Name: 칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 학습하세요 Candida albicans에서 미토콘드리아 호흡과 당분해 기능을 정제 없이 측정하는 방법을. 이 기술은 유전자 조작과 화학 조절자의 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

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NC 랩에서 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 R01AI24499와 뉴저지 건강 재단 (NJHF) 부여, #PC40-18에 의해 지원 됩니다.

참고: 분석 결과의 상세한 stepwise 프로토콜은 아래, 설명 하 고 도식 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다.
1. C. albicans 긴장 및 성장 조건
<ol><li>C. albicans 긴장 성장 30 °C에서 인큐베이터 쉐이 커에 액체 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 매체에서 하룻밤. 참고: 냉동된 주식으로 칸디 다 긴장을 유지 하 고 YPD agar (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, 및 2 %agar)에 성장.</li>
</ol>2입니다. 시 약의 준비
<ol><li>다음과 같이 분석 결과 매체를 준비:<ol>
<li>미토 콘 드리 아 기능 분석 결과 대 한 해산 1.04 g 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 분말과 포도 당 2 세대 (2%) 90 살 균 물과 따뜻한 37 ° c 미디어 7.4 5 M NaOH를 사용 하 여에 pH를 조정 하 고 메 마른 물 100 mL에는 볼륨을 구성 하.</li>
		<li>Glycolytic 스트레스 분석 결과 대 한 1.04 g RPMI 1640 분말 90 살 균 물 혼자를 분해 하 고 따뜻한 미디어 37 ° C를 pH 7.4에 조정. 멸 균 물 100 mL에 볼륨을 확인 합니다. RPMI 1640 파우더는 중요 한 분석 결과 중 분해의 pH 변화를 모니터링 하는 아무 중 탄산염.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사출 화합물입니다.<ol>
<li>1 M 포도 당 주식 살 균 물에-20 ° c.에가 게를 준비</li>
		<li>디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 작은 볼륨에서 aliquot에 oligomycin 주식 100 mM를 준비 하 고-20 ° c.에 저장</li>
		<li>DMSO, 작은 볼륨에서 aliquot에 100 m m antimycin A 재고를 준비 하 고-20 ° c.에 저장</li>
		<li>에탄올에 가짜 (salicylhydroxamic 산) 주식 분석 결과 하루에 100 mM를 준비 합니다.</li>
		<li>분석 결과의 날에 1 M 메 마른 물에 KCN을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 분석 결과 플레이트와 폴 리-D-라이 신 (PDL)의 코팅
참고: 모든 수행은 층 류 후드에서 단계 아래.
<ol><li>50 µ g/mL 최종 농도 만들기 위해 조직 문화 학년 물에 폴 리 D Lysine을 디졸브. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 잘 그리고 aliquot 그것을 혼합 하 고 오랜 기간 동안-20 ° C에서 저장. 참고: 잘 당 50 µ L이 필요, 그리고 24 웰 스, 1.2 mL이 필요. 따라서, microcentrifuge 튜브 당 약 1.3 이상 수 mL.</li>
	<li>잘 당 50 µ L을 추가 하 고 뚜껑을 1-2 h 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>솔루션을 발음 하 고 500 µ L 무 균 조직 문화 학년 물으로 한 번 씻어.</li>
	<li>뚜껑 열고 건조 공기를 우물을 허용 합니다. 같은 날에 4 ° C에 게 접시를 사용 하 여 최대 2-3 일에 대 한.</li>
</ol>4입니다. 수 분이 센서 카트리지
참고: 하루는 실험 전에이 단계를 수행 합니다.
<ol><li>분석 결과 키트 추가 유출 열고 내용을 제거 합니다. 거꾸로 유틸리티 플레이트 (그림 2) 옆 센서 카트리지를 놓습니다.</li>
	<li>각 유틸리티 접시의 calibrant의 1 mL와 함께 고 센서 카트리지를 다시 배치 작성. (측정 하기 위해 산소와 pH) fluorophores 포함 하는 센서는 calibrant에 잠긴 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>37 ° c.에 비 CO2 배양 기에서 하룻밤 센서 카트리지를 품 어</li>
