Name: 절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 인간 탯줄 유래 중간 엽 줄기세포(UC-MSC)의 분리 및 특성화 방법을 통해 조직 재생 및 난치성 질환 치료 연구에 활용하는 기술입니다. 이 프로토콜은 조기 및 만삭 영아에서 일관된 세포 분리와 활발한 증식을 가능하게 합니다.

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이 작품은 Scientific Research (C)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다 (번호 부여: 25461644)와 젊은 과학자 (B) (번호 부여: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) JSP KAKENHI의.

이 연구에 대 한 인간의 샘플의 사용 고베 대학 대학원의 학부 (승인 제 1370, 1694)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 승인된 지침에 따라 실시.
1. 격리와 UC MSCs의 문화
참고: UC-MSCs 성공적으로 격리 된, 교양, 그리고 확장된 (이상 통로 번호 4) 200 이상에서 UCs이이 프로토콜을 복종. 이상의 200 간에 UCs, 100% 나타났습니다 성공적인 UC MSC 격리, 5% 미만 15%로 나타났습니다 성장 검거 하 고 80% 이상 성공적인 UC MSC 확장 우발적인 오염 나타났습니다.
<ol><li>
UC를 수집 합니다.
	<ol>
<li>50 mL 플라스틱 튜브를 준비, 무 균가 위, 그리고 알파의 500 mL 병 4 ° c.에이 글의 최소 필수 매체 (알파 MEM) 수정</li>
		<li>Aseptically 길이에서 대략 5-10 cm에서 수술 시저와 UC 잘라 고 제왕 절 개 하 여 신생아 출생 후 곧 그것을 수집 합니다.</li>
		<li>즉시는 UC 50ml 플라스틱 튜브에 놓고 MEM 튜브에 알파의 20-30 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>그것은 실험실에 수송 될 때까지 실 온 (RT)에서 UC를 저장 합니다. 참고: 무 균 UC 최대 2 일 동안 RT에서 혈 청 자유로운 매체에 저장할 수 있습니다. 따라서, 2 일 이내 실험실으로 전달 되는 경우 인근 병원에서 얻은 UC는 수집할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UC를 해 부.
	<ol>
<li>플라스틱 트레이, 소독된가 위, 집게, 10 mL 펫 25 mL 펫, 2 개의 60 m m 조직 문화 요리, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비, 정제 효소 혼합 (참조 테이블의 자료, 농도에서 살 균 PBS와 재구성 13 Wünsch 단위/mL의-80 ° C에 저장), 그리고 감소 된 혈 청 매체의 500 mL 병 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>PBS, 정제 효소를 따뜻한 혼합, 실시간으로 혈 청 매체와 문화 매체 [알파 MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (AA) 4 ° C에 저장]을 감소</li>
		<li>튜브에서 UC를 꺼내와 플라스틱 쟁반에.</li>
		<li>무게 하 고 소독된가 위 UC의 5 g를 해 부.</li>
		<li>10 mL 피 펫을 사용 하 여 살 균을 위한 UC의 70% 에탄올 10 mL 붓는 다.</li>
		<li>PBS는 10 mL 피 펫을 사용 하 여 두 번의 10 mL와 UC를 씻어.</li>
		<li>멸 균된 60 m m 조직 문화 접시에는 UC를 놓습니다 ( 그림 1, 1 단계 참조).</li>
		<li>접시에 감소 된 혈 청 매체의 10 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>정제 효소 혼합 약 0.62 Wünsch 단위/mL의 최종 농도 도달의 0.5 mL를 추가 합니다. 참고: 전통적인 콜라 대신 정제 효소 혼합의 사용 수율을 향상을 보여줘 왔다 그리고 UC MSCs의 UC에서 격리.</li>
		<li>집게 (참조 그림 1, 2 단계)와 소독된가 위는 UC 2-3 m m 조각으로 잘라. 참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다.</li>
		<li>UC 조각 5% CO2 배양 기에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>부분적으로 소화 된 UC 조각 25 mL 피 펫을 쉽게 통과 하는 작은 조각으로 잘라. 참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다.</li>
		<li>작은 UC 조각 5% CO2 배양 기에서 15-45 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 부 화는 homogenates 점성 될 때까지 계속 해야 합니다. 총 소화 시간은 약 120 분입니다. 그러나 Preterm 유아에서 UCs를 사용 하는 경우, 소화 시간 단축 수 있다 수 있기 때문에 그는 쉽게 잘라 소화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UC-MSCs를 격리 합니다.
	<ol>
<li>4 50 mL 플라스틱 튜브와 문화 매체의 500 mL 병을 준비 합니다.</li>
		<li>UC homogenate를 2 50ml 플라스틱 튜브 각 튜브에 약 7.5 mL와 함께 25 mL 피 펫을 사용 하 여 나눕니다.</li>
		<li>각 관으로 문화 매체의 20 mL를 추가 하 고 잘 혼합.</li>
		<li>25 mL 피 펫을 사용 하 여 UC 파생 된 세포를 수집 하는 새로운 50 mL 컬렉션 튜브 위에 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 각 UC homogenate를 필터링 합니다. 참고: 소화 UC 솔루션은 끈 적이 과정 각각 15 분 정도 걸립니다.</li>
		<li>5 분 동안 1000 x g에서 두 튜브 원심</li>
		<li>신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.</li>
		<li>문화 매체의 5 mL와 함께 두 개의 튜브에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 60 m m 플레이트에 세포 현 탁 액을 전송 ( 그림 1, 3 단계 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
-MSCs 문화 Uc입니다.
	<ol>
<li>PBS, 트립 신-EDTA (0.25 w/v%), 워밍업 및 매체 문화 (알파 MEM 10 %FBS 1 %AA 포함) 실시간을</li>
		<li>셀 60 m m 플레이트에 장착 하는 경우 문화 매체를 제거 하 고 두 번 파편과 적혈구를 제거 하는 PBS의 5 mL로 씻어. 참고: 연결 된 셀은 일반적으로 초기 도금 후 3-5 일에 나타납니다 ( 그림 1, 4 단계 참조).</li>
		<li>두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어. 참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 7-14 일 걸립니다.</li>
		<li>5 mL의 PBS로 세척 세포는 두 번, 트립 신-EDTA의 0.5 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).</li>
