글로불린 클래스를 보고 순진한, 종속 Th1 및 Th2 의존 B 세포 (그림 3).</li>
		<li>인간의 면역 글로불린, 1세인트 태그 시퀀스와 유니버설 앞으로 뇌관 및 면역 글로불린 클래스 전용 역방향 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 2차 PCR에 의해 각 샘플에 대 한 인덱스 시퀀스가 포함 인덱스 시퀀스 뇌관을 사용 하 여. 다음과 PCR와 Taq 중 합 효소를 사용 하 여: 2 분, 21 주기 (1세인트 PCR) 또는 30 94 ˚C에서 32 주기 (2차 PCR) 94 ˚C s, 30 59 ˚C s, 72 ˚C 30 s. 참고: 일반적인 실험 증폭 IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3와 IgG4), IgA (IgA1 및 IgA2), IgE, Igk Igl 면역 글로불린 클래스 모든 B 세포 인구 (그림 4)을 보면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Electrophorese는 agarose 젤에 PCR 제품 그리고 실리 카 막 스핀-열을 사용 하 여 600 ~ 800 bp 파편을 정화.<ol>
<li>3.2.1 또는 2 %agarose 젤에 3.2.2에서 샘플 electrophorese</li>
		<li>UV transilluminator에 DNA 밴드를 구상 하 고 600 ~ 800 사이 광범위 한 밴드를 포함 하는 젤-슬라이스를 삭제할 혈압.</li>
		<li>젤 조각의 10 밀리 그램 당 막 바인딩 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 혼합 하 고 젤 슬라이스 완전히 해산 될 때까지 50-65 ° C에서 품 어.</li>
		<li>실리 카 막 스핀-열에 젤 솔루션을 전송 합니다. 버퍼를 세척을 한 번 세척 하 고 DNA nuclease 무료 물 (자료 테이블)의 50 mL와 함께 elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NGS 시퀀싱에 대 한 동일 금액의 각 면역 글로불린 클래스에서 fluorometer 및 수영장 amplicons와 순화 amplicons 계량. 참고: 일반적으로 2-10 mg amplicon DNA는 각 면역 글로불린 클래스에 대 한 복구 했습니다. 동등 하 게 증가 50 mL 솔루션 10-20 ng/mL에 DNA를 포함 하 게 DNA에에서 각 샘플 솔루션을 혼합.</li>
	<li>크기와 DNA 크기 칩 (자료 테이블) 마이크로 모 세관 근거한 전기 이동 법을 사용 하 여 라이브러리의 농도 결정 합니다. -20 ° c.에 라이브러리를 저장</li>
</ol>4. NGS 시퀀싱 라이브러리의
<ol><li>시퀀싱 실행된 지정 샘플 이름, 인덱스 정보에 대 한 SampleSheet.cvs를 생성 하 고.fastq 파일만을 지시.</li>
	<li>해빙 시 카트리지 (자료 테이블)와 라이브러리.</li>
	<li>0.2 N NaOH를 확인 하 고 원하는 어 금 니 농도를 라이브러리를 희석.</li>
	<li>린스와 건조 흐름 셀. 시 약 카트리지의 우물에 희석 및 변성 라이브러리 솔루션의 600 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>시퀀싱 실행을 시작 합니다.</li>
</ol>5입니다. NGS 데이터의 품질 관리
<ol><li>16"FASTX-도구 키트" 사용 하 여 FASTQ 데이터의 품질 관리를 수행 합니다. 참고 사용 되는 매개 변수 설정의 기본적인 예는 다음과 같습니다.: fastq_quality_trimmer-v t 20-200 l-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fastq] fastq_quality_filter-v-q 20-p 80-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fastq] fastx_reverse_complement-v-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fastq]</li>
	<li>다음 명령을 사용 하 여 "fasta 핵 산 (.fna)"을 출력 파일 포맷: fastq_to_fasta-v-n-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fna]</li>
</ol>6. 추출 및.fna 데이터에서 면역 글로불린 시퀀스의 분석
참고: 예제 프로그램은 유닉스 환경에서 구현 되었다. 로 예를 들어 참조 성능 운영 체제와 하드웨어 환경에 따라 달라질 수 있습니다 때문에 그들을 사용 하십시오. 저자는 오류 또는 누락에 대 한 어떤 책임을 허용 하지 않습니다. 프로그래밍 언어, 펄17, R18및 필요한 모듈 인용된 웹사이트에 지시에 따라 설치 될 필요가 있다. IgBLAST 프로그램은 적절 한 웹사이트19,20에 대 한 지침에 따라 설치 될 필요가 있다.
<ol><li>Https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine에서의 레 퍼 토리 분석에 대 한 사내 프로그램 다음 예제를 다운로드: 03_PipeLine_Mouse.zip; 마우스 항 체 시퀀스의 분석에 대 한 예제 프로그램의 집합입니다. 05_PipeLine_Human.zip; 인간 항 체 시퀀스의 분석에 대 한 예제 프로그램의 집합입니다.</li>
	<li>항 체 읽고 시퀀스 데이터 추출: 각 면역 글로불린 일정 지역 (표 2)에 서명 시퀀스를 검색 Perl 프로그램에 의해 데이터 (.fna)에서 각 Ig 클래스의 면역 글로불린 (Ig) 시퀀스를 추출.<ol>
<li>마우스 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자에 대 한 다음 명령으로 읽기를 추출: $ 펄 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)]</li>