</ol>5. 성장 및 PDL 코팅 판에 셀 시드
<ol><li>C. albicans YPD 국물에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 통에 30 ° C에서 성장. 참고: 분석 결과 설계 및 관심에 따라, C. albicans 수 YPG 또는 최소 매체 또한 성장 수 있다.</li>
	<li>분석 결과의 날, 적절 한 수를 100 µ L 당 100, 000 셀의 최종 농도 분석 결과 중간에 셀의 희석.</li>
	<li>웰 스 A1, B4, c 3와 D6, 있는 배경 보정 (그림 3)에 대 한 분석 결과 매체의 100 µ L를 추가 제외 하 고 분석 결과 플레이트의 각 음에 희석 셀 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 비 CO2 인큐베이터에 접시를 전송 하 고 플레이트 표면에 고착 하는 세포에 게 할 것 이다 60 분 동안 품 어.</li>
</ol>6. 분석 결과 프로토콜
참고: 여기에 설명 된 프로토콜은 악기의 24-잘 형식입니다. 볼륨은 다른 형식이 사용 되 면 조정 해야 합니다.
<ol><li>미토 콘 드리 아 기능 분석 결과<ol>
<li>화합물의 준비<ol>
<li>미토 콘 드 리아 기능 분석 결과 대 한 10 배 농도에서 화합물을 준비: 20mm 가짜, 100 µ M 준비 Oligomycin, 100 mM KCN, 그리고 해당 분석 결과 매체에서 20 µ M Antimycin A.</li>
			<li>추가 50 µ L 포트 A, 55 µ L로 가짜 Oligomycin 포트 B, 62 µ L KCN 포트 C와 D의 포트 68 µ L Antimycin A (그림 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glycolytic 스트레스 분석 결과<ol>
<li>화합물의 준비<ol>
<li>Glycolytic 스트레스 분석 결과 대 한 10 배 농도에서 화합물을 준비 합니다. 포도 당, 100 µ M 100 mM를 준비 Oligomycin, 500 m m 2에 의하여 포도 당 (2 DG) 및 해당 분석 결과 매체에서 20 µ M Antimycin A.</li>
			<li>포트 A, 55 µ L로 50 µ L 포도 추가 C와 포트 D. 68 µ L Antimycin A 포트에 포트 B, 62 µ L 2-DG Oligomycin</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>여분의 플럭스 분석기, 산소 소비 속도 (OCR)와 24-잘 플레이트 형식에 살아있는 세포의 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 측정을 사용 합니다. 사전에 시험 프로토콜을 설정 합니다.</li>
	<li>여분의 플럭스 분석기 및 분석 결과 마법사 탭을 사용 하 여 분석 결과 서식 파일 설정 열고 모든 정보를 설치 하는 동안 밖으로 아빠 작성 단계 지시에 따라. 그림 5에 표시 된 유사한 그룹 레이아웃을 생성 합니다. 표 1에 표시 된 대로 프로토콜을 설정 합니다. 분석 결과 전에 잘 앞서 이러한 레이아웃을 설정 하 고 컴퓨터에 저장. 당시 분석 결과, 분석 결과 마법사 탭 (그림 5)에서 파일 열기 옵션에서 해당 파일을 열어서 저장된 프로토콜을 복원 합니다.</li>
	<li>10 x 화합물 수산화 센서 카트리지를 포함 하는 calibrant의 해당 포트에 로드 하 고 여분의 플럭스 분석기의 캐리어 트레이 로드 하십시오. 화면에서 시작 버튼을 눌러 보정을 시작 합니다.</li>
	<li>450 µ L를 최종 볼륨을가지고 셀 소요를 최소화 하기 위해 웰 스의 측면을 따라 셀 플레이트를 부드럽게 분석 결과 매체의 350 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>분석 결과 플레이트 calibrant를 포함 하는 유틸리티 플레이트를 장착 하 고 계속.</li>
	<li>분석 결과 완료 되 면 센서 카트리지 및 플레이트를 제거 합니다. 적절 한 대상 폴더에 파일을 저장 합니다.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>탭의 곡선-분산 분석 (ANOVA AUC) 분석 소프트웨어에서 영역을 사용 하 여 그림 6에서 같이 각 매개 변수 (OCR 또는 ECAR)를 선택 하 여 그룹 간의 중요 한 차이 계산.</li>
	<li>비교할 필요가 있는 그룹을 선택 합니다.</li>
	<li>ANOVA에 대 한 분석 그룹에 추가 하 고 확인을 클릭 합니다. 참고:이 AUC ANOVA 분석 AUC는 각 그룹에 대 한 계산 고 있는 ANOVA에 의해 그들 사이 비교 파일에 새 시트를 추가 합니다. 이 중요성을 보여 p 값의 표를 줄 것 이다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 공개할 게 없다