		<li>두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어. 참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 4-8 일 걸립니다.</li>
		<li>10 mL PBS의 셀을 두 번 씻어 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 두 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).</li>
		<li>10 번째 통로까지 subculture (1:2 분할)을 반복 ( 그림 1, 5 단계 참조). 참고: 적은 confluent 조건 하에서 경작 하는 세포는 이전 확산 체포를 도달 하는 경향이, 때문에 분할 비율 1: 2의 통로 세포에 중요 하다.</li>
		<li>5 8 통로에 세포를 사용 하 여 세포 표면 마커 분석, 세포 감 별 법 분석 실험, 및 다른 실험에 대 한. 참고: 유지 하기 위해 가능한 한 길게를 위한 활발 한 증식, 세포 일반적으로 70-80 %confluent 조건 보다 더 아래 교양.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 표면 마커 UC MSCs의 표현
<ol><li>셀 100 mm 접시에 준비 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 트립 신-EDTA의 1 mL와 함께 그들을 떼어 놓다.</li>
	<li>5 분 동안 1000 x g에서 문화 매체와 원심 분리기의 9 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.</li>
	<li>PBS의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 고 1000 x g에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 두 번이 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>~ 1 × 106 셀/mL에서 교류 cytometry (FCM) 버퍼 (PBS 2 mM EDTA 및 10% 차단 시 약 포함)에 포함 된 셀을 resuspend.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 50-100 µ L를 전송 phycoerythrin (PE) 추가-CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, 또는 HLA-DR;에 대 한 항 체를 활용 그리고 45 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>FCM과 워시 셀 두 번 버퍼링 하 고 0.2% 생존 염료 솔루션의 50-100 µ L를 추가 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 15 분, FCM 버퍼 두 번 세척 세포 및 필터 셀에 대 한 RT에서 품 어.</li>
	<li>FCM을 통해 셀을 실행 하 고 제조업체의 지침에 따라 FCM 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 결과 분석.</li>
</ol>3. Trilineage UC MSCs의 차별화
<ol><li>
지질을 수행 합니다.
	<ol>
<li>5 × 103 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.</li>
		<li>12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.</li>
		<li>Adipogenic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조)와 2-3 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 adipogenic 차별화 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>PBS와 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어</li>
		<li>셀 60% 소 프로 파 놀과 PBS 세 번 세 번 씻어.</li>
		<li>0.5% 기름 빨간 O 솔루션 준비 석유의 84 mg를 용 해 하 여 빨간 O 100% 소 프로 파 놀과 추가의 6.7 mL 10 mL에서 증류수. 20 분에 대 한 실시간에 0.5% 기름 빨간 O 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.</li>
		<li>60% 소 프로 파 놀과 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
골을 수행 합니다.
	<ol>
<li>1 × 104 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.</li>
		<li>12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.</li>
		<li>Osteogeneic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조) 고 1-2 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 osteogenic 차별화 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>PBS와 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어</li>
		<li>PBS와 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>알리자린의 200 mg를 용 해 하 여 2% 붉은 알리자린 S 용액 준비 빨간색 S 증류수 10 mL로. 2% 붉은 알리자린 S 솔루션 RT에서 3 분의 1 mL로 세포 얼룩.</li>
		<li>PBS와 웰 스 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chondrogenesis을 수행 합니다.
	<ol>
<li>1.6 × 107 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.</li>
		<li>12-잘 접시 (micromass 문화)의 중심에 세포 현 탁 액의 5 µ L 방울을 배치 하 고 2-3 h 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>부드럽게 chondrogenic 차별화 매체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 및 4-7 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어. 일주일에 두 번 chondrogenic 차별화 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>PBS와 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어</li>
		<li>PBS와 셀 세 번 씻어.</li>
		<li>Ph 4.1 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼의 500 mL와 함께 블루 톨루이의 250 mg를 용 해 하 여 0.05% 톨루이 블루 솔루션을 준비 합니다. 30 분에 대 한 실시간에 0.05% 톨루이 블루 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.</li>
		<li>PBS와 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