		<li>다음 명령을 사용 하 여 마우스 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자 추출 읽기: $ 펄 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)]</li>
		<li>인간의 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자에 대 한 다음 명령으로 읽기를 추출: $ 펄 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)]</li>
		<li>인간의 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자에 대 한 다음 명령으로 읽기를 추출: $ 펄 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [입력 파일 이름] [출력 파일 이름 (접미사)]</li>
	</ol>
</li>
	<li>주석을 추가 하 고 V (D) J 유전자 재조합의 생산성을 확인 하십시오. 참고: 아래 설명 하는 방법을 순서에 V (D) J 유전자 세그먼트의 주석에 대 한 독립 실행형 IgBLAST19 를 이용 한다. V (D) J 유전자에 대 한 데이터베이스 및 IgBLAST에 대 한 매개 변수 설정이 설명된20으로 설정 합니다.<ol>
<li>다음 명령을 사용 하 여 마우스 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자를 주석: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-유기 체 마우스-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName</li>
		<li>다음 명령을 사용 하 여 마우스 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자를 주석: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-유기 체 마우스-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName</li>
		<li>다음 명령을 사용 하 여 인간의 면역 글로불린 무거운 체인 (IgH) 유전자를 주석: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-유기 체 인간-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName</li>
		<li>다음 명령을 사용 하 여 인간의 면역 글로불린 경 쇄 (IgL) 유전자를 주석: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-유기 체 인간-domain_system imgt-쿼리. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/human_gl.aux-show_translation-outfmt 7 >>. / $OutName</li>
	</ol>
</li>
	<li>항 체 레 퍼 토리의 글로벌 기능을 시각화.<ol>
<li>다음 명령을 사용 하 여 마우스 IgH 레 퍼 토리를 시각화: $ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh 참고: 입력된 파일은 filename.fna (시퀀스 데이터), 선호 6.2.1에서 출력 파일. 이 파일은 "filename" 이라는 하위 디렉토리 (폴더)에 배치 해야 합니다. 쉘 스크립트의 50 라인에서 Para_4에 대 한 "파일 이름"을 할당 합니다.</li>
		<li>다음 명령을 사용 하 여 인간의 IgH 레 퍼 토리를 시각화: $ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh 참고: 입력된 파일 filename.fna 시퀀스 데이터, 선호 6.2.3의 출력 파일입니다. 이 파일을 배치 해야 하위 디렉토리 (폴더)에 그 이름은 "파일 이름". 쉘 스크립트의 46 라인에서 Para_4에 대 한 "파일 이름"을 할당 합니다.</li>
		<li>다음 명령을 사용 하 여 마우스 IgL 레 퍼 토리를 시각화: $ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh 참고:이 파이프라인 Igk와 Igl 처리 됩니다 수반. 입력된 파일은 filename.fna (시퀀스 데이터), 선호 6.2.2에서 출력 파일. 이 파일은 "filename" 이라는 하위 디렉토리 (폴더)에 배치 해야 합니다. 쉘 스크립트의 라인 53, "파일 이름" Para_4에 대 한 할당 합니다. 출력 파일의 이름을 "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt"로 끝나는 2 차원 막대 그래프 (그림 3, IgL)에 대 한 좌표를 제공합니다.</li>
		<li>다음 명령을 사용 하 여 인간의 IgL 레 퍼 토리를 시각화: $ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh 참고:이 파이프라인 Igk와 Igl 처리 됩니다 수반. 입력된 파일 filename.fna 시퀀스 데이터, 선호 6.2.4의 출력 파일입니다. 이 파일은 "filename" 이라는 하위 디렉토리 (폴더)에 배치 해야 합니다. 쉘 스크립트의 라인 53, "파일 이름" Para_4에 대 한 할당 합니다. 출력 파일 이름 "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt"로 끝나는 2 차원 막대 그래프 (그림 4, IgL)에 대 한 좌표를 제공 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