생체 외 유출 분석 결과 산화 인 산화 (OXPHOS)를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 읽을 수 있는 훌륭한 도구 역할-실시간으로 종속 산소 소비. 또한, extracellular 산성화 속도 (extracellular pH 변화)로 측정 한 glycolytic 기능 또한 실시간 분석에 동시에 조사 수 있습니다.
PDL 코팅 접시에 셀의 인큐베이션 허용 시험 접시에 셀 시험 접시에 C. albicans 의 성공적인 도금 분석 결과에 중요 한 단계 중 하나입니다. C. albicans 세포 접착의 시각화는 가벼운 현미경 검사 법에 의해 수행 됩니다. 잘못 된 셀 준수 셀 사이의 복제 일관성 읽기와 분석 결과 영향을 미칠 것입니다 우물에 떠 있는 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 100-300 pmol/min, 최적의 범위는 사이 OCR를이 분석 결과 첫 번째 단계도 셀 번호 적정을 수행 하는 것이 중요. 또한, 최적의 농도 얻기 위해 ...

침입 균 감염 전세계 1 년 이상의 1.5 백만 명 죽 일. 이 번호는 손상 된 면역, 암 환자1, 이식 받는 사람, 노인, 조기 유아를 포함 하 여 생활 하는 사람들의 숫자에 증가 때문에. C. albicans 는 기회주의적 인간의 곰 팡이 병원 체 인간 microflora의 일부입니다. 그것은 또한 공생 생물으로 점 막 표면 및 위장에 서식. C. albicans 심각한 조직 질병 면역 결핍증, 누가 수술을 받은 또는 누가 항생제의 긴 과정을 함께 취급 하 고 있는 사람들을 생성 합니다. 병원내 감염 증 (NID) 인간2,3,4,5,,67의 상위 3 ~ 4 원인 중 칸디 다 종 차수입니다. 칸디 다 혈 류 량 감염의 연례 글로벌 수 ~ 400000 경우, 46-751의 연결된 mortalities로 추정 된다. 칸디 다 증 때문에 연간 사망률 약 미국 에서만 10, 000입니다. 곰 팡이로 인 한 NID의 범위는 천문 환자 비용5에 반영 됩니다. 미국에서는, 침입 균 감염의 치료에 대 한 연간 비용 $2 십억, 이미 overburdened 의료 시스템을 거 대 한 긴장을 추가 능가 한다. 현재, 사용할 수 있는 표준 항진균 치료 독성, 점점 널리 약물 저항, 및 약물-약물 상호 작용으로 인해 제한 됩니다. 따라서, 고 위험 환자에 대 한 더 나은 치료 옵션 귀 착될 것 이다 새로운 항진균 약물 목표를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다. 그러나, 곰 팡이 목표에 행동 하는 새로운 약물의 발견은 곰 팡이 진핵생물 복잡 합니다. 이 크게 특정 곰 팡이 약물 목표의 수를 제한합니다.
최근 연구는 미토 콘 드리 아는 곰 팡이 독성에 중요 한 기여자 및 항진균 약물에 내성 때문에 미토 콘 드리 아는 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환 및 apoptosis8에 대 한 중요 한 표시 ,9,,1011. Glycolytic 및 비 glycolytic 대사는 포유류 호스트12,,1314,,1516 C. albicans 의 생존을 위해 필수적입니다. 또한, Goa1, 같은 미토 콘 드리 아 단백질 부족 여러 C. albicans 돌연변이 Srr1, Gem1, Sam37 등 표시 되었습니다 filamentation, C. albicans17, 의 중요 한 독성 요소에에서 결함이 있는 것을 18 , 19 , 20 , 21 , 22. 또한, 이러한 돌연변이 또한 독성의 마우스 모델에서 칸디 다17,,1819,20,21 전파에 대 한 감쇠를 표시 했다 ,22. 따라서, 곰 팡이 미토 콘 드리 아 약물 발견에 대 한 매력적인 대상을 나타냅니다. 그러나, C. albicans 에 미토 콘 드리 아 기능 연구는 C. albicans 는 몸집이 작은 부정적인23, 미토 콘 드리 아 게놈 없이 살아남을 수 없다 의미 때문에 도전적 이다.
여기, 우리는 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 C. albicans 에 glycolytic 미토 콘 드리 아 기능을 조사 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 또한 C. albicans에 미토 콘 드리 아와 glycolytic 경로에 유전자 조작 이나 화학 변조기의 효과 조사 하기 위해 최적화할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito 스트레스 키트</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Santa cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Amresco&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 하이드록시 펠릿</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 등급 물</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF 분석 보정 용액</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 펩톤 포도당 Fisher</td><td>scientific,</td> <td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 펩톤 포도당 한천</td><td>시그마</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 펩톤 글리세롤</td><td>시그마</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