MSCs는 다양 한 조직에서에서 고립 될 수 있다 고 할 모든 익스프레스 같은 phenotypic 표식 셀의 이종 인구. 여기, 우리는 preterm와 기간 유아에서 수집 및 UC의 해 부 가이드 및 절연 UC MSCs의 문화를 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 했다. 이 프로토콜에 따라 우리는 성공적으로 고립 된 UC-MSCs ISCT 기준19 태아/유아 임신 19-40 주에 전달 하 고 다루기 힘든 질병 이상의 일부 측면을 나타내는 시연에서 충족 동안 태아 개발11,12.
BM 파생 MSCs (BM-MSCs), 젊은 기증자 파생 BM MSCs 일반적으로 이전 보다 더 큰 증식 및 differentiative 잠재력을 표시 하 고 셀 치료20,<sup class="xre...

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 원래 고 골에서 (BM)1,2 특징 하지만 또한 다양 한 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프 및 태아 부속을 포함 하 여 조직에서에서 얻을 수 있습니다. 3. MSCs 격 증 하 고 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 인구로 서 인식 됩니다. MSCs 상해의 사이트로 마이그레이션할 억제 하 고 면역 반응을 조절 하는 능력을 소유 하는 또한, 개장 하 고 상해를 복구. 현재, 서로 다른 소스에서 MSCs 이식-비교-호스트 질병, 심근 경색 및 뇌4,5 포함 하 여 다루기 힘든 질병의 숫자에 대 한 세포 치료에 대 한 원본으로 성장 관심을 받고 있다 .
BM은 MSCs의 가장 좋은 특징이 소스, BM 포부의 침입은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 반면, 태 반, 탯 줄 혈액 (UCB) 등 태아 부속에서 얻은 태아 MSCs 및 탯 (UC) 샘플링 하 고 강력한 확산 및 감 별 법 용량6 덜 윤리적 문제를 포함 하는 장점이 있다 , 7. 중 의료 폐기물로 폐기 보통 태아 부속, UCB와 UC는 간주 태아 기관 태 fetomaternal 간주 됩니다. 또한, 태 반 및 UCB 샘플링 하 여 태 반 및 UC 수집 하 고 신생아 배달 후 처리 될 수 있습니다 신생아 배달의 정확한 순간에 수집 해야 합니다. 따라서, UC 세포 치료8,9대 유망 MSC 소스 이다.
인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 진보적인 확장 개발을 시작 하 고 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고 신생아 배달10의 전체 기간 동안 고립 될 수 있다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리는 다양 한 임신 성 연령11,12에서 제공 하는 유아에서 UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 사용 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 하 고 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC-MSCs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>50 mL 플라스틱 튜브</td><td>AS One Coporation, 오사카, 일본</td><td>Violamo 1-3500-22</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td><td>Iwaki 3815-012</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td><td>Iwaki 3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (100 &mu; m)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>Falcon 35-2360</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 (70 &mu; m)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>Falcon 35-2350</td><td></td></tr><tr><td>Alpha MEM</td><td>Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td><td>135-15175</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td><td>OPTI-MEM Gibco 31985-070</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>Gibco 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td><td>209-16941</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara BIO, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>정제 효소 혼합물</td><td>Roche, Mannheim, Germany</td><td>Liberase DH Research Grade 05401054001</td><td></td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD14</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>347497</td><td>Lot: 3220644, RRID:</td></tr><tr><td>CD19 BD Bioscience에 대한 AB_400312 PE 결합 마우스 1차 항체</td><td>, Franklin Lakes, NJ</td><td>340364</td><td>Lot: 3198741, RRID:</td></tr><tr><td>CD34 BD Bioscience에 대한 AB_400018 PE 결합 마우스 1차 항체</td><td>, Franklin Lakes, NJ</td><td>555822</td><td>Lot: 3079912, RRID:</td></tr><tr><td>CD45 BD Bioscience에 대한 AB_396151 PE 결합 마우스 1차 항체</td><td>, Franklin Lakes, NJ</td><td>555483</td><td>Lot: 2300520, RRID:</td></tr><tr><td>CD73 BD Bioscience에 대한 AB_395875 PE 결합 마우스 1차 항체</td><td>, Franklin Lakes, NJ</td><td>550257 Lot</td><td>: 3057778, RRID: CD90</td></tr><tr>BD Bioscience<td>에 대한 AB_393561 PE 결합 마우스 1차 항체</td><td>, Franklin Lakes, NJ</td><td>555596</td><td>Lot: 3128616, RRID:</td></tr><tr><td>CD105 BD Bioscience에 대한 AB_395970 PE 결합 마우스 1차 항체</td><td>, Franklin Lakes, NJ</td><td>560839</td><td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td></tr><tr><td>PE 복합 마우스 1차 항체 HLA-DR</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>347367 Lot</td><td>: 3219843, RRID: AB_400293</td></tr><tr><td>PE 복합 마우스 IgG1 k isotype</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555749</td><td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>PE 결합 마우스 IgG2a k isotype</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555574</td><td>Lot: 3035934, RRID: AB_ 395953</td></tr><tr><td>PE 결합 마우스 IgG2b k isotype</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555743</td><td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td></tr><tr><td>Viability dye</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>Fixable Viability Stain 450 562247</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan</td><td>Block Ace UKB80</td><td></td></tr><tr><td>FCM</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACS아리아&nbsp; III 세포 분류기</td><td></td></tr><tr><td>FCM 소프트웨어</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACSDiva</td><td></td></tr><tr><td>지방 생성 분화 배지</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro 지방 형성 분화 키트 A10070-01</td><td></td></tr><tr><td>골 형성 분화 배지</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro 골 형성 분화 키트 A10072-01</td><td></td></tr><tr><td>연골 생성 분화 중간&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro 연골 형성 분화 키트 A10071-01</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Polyscience, Warrigton, PA</td><td>16% 초순수 포름알데히드 EM 등급 #18814</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마 Aldrich, St. Louis, MO</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Arizarin Red S</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td></td><td></td>198161</tr><tr><td>현미경</td><td>Keyence, 일본 오사카</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 preterm와 기간 유아에서의 특성화