여기에 설명 된 메서드는 5'-경주 메서드를 사용 하 여 증폭 하는 항 체 RNA에 대 한 NGS를 활용 합니다. 타락 한 5'-VH 유전자 뇌관을 사용 하는 방법을 달리 각 항 체 클래스의 mRNAs 유니버설 앞으로 뇌관을 사용 하 여 균등 하 게 증폭 됩니다. 또한, 상수 지역 1 (CH1) 항 체 유전자의 특정 센스 프라이 머를 사용 하 여 특정 면역 글로불린 클래스의 프로 파일링 레 퍼 토리 수 있습니다. 이 매우 순진한 면역된 레파토리8,9비교 뿐만 아니라 클래스 특정 항 체 응답을 해 부에 대 한 도움이 됩니다.
방법의 가장 가능성이 함정이 증폭된 면역 글로불린 메시지의 부족 이다. 실질적으로이 프로토콜에 의해 얻은 항 체 레 퍼 토리의 깊이 3.1, 3.2 단계에 설명 된 PCR 증폭에 따라 달라 집니다. 레 퍼 토리 깊이 제대로 얻지 템플릿 cDNA 및 단계 3.2.1 또는 3.2.2 프라이 머의 비율 변경이 좋습니다.
일반적으로, 항 체 읽기 제작한 NGS의 약 20%는 모호한 시퀀스21. 도 설립 "보정 방법", 5-10% 유지 모호한3. 우리, 따라서 순서를 분석 하 고 면역 글로불린 일정 지역 (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, 등)에 해당 하는 서명 시퀀스를 포함 하는 원시 읽기를 필터링. 따라서 신체적인 하이퍼 돌연변이의 분석 주의 시험이 필요합니다.
이 방법의 제한 사항 중 하나는 면역 글로불린 무거운 이며 가벼운 체인 쌍은 유추 될 수 없습니다. 따라서이 방법에 의해 얻은 레 퍼 토리 보기 전체적 아니다. 그러나, 데이터10의 통계 분석에 의해 일류 쌍을 가능 하다. 또한, 소설 메서드 면역 글로불린 쌍은 순서를 보고 최근3,4.
출력.fna 데이터에서 면역 글로불린 시퀀스 면역 글로불린 유전자 서명 시퀀스의 존재에 따라 추출 되었다. V, D 및 J 유전자 세그먼트 했다 다음 주석 및 V (D) J 재배열의 생산성 평가 됐다. Complementarity 결정 지역 3 (CDR3) 시퀀스 또한 주석 했다. .Fna 데이터에 면역 글로불린 시퀀스의 체계적인 시험이 유용 IMGT/HighV-퀘스트 서버22,,2324에 의해 제공 되었다. 그러나, 자동화 된 처리 파이프라인을 구축 큰 실험 데이터를 분석 하는 장점이 있다. 각 목적을 위해 사용자 지정 파이프라인은 독립 실행형 IgBLAST 프로토콜19를 사용 하 여 설정 가능 합니다. 이 방법은 기본적인 프로그래밍 능력을 요구 하지만 면역 시스템의 상세한 분석에 매우 유용. 설명 된 파이프라인은 사용자 지정된 프로토콜 (그림 2)의 예입니다.
항 체의 수는 항 체 항 체 성분에 항 체 시스템의 반영 샘플에서 RNAs의 금액에 비례한 주어진 시간 포인트5,,825읽습니다. 여기 설명 하는 방법을 연구 프로그램8,,1826를 사용 하 여 레 퍼 토리는 항 체의 V (D) J 헌법의 조류의 눈 보기를 제공 합니다.
개별 순진한 쥐의 IgM 항 체 레파토리의 글로벌 보기 IgG1 또는 IgG2c8의 그에 비해 매우 보존된 VDJ 프로 파일을 공개 했다. 그것은 미 숙 zebrafish의 VDJ 조합 매우 진부한9는 알려졌다. 반면, 인간의 VDJ 조합 될 매우 괴상 한6을 보고 있습니다. 순진한 B 셀에는 높은 보존된 결정적 VDJ-프로필은 자동 항 본문에 제시 된 아마도 비우는 VDJ 재배열에 의해 생성 된 또는 부정적인 선택. 예를 들어 IGHV11-2은 태아 IgM 레 퍼 토리27 에 우선적으로 표현 되며이 우위 노화 적혈구27에 대 한 IGHV11-2의 autoreactivity에 기인 된다. 흥미롭게도, IGHV11-2 순진한 IgM8의 이전 게시 우리의 분석에 가장 일반적인 주요 레 퍼 토리도 했다.
여기에 설명 된 방법은 까지의 개별 기관, 주요 항 체 레파토리8의 실수로 누락을 피하에 생성 된 항 체 레 퍼 토리 공간을 분석 하 여 항 체 항 원 반응 레파토리를 해독 하는 데 유용 10. 이 메서드는 또한 것을 용이 하 게 상세한 항 체 네트워크 역동성의 시험 새로 신흥에 대 한 보호 항 체의 발견을 가속 수 있습니다 병원 체.

