대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

이 프로토콜은 비 전문가에 의한 자기 단백질 합성을 구현하는 방법을 단순화하고 명확히합니다. 이러한 방법에 대한 액세스가 개선되면 플랫폼과 이를 가능하게 하는 광범위한 응용 프로그램 집합의 비장화에 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 속도, 비용 효율성 및 다른 자기 단백질 합성 플랫폼에 비해 설정 된 반응의 용이성입니다.

당사의 플랫폼은 기능성 유전체학, 하이토퍼테스트, 바이오 센서, 교육 키트, 사소한 수정, 신진 대사 엔지니어링 및 유전 코드 확장을 포함한 다양한 응용 프로그램을 가능하게 할 수 있습니다. 이 기술은 기본적인 실험실 교육만 필요하지만, 새로운 사용자는 프로토콜의 성공적인 실행을 위해 초음파 처리와 같은 기술에 익숙해할 계획입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 미디어 및 배양 E.coli 세포를 준비합니다.

1리터 원심분리기 병을 얼음 수조에 넣습니다. 배양 OD600이 3.0에 도달하면 세포 배양을 차가운 병에 붓습니다. 이중 빔 밸런스를 사용하여 첫 번째 리터 원심분리기 병에 물을 추가하여 원심분리기의 균형을 만듭니다.

원심분리기를 섭씨 4도로 미리 냉각한 후 병을 5, 000g, 섭씨 10도에서 10°C로 원심분리하여 세포를 펠릿합니다. 그 후, 천천히 부어 상체를 처분. 세포 펠릿을 얼음 위에 놓습니다.

멸균 주걱을 사용하여 원심분리기 병에서 세포 펠릿을 긁어 내고 감기, 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮춥습니다. 2밀리머 DTT로 보충된 30밀리리터의 콜드 S30 버퍼를 추가하고 펠릿이 덩어리없이 완전히 다시 중단될 때까지 얼음에 휴식 기간이 있는 짧은 버스트에서 펠릿을 재연합니다. 그 후, 물로 채워진 또 다른 50mm 원심관을 사용하여 샘플을 원심분리하여 샘플을 5, 000g 및 10도에서 10분간 사용합니다.

부어 서상체를 폐기. 차가운 S30 버퍼의 20 ~ 25 밀리리터로 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리기 는 5, 000g, 섭씨 10도에서 10분 동안.

부어 서퍼를 폐기하십시오. 그런 다음 S30 버퍼의 30 밀리리터를 추가하고 이전에 설명한 바와 같이 소용돌이를 사용하여 펠릿을 다시 중단합니다. 3 개의 미리 계량, 차가운, 50 밀리 리터 원추형 튜브를 설정합니다.

멸균 파이펫이 있는 세로지학적 파이펫 필러를 사용하여 각 튜브에 펠릿 서스펜션 10밀리리터10밀리리터를 표시합니다. 필요에 따라 적절한 균형을 사용하여 모든 튜브를 원심 분리하여 5, 000g 및 섭씨 10도에서 10분 동안 사용할 수 있습니다. 그 후, 부어 초월체를 폐기.

각 튜브의 내부를 깨끗한 조직으로 조심스럽게 닦아 접근 버퍼를 제거하는 동시에 펠릿을 만지지 않도록하십시오. 분석 균형을 사용하여 튜브의 무게를 재측정하고 각 튜브의 최종 펠릿 무게를 보고합니다. 시작하려면 각 펠릿에 1 그램의 세포 질량 당 2 밀리모어 DTT가있는 차가운 S30 버퍼 1 밀리리터를 추가하십시오.

소용돌이를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 펠릿을 재일시 중단하십시오. 그런 다음 각 재중단 된 펠릿의 1.4 밀리리터를 별도의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 옮기십시오. 한 튜브를 비커에 얼음 수조에 넣고 튜브의 바닥이나 측면을 만지지 않도록 초음파 프로브를 배치합니다.

진폭이 45초 동안 50%로 설정된 후 59초의 휴식으로 튜브를 초음파 처리합니다. 오프 기간 동안 튜브를 닫고 반전해야합니다. 초음파 처리가 완료된 직후, 한 개의 어금니 DTT의 4.5 마이크로리터를 lysate에 추가합니다.

튜브를 여러 번 반전하여 혼합한 다음 얼음 위에 놓습니다. 이 과정을 반복하여 각 재중단 된 셀 튜브에 대해 DTT를 초음파 화하고 추가합니다. 18, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.