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 상당한 치료 잠재력 있고 생물 의학 분야에서 증가 관심을 유치. MSCs는 원래 고립 된 골 수 (BM)에서 특징 그리고 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프와 같은 태 반, 태아 부속을 포함 하 여 조직에서 획득 한 탯 줄 혈액 (UCB), 그리고 탯 (UC). MSCs는 이종 세포 인구 (1) 표준 문화 조건, (2) 표면 마커 표현의 CD73 플라스틱 준수 한 용량+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- 고기, 그리고 (3) trilineage 차별화 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes, 현재 국제 사회에 의해 세포 치료 (ISCT)에 대 한 정의를 실현. BM은 MSCs의 가장 널리 사용 되는 소스, BM 포부의 침략 적인 본질은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 대조적으로, UC에서 얻은 태아 MSCs 활발 한 증식 및 분화 능력 등 장점이 있다. 그것은 일반적으로 의료 폐기물로 간주 UC 샘플링에 대 한 윤리적인 우려가입니다. 인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 성장을 지속적으로 개발을 시작 하 고 성장 하는 길이, 50-60 cm를 도달할 때까지 계속 전체 신생아 배달 기간 동안 격리 될 수 있습니다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 다양 한 임신 나가에 전달 하는 유아에서 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 분리와 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC MSCs의 특성을 설명합니다.

MSC 문화 UC 컬렉션에서 절차는 그림 1에서 요약 된다. 길이 약 5-10 cm의 UC 제왕 절 개에 의해 전달 하는 모든 신생아에서 수집할 수 있습니다. UC는 임신의 4-8 주에 개발을 시작 하 고 그림 2와 같이 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고. 그림 3 과 그림 4에서 같이 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 (CL), 안 감과 튼의 젤리 (WJ) UC에 있습니다. UC-MSCs 모든 코드 영역 또는 전체 코드13에서 격리 될 수 있습니다. 초기 임신 연령대와 유아에서 UC는 취약 하며 단일 코드 영역으로 해 부에 대 한 어려운, 때문에 UC MSCs 전체 코드11...

인간의 탯 (UC) preterm, 용어, 결과로 perinatal 기간 동안 얻을 수 있습니다 하 고 postterm 배달. 이 프로토콜에서 우리 기술 분리와 UC 유래 중간 엽 줄기 세포 (UC-MSCs)의 태아/유아에서 임신 19-40 주.