항 체 시스템 획득된 면역 시스템의 기본 중 하나입니다. 그것은 그것의 광대 한 다양성, 벌금 항 원 인식 특이성 및 항 원 특정 B 세포의 클론 확장 병원 체 침입에 대 한 매우 강력한. 항 체 생성 B 세포의 레 퍼 토리 10 이상으로 추정 되는 단일 개별1에서15 . 이 거 대 한 다양성은 면역 글로불린 유전자 loci2VDJ 유전자 재조합의 도움으로 생성 됩니다. 전체 B 세포 레파토리와 항 원 면역 반응에 그들의 동적 변화 설명 이지만 도전, 따라서 침입 병원 체에 대하여 항 체 응답에 대 한 완전 한 이해에 필수적인.
그들의 천문학 다양성 때문에 B 세포 레파토리 블랙 박스;로 간주 하고있다 그러나, NGS 기술의 출현에 도달해 그들의 복잡성3,4의 향상 된 이해를 수 있게 되었습니다. 전체 항 체 레파토리가 되었습니다 성공적으로 분석, 첫째로 zebrafish5, 다음 쥐는6, 그리고 인간의6,7. NGS는 적합 한 면역 반응의 연구에 강력한 도구가 되고있다 지금, 비록 기본적인 분석의 공통점과 차이점 개별 동물 중에서 항 체 레파토리에는 부족 한.
쥐, 그것은 IgM 레파토리는 개인 사이, 거의 동일한 반면 IgG1 및 IgG2c는 개인8사이 실질적으로 다른 것으로 알려졌다. V-유전자 사용 프로필 외에도 순진한 주변 B 셀에 VDJ 프로 파일의 관찰 된 주파수가 비슷합니다 매우 개인8사이. VDJ 영역의 아미노산 시퀀스의 분석 또한 보였다 같은 접합 시퀀스의 발생 다른 쥐 생각8이전 보다 훨씬 더 자주. 이 결과 항 체 레 퍼 토리 형성 메커니즘 보다는 확률적 결정적5,,89수를 나타냅니다. 생쥐에서 항 체 레 퍼 토리 개발의 과정은 또한 되었습니다 성공적으로 분석 NGS를 사용 하 여 추가 세부10항 체 면역 시스템을 밝히기 위해서 NGS의 잠재력을 강조 하.
이 보고서에서 우리는 시각화 하 고 분석 하는 세계적인 수준의 항 체 레 퍼 토리는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 스트립 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0452</td><td>120 스트립</td></tr><tr><td>100 bp DNA 래더</td><td>TOYOBO</td><td>DNA-035</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>2100 바이오 분석기 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA /2100</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Wako</td><td>017-00256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>아가로스, NuSieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50084</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 염화물</td><td>Wako</td><td>017-02995</td><td>500g</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Wako</td><td>038-02606</td><td>500mL</td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS (-)" 닛수이"</td><td>닛수이&nbsp;</td><td>08192</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 이나트륨 염 이수화물(2NA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td>500g</td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Cell Strainer</td><td></td><td>Falcon 352340</td><td>50/Case</td></tr><tr><td>ling lock tube 1.7 mL</td><td>BM EQUIPMENT</td><td>BM-15</td><td></td></tr><tr><td>ling lock tube 2.0 mL</td><td>BM EQUIPMENT</td><td>BM-20</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v2</td><td>illumina</td><td>MS-102-2003</td><td>500 cycles</td></tr><tr><td>MiSeq System</td><td>illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 분광광도계&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탄산수소칼</td>륨 <td>Wako</td><td>166-03275</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>생명 기술</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>500 어세이</td></tr><tr><td>더 스마트한 레이스 5'/3' 키트&nbsp;</td><td>클론텍&nbsp;</td><td></td><td></td>634858</tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq 핫 스타트 버전&nbsp;</td><td>주식회사 타카라 바이오&nbsp;</td><td>RR006A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>AmbionThermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>울트라 클리어 qPCR 캡슐</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0866</td><td>120 스트립</td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>A9282</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