그 후, 파이펫은 각각 새로운 1.5 밀리리터 미세 센심분리기 튜브로 되어 펠릿이 방해받지 않도록 일부 상퍼를 남겨두고 있습니다. 상체관을 인큐베이터의 흔들리는 플랫폼으로 가져가서 섭씨 37도에서 60분 동안 250RPM에서 흔들어 배양합니다. 이것은 런오프 반응입니다.

그런 다음 샘플을 10, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 새로운 튜브로 전송하는 펠릿을 방해하지 않고 각 상체를 제거합니다. 저장을 위해 추출의 많은 100 마이크로 리터 알리쿼트를 만듭니다.

첫째, 해동 용액 A, 용액 B, DNA 템플릿, BL21DE3 추출물, T7 RNA 폴리머라제, 및 얼음에 분자 등급물의 알리쿼트. 다음으로 CFPS 반응에 필요한 양의 미세 원심 분리튜브에 라벨을 부착합니다. 각 시약을 파이펫팅이나 소용돌이로 섞은 다음 라벨이 부착된 반응 튜브에 용액을 추가하여 세포 추출물을 소용돌이치지 말고 튜브를 혼합하는 대신 반전하십시오.

최종 반응이 잘 혼합되어 있는지 확인하고 각 튜브의 하단에 있는 단일 15 마이크로리터 비드로 결합합니다. 각 반응을 섭씨 37도에서 4시간 동안 또는 하룻밤 사이에 섭씨 30도에서 흔들지 않고 배양합니다. 시작하려면, 96 웰 플레이트를 얻고 정량화에 필요한 각 우물에 pH 8에서 0.05 어금반 HEPES의 48 마이크로 리터를로드합니다.

다음으로, 인큐베이터에서 반응 튜브를 제거합니다. 각 반응을 위아래로 배관하여 혼합하고 각 반응의 두 마이크로리터를 HEPES를 포함하는 우물로 옮킨다. 위아래로 파이프를 통해 각 잘 섞는다.

모든 반응이 적재되고 혼합된 후, 플레이트를 형광계에 적재하고 485나노미터의 내분 파장과 510나노미터의 방출 파장을 사용하여 SFGFP 종점 형광을 측정한다. 이전에 생성된 표준 곡선을 사용하여 얻어진 형광소 판독값으로부터 초폴더GFP의 농도를 결정합니다. 이 연구에서는 초음파 처리 기반의 대장균 추출물 제제를 조사합니다.

세포 펠릿과 세포 추출물은 적어도 1 년 동안 음수 80도에서 안정적입니다. 또한, 세포 추출물은 생산성의 상당한 손실없이 적어도 5 개의 동결 해동 주기를 겪을 수 있습니다. 이 프로토콜 내의 일부 단계는 시스템의 전반적인 생산성에 해를 주지 않으면서 다양할 수 있습니다.

특히, 세포는 세포 추출물 생산성에 큰 영향을 미치지 않고 600나노미터에서 2.7 내지 4.0 광밀도범위 내에서 수확될 수 있다. 그러나, 템플릿 DNA 품질은 CFPS 반응의 체적 수율에 영향을 미치는 배치 대 배치 가변성의 원천입니다. 이것은 추가 DNA 정화 단계 뒤에 미디 또는 맥시프를 통해 DNA를 정화하여 해결됩니다.

반응 용기는 또한 CFPS 반응의 체적 수율에 영향을 미칩니다. 표면적대 체적 비율이 증가하면 체적 수율이 높아진다. CFPS 반응의 체적 수율을 최적화하고 세포 추출물 배치 대 배치 가변성을 줄이기 위해 각 새로운 추출물 준비에 대해 마그네슘 티티네이션을 수행해야 합니다.

밀리리터 총 단백질당 30밀리그램으로 구성된 세포 추출물의 경우, 시약 사용을 최소화하고 체피 수율을 최대화하기 위한 최적의 마그네슘 농도 및 추출물 량은 각각 10밀리몰러와 5마이크로리터입니다. 반응 규모를 변화시킴으로써, 사용자는 높은 처리량 스크리닝에서 표적 단백질의 더 큰 규모의 발현에 이르는 방법을 추구할 수 있다. 이 기술은 두 가지 주요 장점을 제공, 먼저 그것은 단백질 제품을 보다 빠르게 화면, 둘째, 그것은 단백질을 표현 하기 어려운 합성.

예를 들면 세포 독성 또는 그들의 기능에 대 한 산화 조건을 필요로 하는 단백질을 포함. 모든 실험실 절차와 마찬가지로 모든 시약은 주의해서 처리되어야 합니다. 또한 원심 분리기는 항상 균형을 유지해야하며 초음파 처리 중에 귀 보호기능을 사용해야 합니다.