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

이 방법은 세포 치료를 위한 USMSC의 최고 근원과 같은 UCMSC의 심의에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사전 및 기간 유아에서 UCMSC의 일관된 격리 및 활발한 확산을 가능하게한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 난치성 질병의 치료로 확장됩니다.이 방법은 UCMSC의 심의에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 지방 조직, 시노비움, 피부, 치과 펄프 등과 같은 다른 MSC 소스에 적용 될 수있다. 일반적으로, 이 방법에 새로 온 개별은 탯줄 및 중간엽 줄기 세포 격리의 단계에 너무 많은 변이가 있기 때문에 투쟁할 것입니다. 이러한 단계를 간과하기 쉬운 몇 가지 사항이 있기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다.탯줄을 해부하기 시작하려면 먼저 금속 트레이, 멸균 가위 및 집게, 10 밀리리터 파이펫, 25 밀리리터 파이펫 및 2개의 60mm 조직 배양 접시를 준비하십시오. PBS 정제 효소 블렌드를 데우면, 500밀리리터의 혈청 배지 및 배양 배지를 실온으로 데워보실 수 있습니다. 알파 MEM의 50 밀리리터 튜브에서 이전에 분리된 탯줄을 제거하고 플라스틱 트레이에 놓습니다.탯줄을 계량한 다음 멸균 된 가위를 사용하여 5 그램의 코드를 해부합니다. 탯줄을 살균하려면 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 70 %의 에탄올 10 밀리리터를 부어 넣습니다. 그런 다음 10 밀리리터 파이펫으로 PBS1밀리리터를 추가하여 코드를 두 번 씻으십시오.세척된 탯줄을 멸균 60mm 조직 배양 접시에 넣고 10밀리리터감소세럼 배지와 0.5 밀리리터 정제 효소 블렌드를 추가합니다. 멸균 된 가위와 집게를 사용하여 코드를 2 ~ 3 밀리미터 조각으로 자른다. 이 요리를 이산화탄소 인큐베이터5%에 놓고 30분간 섭씨 37도에 배양합니다.그런 다음 부분적으로 소화된 조각을 작은 조각으로 자르고, 동형이 점성이 될 때까지 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 마지막으로, 균동형이 25 밀리리터 파이펫을 통해 쉽게 흐르는지 확인하십시오. 먼저 배양 배지 의 500 밀리리터 병에 4, 50 밀리리터 플라스틱 튜브를 준비합니다.25 밀리리터 파이펫을 사용하여 탯줄 균모네이트를 각 튜브에 약 7.5 밀리리터가 있는 2, 50 밀리리터 플라스틱 튜브로 나눕니다. 그런 다음 각 튜브에 20 밀리리터의 배양 배지를 넣고 잘 섞습니다. 25 밀리리터 파이펫으로 각 호모를 수집하고 새로운 50 밀리리터 수집 튜브 위에 배치 된 100 마이크로 미터 세포 스트레이너를 통해 필터.원심분리기 는 실온에서 5 분 동안 1000g의 여과가있는 두 개의 튜브. 원심 분리를 마친 후, 상체를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오. 각 튜브에 배양 배지의 5 밀리리터를 추가하고 세포 펠릿을 다시 중단합니다.세포 현탁액을 새로운 60mm 플레이트로 옮기고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. UCMSC의 문화, PBS를 따뜻하게, 트립신 EDTA, 및 문화 매체, 실온에. 세포가 접시에 부착되면, 매체를 제거하고, 이물질과 적혈구를 제거하기 위해 PBS의 다섯 밀리리터로 두 번 세척.배양 배지를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터의 경우 섭씨 37도에 배양합니다. 