항 체에 의해 항 원 인식의 엄청난 적응성 획득된 면역 체계의 기초 이다. 획득된 면역 시스템에 의해 항 체의 광대 한 레 퍼 토리의 생산을 기본 분자 메커니즘의 우리의 이해에도 불구 하 고 그것은 아직 되지 않았습니다 완전 한 항 체 레 퍼 토리의 전역 보기에서 도착 수 없습니다. 특히, B 셀 레파토리 항 체 클론의 그들의 천문학적인 수 블랙 박스도 간주 되었다 있다. 그러나, 차세대 시퀀싱 기술 B 셀 레 퍼 토리에 대 한 우리의 이해를 증가 하는 획기적인 사용 됩니다. 이 보고서에서 우리는 시각화 하 고 전체 개별 마우스 및 인간의 항 체 레파토리를 분석 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 면역 기관에서 대표적으로 생쥐에서 비장 및 인간, 말 초 혈액 단 셀에서 총 RNA 되었고 준비, 문자, 5'-경주 메서드를 사용 하 여 증폭. 항 체 클래스 관련 일정 도메인에 대 한 보편적인 앞으로 뇌관 및 센스 뇌관을 사용 하 여, 항 체 mRNAs 항 체 인구에 있는 그들의 주파수를 반영 비율에 균일 하 게 증폭 했다. amplicons 차세대 시퀀싱 (NGS), 면역학 샘플 당 10 이상5 항 체 시퀀스를 생성 하 여 시퀀싱 했다. 우리 V (D) J 유전자 세그먼트 주석, 항 체 레 퍼 토리, 그리고 우리의 계산 방법의 조감도 포함 하 여 항 체 시퀀스 분석에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스의 항 체 레파토리
전체적으로 murine 항 체 레 퍼 토리의 관점은 세포 또는 비장, 골 수, 림프절, 또는 혈액 같은 조직에서 얻어질 수 있다. 그림 3 에서 순진한 마우스 비장 경 쇄 (IgL) 레파토리 IgM, IgG1, IgG2c, 및 면역 글로불린의 대표적인 결과 보여준다. 읽기 숫자의 요약 표 3에 표시 됩니다. 예를 들어 166,175/475,144 읽기 포함 IgM 특정 서명 순서 (표 2) 그리고 133,371/166,175 읽기 VDJ 생산적 IgBLAST19유추 했다.
그림 3 은 3D-VDJ-음모, 각 볼의 크기 읽기;의 상대적 수를 나타냅니다에 의해 VDJ 재배열의 레 퍼 토리 프로 파일 즉, 모든 B 세포에서 항 체 mRNAs의 수입니다. 110 IGHV, 12 IGHD, 및 4 IGHJ, 염색체에 그들의 순서에 맞게 정렬 됩니다 3 차원 메쉬에 의하여 이루어져 있다. 또한, 무슨 IgBLAST에 의해 할당 된 유전자는 투자 골에서 7,215 노드를 야 기한 각 IGHV, IGHD 및 IGHJ 라인에 대 한 마지막 위치에 별도로 수집 했다.
또한, 그림 3 에 2D VJ 작 보여주는 IgL 레 퍼 토리에 VJ 재배치의 프로필 표시. 이 음모에 각 막대의 길이 읽기의 상대적 수를 나타냅니다. X 축 101 IGLVκ와 3 IGLVλ 유전자를 나타내고 y 축은 4 IGLJκ와 3 IGLJλ 유전자를 나타냅니다. Unannotated V-와 J-유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다.
Complementarity 결정 지역 3 (CDR3) 항 원 묶는 특이성의 대부분을 일으키 다, 이러한 생산성 읽기의 순서는 주어진 IgBLAST 출력에. 시퀀스를 통계적으로 분석 될 수 있다 CDR3 이전8,10설명으로 생물 학적 또는 기술적인 복제를 포함 하 여.
인간 항 체 레파토리
전체적으로 인간 항 체 레 퍼 토리의 관점에서 다양 한 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs)를 포함 하 여 조직 또는 병 적인 조직을 분석할 수 있습니다. 그림 4 는 대표적인 결과의 IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4) 총, 총 (IgA1 및 IgA2) IgA, IgD, IgE 및 IgL 정상 PBMCs에서 레파토리. 읽기 숫자의 요약 표 3에 표시 됩니다. 예를 들어 90,238/1,582,754 읽기 IgM 특정 서명 시퀀스를 포함 하 고 67,896/90,238 읽기 VDJ 생산성이 있었다.
VDJ 재배열의 레 퍼 토리 프로 파일에 3D-VDJ-각 볼의 크기 읽기;의 상대적 수를 나타냅니다 표시 됩니다. 즉, 전체 PBMCs (그림 4)에서 항 체 mRNAs의 수입니다. 3 차원 메쉬 구성 56 IGHV, 27 IGHD 및 6 IGHJ, 염색체에 나타나는 순서로 정렬 됩니다. 또한, 무슨 IgBLAST에 의해 할당 된 유전자는 투자 골에서 11,172 노드를 야 기한 각 IGHV, IGHD 및 IGHJ 라인에 대 한 마지막 위치에 별도로 표시 됩니다.
IgL 레 퍼 토리에 VJ 재배치의 프로필 2D-VJ-음모 각 막대의 길이 읽기 (그림 4)의 상대적 수를 나타냅니다에서 묘사 된다. X 축 41 IGLVκ와 32 IGLVλ 유전자를 나타내고 y 5 IGLJκ 5 IGLJλ 유전자를 나타냅니다. 유엔-주석 V-와 J-유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다.
인간의 CDR3 시퀀스 IgBLAST에 주어진 출력 하 고 앞에서 설명한8,10통계적으로 분석 될 수 있다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>면역 글로불린 클래스</td>
			<td>감각</td>
			<td>Antisense</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">마우스의 면역 글로불린 중 연쇄 (C57BL/6)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM</td>
			<td>AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC</td>
			<td>GACATTTGGGAAGGACTGACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG1</td>
			<td>AAAACGACACCCCCATCTGTC</td>
			<td>GACAGATGGGGGTGTCGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>(IgG1 변형)</td>
			<td>AAAACAACACCCCCATCAGTC</td>
			<td>GACTGATGGGGGTGTTGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG2c</td>
			<td>AAAACAACAGCCCCATCGGTC</td>
			<td>GACCGATGGGGCTGTTGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG3</td>
			<td>GTGATCCCGTGATAATCGGCT</td>
			<td>AGCCGATTATCACGGGATCAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA</td>
			<td>TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG</td>
			<td>TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">마우스의 면역 글로불린 경 쇄 (C57BL/6)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ</td>
			<td>CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC</td>
			<td>GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ1</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG</td>
			<td>CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ2</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG</td>
			<td>CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ3</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG</td>
			<td>CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ4</td>
			<td>TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG</td>
			<td>CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">인간 면역 글로불린 중 연쇄</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM</td>
			<td>GGGAGTGCATCCGCCCCAAC</td>
			<td>GTTGGGGCGGATGCACTCCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG</td>
			<td>GCTTCCACCAAGGGCCCATC</td>
			<td>GATGGGCCCTTGGTGGAAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA</td>
			<td>GCATCCCCGACCAGCCCCAA</td>
			<td>GACCGATGGGGCTGTTGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgD</td>
			<td>GCACCCACCAAGGCTCCGGA</td>
			<td>TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgE</td>
			<td>GCCTCCACACAGAGCCCATC</td>
			<td>GATGGGCTCTGTGTGGAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">인간 면역 글로불린 경 쇄</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ</td>
			<td>ACTGTGGCTGCACCATCTGC</td>
			<td>GCAGATGGTGCAGCCACAGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ1, 2, 6</td>
			<td>GTCACTCTGTTCCCGCCCTC</td>
			<td>GAGGGCGGGAACAGAGTGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ3, 7</td>
			<td>GTCACTCTGTTCCCACCCTC</td>
			<td>GAGGGTGGGAACAGAGTGAC</td>
		</tr>
</tbody></table>면역 글로불린 서명 시퀀스의 표 2: 요약

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>마우스 고등학교</td>
			<td>총 읽습니다</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>IgG2c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>입력</td>
			<td>475,144</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgC를 포함 하</td>
			<td></td>
			<td>166,175</td>
			<td>229,671</td>
			<td>36,628</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>VDJ 생산성</td>
			<td></td>
			<td>133,371</td>
			<td>196,583</td>
			<td>31,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>마우스 IgL</td>
			<td>총 읽습니다</td>
			<td>IgKappa</td>
			<td>IgLambda</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>입력</td>
			<td>527,668</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgC를 포함 하</td>
			<td></td>
			<td>178,948</td>
			<td>21,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>VJ 생산성</td>
			<td></td>
			<td>160,924</td>
			<td>16,988</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>인간 고등학교</td>
			<td>총 읽습니다</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
			<td>IgA</td>
			<td>IgD</td>
			<td>IgE</td>
		</tr>
<tr>
<td>입력</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgC를 포함 하</td>
			<td></td>
			<td>90,238</td>
			<td>5,298</td>
			<td>94,061</td>
			<td>75,549</td>
			<td>2,932</td>
		</tr>
<tr>
<td>VDJ 생산성</td>
			<td></td>
			<td>67,896</td>
			<td>2,775</td>
			<td>78,203</td>
			<td>56,495</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>인간의 IgL</td>
			<td>총 읽습니다</td>
			<td>IgKappa</td>
			<td>IgLambda</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>입력</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgC를 포함 하</td>
			<td></td>
			<td>120,316</td>
			<td>64,148</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>VJ 생산성</td>
			<td></td>
			<td>97,169</td>
			<td>52,324</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>실험에서 읽기 숫자의 표 3: 요약
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig1.jpg"> 그림 1: 개별 생쥐에서 항 체 레파토리를 분석 하기 위한 연속 전략의 도식 대표. (면역 세포 또는 조직에서 A) 총 RNA 리버스 변하게 되었고 앞으로 보편적인 뇌관을 사용 하 여 PCR 증폭 하 고 면역 글로불린 클래스별 반전 뇌관. 각 면역 글로불린 클래스에서 amplicons 풀링된 되었고-세대 시퀀싱에 대 한 렌더링. (B)는 생물 복제와 같은 C57BL/6 쥐에서 spleens 다음과 같이 취급 했다: 총 RNAs 비장 샘플에서 순화 했다 그리고 cDNAs 5'-경주 보편적인 뇌관 및 항 체 클래스 특정 뇌관을 사용 하 여에 의해 증폭 했다. 그들은 다음 라벨 개별 쥐를 위한 뇌관으로 차세대 시퀀싱에 대 한 렌더링 했다. 그림의 부품은8 동의에서 적응입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig2.jpg"> 그림 2: 개별 생쥐에서 항 체 레파토리를 분석 하기 위한 데이터 처리 순서도의 도식. 차세대 시퀀싱 후 얻은 Amplicon 읽기는 다음과 같이 처리 했다: (1) 읽기 시퀀스 항 체 클래스 관련 서명 시퀀스;의 존재에 대 한 확인 (2) 시퀀스 v, D, 시험 되었다 그리고 J 유전자 조각 IMGT/HighV-퀘스트 및 IgBLAST;를 사용 하 여 (3) 시퀀스 생산적인 VDJ 접합을 포함 하는 수집 된; (4) 이러한 시퀀스 사용 되었다 CDR3, 전체 레 퍼 토리 기능의 분석 등 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig3.jpg"> 그림 3: 마우스 항 체 레파토리에 대 한 글로벌 데이터 시각화. 각 항 체 클래스의 전체 레 퍼 토리 프로필 3D VDJ 음모에 의해 구상 했다. X 축 110 IGHV 유전자를 염색체에 지시를 나타냅니다. y-축 및 z 축 나타냅니다 12 IGHD 4 IGHJ 유전자, 각각. 각 노드에서 분야의 볼륨 읽기 수를 나타냅니다. 빨간 분야: 유엔 주석 V, D 및 J 유전자. IgL 읽기 배포판에 2D-VJ-각 막대의 길이 읽기의 상대적 수를 나타냅니다 표시 됩니다. X 축 x IGLVκ와 3 x IGLVλ 유전자, 101 나타내고 y 축은 4 x IGLJκ와 3 x IGLJλ 유전자를 나타냅니다. 유엔-주석 V와 J 유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig4.jpg"> 그림 4: 인간 항 체 레파토리에 대 한 글로벌 데이터 시각화. 각 항 체 클래스의 전체 레 퍼 토리 프로필 3D VDJ 음모에 의해 구상 했다. X 축 56 IGHV 유전자를 염색체에 지시를 나타냅니다. y-축 및 z 축 나타냅니다 27 IGHD 및 6 IGHJ 유전자, 각각. 각 노드에서 분야의 볼륨 읽기 수를 나타냅니다. 빨간 분야: 유엔 주석 V, D 및 J 유전자. IgL 읽기 2D-VJ-줄거리 각 막대의 길이 읽기의 상대적 수를 나타냅니다에 짓고 있다. X 축 IGLVκ 32 x IGLVλ 유전자, x 41 나타내고 y IGLJκ과 x IGLJλ 유전자 5 x 5를 나타냅니다. 유엔-주석 V-와 J-유전자 오른쪽 경계선에 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리는 프로토콜 분석 및 구조 시각화 및 전체 항 체 레파토리의 헌법에 대 한 설명. 이 다음-세대 시퀀싱을 사용 하 여 항 체 RNA의 광대 한 시퀀스의 수집을 포함 한다.