매질을 일주일에 두 번 교체하고 90~100% 합류에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 그런 다음 PBS의 5 밀리리터로 세포를 두 번 씻고 트립신 EDTA의 0.5 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 5~10분 동안 배양합니다.세포가 둥글게 되고 분리될 때, 배양 배지의 9밀리리터를 추가하고 잘 섞어서 트립신을 비활성화합니다. 셀 서스펜션을 새로운 100mm 플레이트에 추가합니다. 90~100% 합류에 도달할 때까지 이산화탄소 인큐베이터의 경우 섭씨 37도에서 세포를 성장시보겠습니다.10번째 구절까지 트립시화와 두 개의 새 판으로 나누어 반복합니다. UCMSC의 표면 마커 발현은 특성화에 대한 기준으로 사용되었습니다. 적절한 항체로 배양하고 유동 세포측정에 의해 분석될 때, 그들은 MSC의 서명 마커에 대해 양성 반응을 보였지만, 단세포 대식세포에 대한 부정적, 혈액 세포 및 피세포에 대한 부정적, B 세포에 대한 부정적, 판 백혈구에 대한 부정적, 주요 조직비호환성 복합 마커에 대한 부정적.PRETERM 및 기간 유아로부터 USCMSC의 삼중 분화 능력을 평가하기 위해 세포는 지방세포, 골세포 및 연골세포로 분화하도록 유도되었다. UCMSC는 성공적으로 그들의 분화 능력을 확인하는 중피 세포의 3가지 모형으로 분화했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 네 가지 중요한 단계가 있음을 기억하는 것이 중요합니다.코드를 2~3센티미터 로 자르고 작은 조각으로 자르고, 25밀리리터 파이펫을 통해 호모게네이트가 쉽게 흐르도록 하고, 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 동형체를 필터링합니다.

isolation-characterization-human-umbilical-cord-derived-mesenchymal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

우리는 인간 탯줄 조직으로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하고 골격근 혈통으로의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다.

인간 탯줄 조직에서 중간엽 줄기 세포의 생성과 골격근 계보로의 분화

이 연구는 Wharton's jelly(WJ)의 무결성을 보존하기 위한 고유한 둔부 해부 절차를 제시하여 WJ가 덜 손상되고 수확된 중간엽 줄기 세포(MSC)의 양과 생존력을 높입니다. 이 방법은 기존의 날카로운 해부 방법에 비해 우수한 수율과 증식 능력을 보여줍니다.

Exclusion Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage(높은 수율과 낮은 손상의 탯줄 유래 중간클립 줄기세포의 분리)

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI높은MFGE8높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBIhighMFGE8high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

배우세요 인간 탯줄 유래 중간 엽 줄기세포(UC-MSC)의 분리 및 특성화 방법을 통해 조직 재생 및 난치성 질환 치료 연구에 활용하는 기술입니다. 이 프로토콜은 조기 및 만삭 영아에서 일관된 세포 분리와 활발한 증식을 가능하게 합니다.

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

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