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

이 비디오에서는 전 세계 수준에서 항체 레퍼토리를 시각화하고 분석하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 그것은 개별에 있는 전체 B 세포 레퍼토리 및 면역 자극에 응하여 그들의 동적 변경을 기술하는 것이 가능합니다. 이 방법은 신흥 바이러스 감염의 환자로부터 병리학 적 샘플을 분석하고 감염의 병인에 대한 전례없는 통찰력으로 데이터를 얻기 위해 적용 될 수있다.응용 프로그램에 대 한 가장 흥미로운 영역 중 하나는 백신 제어. 백신 효능은 백신 투여 된 개인의 글로벌 항체 레퍼토리의 역학을 분석하여 평가 될 수있다. 개별은 항체 유전자 증폭의 효율성이 개시 물질의 모형에 달려 있기 때문에 PCR 조건을 최적화할 필요가 있을 수 있습니다 이 방법에 새로운.면역 글로불린 앰플리컨의 식별을 위한 Fla-cher. 이러한 작업을 시각적으로 보여 주는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 야마구치 사우리 씨와 제 실험실에서 기술자이자 대학원생인 한빙 쉬(Hanbing Xue) 씨가 될 것입니다.이 절차를 시작하려면 8 주 된 C57 블랙 6 마우스에서 조직을 해부하고 분산 된 세포를 얻기 위해 PBS의 두 밀리리터와 스테인레스 스틸 메쉬를 통과. 세포 현탁액을 2밀리리터 미세원심분리기 튜브와 원심분리기로 600배, 섭씨 4도에서 5분간 전달합니다. 상체를 버리고 800 마이크로리터의 ACK 리싱 버퍼를 펠릿에 추가합니다.조직에 있는 적혈구를 lyse 2 분 동안 얼음에 배양. 다음으로, 각 세척에 대해 PBS의 3 밀리리터를 사용하여 조직 세포를 세 번 씻는다. 원심분리기는 다시 600배, 섭씨 4도에서 5분간 다시 원심분리기를 드시면 됩니다.상체를 버리고 페놀/구아니딘 이소티오카네이트 시약 800마이크로리터를 펠릿과 소용돌이에 철저히 넣습니다. 섭씨 25도에서 5분간 배양하세요. 그런 다음 200 마이크로리터의 클로로폼을 추가하고 15초 동안 수동으로 흔들어 줍니다.2분 동안 섭씨 25도에서 배양하십시오. 원심분리기는 12, 000배, 섭씨 25도에서 위상을 분리합니다. 상부 수성 단계를 신선한 튜브로 옮기십시오.70%의 에탄올 한 부피를 추가합니다. 소용돌이를 간략하게 적용하여 실리카 스핀 컬럼에 이 혼합물을 적용합니다. 30~100마이크로리터의 물로 RNA를 엘테.그 후, 초기 RNA 농도를 양화하기 위해 형광계를 사용한다. 정제된 RNA를 영하 80도에 보관하십시오. 먼저, 제조사의 지침에 따라 5'RACE CDS 프라이머와 SMART-PCR 올리고뉴클레오티드를 사용하여 총 RNA 템플릿의 2~10마이크로그램에서 제1가닥 cDNA를 합성한다.마우스 면역글로불린의 경우, PCR은 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 범용 전방 프라이머 및 면역글로불린 클래스별 역프라이머를 사용하여 고충실도 DNA 폴리머라제로 cDNA를 증폭시한다. 인간 면역글로불린의 경우, 태그 시퀀스를 가진 범용 전방 프라이머 및 면역글로불린 클래스 별 역프라이머를 사용하여 제1 PCR을 수행한다. 인덱스 시퀀스 프라이머를 사용하여 두 번째 PCR별로 각 샘플에 대한 인덱스 시퀀스를 포함합니다.다음으로, 2%아가로즈 젤의 PCR 제품 중 하나. UV 트랜틸루미네이터에 DNA 밴드를 시각화하고 600~800개의 베이스 쌍 사이의 넓은 밴드를 포함하는 젤 슬라이스를 절제합니다. 젤 슬라이스 10밀리그램당 멤브레인 결합 용액 10마이크로리터를 추가합니다.젤 슬라이스가 완전히 녹을 때까지 섭씨 50~65도에서 혼합하고 배양합니다. 그런 다음, 실리카 멤브레인 스핀 컬럼에 겔 용액을 전달한다. 세척 버퍼로 한 번 컬럼을 씻고 50 마이크로 리터의 뉴클레아제없는 물로 DNA를 엘로우.불소계를 사용하여, 정제된 앰플리턴을 정량화하고 NGS 시퀀싱에 대해 동일한 양으로 각 면역글로불린 클래스의 앰플리온을 풀링한다. 그 후 DNA 크기 조정 칩을 사용한 마이크로모세필계 전기포진을 사용하여 라이브러리의 크기와 농도를 결정한다. 라이브러리를 영하 20도에 보관하십시오.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시퀀싱 실행의 샘플 스프레드시트를 생성합니다. 다음으로 시약 카트리지와 라이브러리를 해동합니다. 수산화 나트륨의 0.2 정상 용액을 만들고 원하는 어금니 농도를 얻기 위해 라이브러리를 희석한다.그런 다음, 유량 셀을 헹구고 건조시키고 희석및 변성 라이브러리 용액600마이크로리터를 시약 카트리지의 우물에 넣고 시퀀싱 실행을 시작합니다. 전체적으로 뮤린 항체 레퍼토리의 원근은 비장, 골수, 림프절 또는 혈액과 같은 세포 또는 조직에서 얻을 수 있다. Naïve 마우스 비장의 IgM, IgG1, IgG2c 및 면역 글로불린 라이트 체인 레퍼토리의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.3D V(D)J 플롯에 의한 V(D)J 재배열에서 각 공의 크기는 상대적인 읽기 수를 나타냅니다. 즉, 전체 B 세포에서 항체 mRNA의 수를 나타낸다. 3D 메쉬는 110개의 면역글로불린 중형 사슬 V 유전자, 12개의 면역글로불린 무거운 사슬 D 유전자 및 염색체에 그들의 순서를 반영하기 위하여 정렬되는 4개의 면역글로불린 무거운 사슬 J 유전자로 이루어져 있습니다.2D VJ 플롯은 IGL 레퍼토리에서 VJ 재배열의 프로필을 보여줍니다. 각 막대의 길이는 상대읽기 수를 나타냅니다. X축은 101면역글로불린 라이트 체인 V-카파 유전자, 3개의 면역글로불린 라이트 체인 V-람다 유전자를 나타내며, Y축은 4개의 면역글로불린 광사슬 J-kappa 유전자, 및 3개의 면역글로불린 라이트 체인 J-lambda 유전자를 나타낸다.인간 항체 레퍼토리의 관점은 전체적으로 말초 혈액 단핵 세포 또는 병리학 적 조직을 포함한 다양한 조직에서 분석 될 수있다. IgM의 대표적인 결과, 총 IgG, 총 IgA, IgD, IgE 및 IgL 레퍼토리의 정상 말초 혈액 단핵 세포에서 여기에 표시됩니다. 뮤린 모델과 마찬가지로 V(D)J 재배열의 레퍼토리 프로파일은 각 공의 크기가 판독 횟수를 나타내는 3D V(D)J 플롯에 표시됩니다.3D 메쉬는 56개의 면역글로불린 중형 사슬 V 유전자, 27개의 면역글로불린 중형 사슬 D 유전자 및 6개의 면역글로불린 무거운 사슬 J 유전자로 이루어져, 염색체에 나타나는 순서로 정렬됩니다. IgL 레퍼토리의 VJ 재배열 프로필은 각 막대의 길이가 판독횟수를 나타내는 2D VJ 플롯에 묘사됩니다. X축은 41개의 면역글로불린 라이트 체인 V-카파 유전자, 및 32개의 면역글로불린 라이트 체인 V-람다 유전자를 나타내며, Y축은 5개의 면역글로불린 광사슬 J-kappa 유전자및 5개의 면역글로불린 광사슬 J-lambda 유전자를 나타낸다.이 프로토콜의 연구 자료에서, 유동 세포측정또는 병리학적인 견본의 극저온섹션에 의하여 정렬된 세포의 소수는 이용가능합니다. 그러나 PCR 조건의 신중한 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜의 출력 정보는 거대하기 때문에 생물 정보 학문해력은 항체 네트워크의 구조를 찾는 데 도움이 될 것입니다.그것은 면역 계통의 깊은 이해로 선행되지 않을 것입니다.

identification-mouse-human-antibody-repertoires-next-generation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.

MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

선물이 여기 각 somite 파생 (myotome, sclerotome, dermatome, 및 syndetome)에 인간 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대 한 프로토콜 정의 화학적 조건에서 미래의 질병 모델링에 응용 프로그램에는 고 정형 외과에서 세포 기반 요법입니다.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

현재 프로토콜은 혈액 샘플 및 장 생검에서 DNA 절연을 위한 방법을 설명합니다, 차세대 시퀀싱을 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, NGS 실행의 성능 및 기본 데이터 분석.

차세대 시퀀싱을 이용한 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리 분석

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

학습하세요 마우스 조직에서 B 세포를 분리하고 차세대 시퀀싱으로 항체 레파토리를 분석하는 방법을. 이 기술은 면역 반응 동역학을 평가하여 백신 효능 연구와 질병 병인론 이해에 활용됩니다.

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

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