미토 콘 드리 아 세포 물질 대사 및 생존을 위한 필수적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아, 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환, apoptosis 등 다양 한 주요 행사 개최. 따라서, 미토 콘 드 리아 기능 장애는 항진균 약물 내성 및 병원 성 곰 팡이의 독성에 중요 한 역할을 보고 됩니다. 최근 데이터는 또한 곰 팡이 병의 중요 한 기여자는 미토 콘 드리 아의 중요성의 인식을 이끌어 냈다. 곰 팡이 생물학에서 미토 콘 드리 아의 중요성에도 불구 하 고 표준화 된 방법의 기능을 이해 하는 가난 하 게 개발 되었다. 여기, 기저 산소 소비 속도 (OCR), 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 및 extracellular 산성화 요금 (ECAR), C. albicans 긴장 glycolytic 기능 측정 연구 절차 선물이. 여기 설명 하는 방법은 그대로 곰 팡이 세포에서 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 긴장 Candidaspp. 어떤에 적용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 또한 사용자 정의할 수 있습니다 C. albicans 긴장에 미토 콘 드리 아 기능 억제제에 대 한 화면으로.

이 프로토콜의 추가 유출 분석기에 의해 평가 되는 C. albicans 의 bioenergetic 기능을 결정 하는. C. albicans 돌연변이 미토 콘 드리 아 단백질 Mam33 부족의 보완 스트레인, OCR 및 ECAR 미토 콘 드리 아 단백질의 삭제의 효과 공부 mam33Δ/Δ::MAM33 함께 포함 되어 있습니다. MAM33 상 상속 미토 콘 드 리아 산 성 매트릭스 단백질 인코딩하고 칸디 다 에 그것의 기능을 알 수 없는 합니다.
핸드폰 번호 추가 유출 분석 결과 대 한 우리는 1 x 105 C. albicans 야생 타입 셀 당 145 pmol/min를 (그림 ...

여기, 선물이 미토 콘 드리 아 호흡 및 Candida Albicans 에 glycolytic 기능 조사 stepwise 프로토콜 추가 유출 분석기를 사용 하 여.

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스의 글리코리악 기능 및 미토콘드리아 호흡을 결정하기 위해 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 칸디다 알비칸에서 미토콘드리아를 정화할 필요 없이 미토콘드리아 기능을 측정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 칸디다 알비칸스 또는 기타 곰팡이 병원균의 미토콘드리아 및 글리코리컬 경로에 대한 유전 조작 또는 화학 변조기의 영향을 조사하기 위해 최적화 될 수 있습니다.이 기술은 비교적 간단합니다. 또는 유기체에 따라, 그들의 사용은 세포 수 와 그들의 분석에서 미토콘드리아 억제제의 농도를 최적화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 라미나르 플로우 후드에서 티슈 그리드 워터에 폴리-D-리신을 용해하여 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도를 유지합니다.용액을 잘 섞고 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에 알리쿼트하여 튜브 당 적어도 1.3 밀리리터를 알리쿼트하십시오. 이 혼합물의 50 마이크로리터를 분석 판의 각 웰에 넣고 뚜껑을 덮고 실온에서 1~2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 솔루션을 흡인합니다.멸균 조직 배양 등급의 물 500 마이크로 리터와 한 번 분석 플레이트의 우물을 헹구고 뚜껑을 열고 우물이 공기 건조할 수 있도록 합니다. 준비된 날에 접시를 사용하지 않을 경우 최대 2~3일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오. 실험 전날, 여분의 플럭스 분석 키트를 열고 내용을 제거합니다.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 유틸리티 플레이트의 각 웰을 1밀리리터의 교정으로 채운 다음 센서 카트리지를 다시 배치합니다. 형광이 포함된 센서가 교정판에 침수되어 있는지 확인합니다.밤새 이산화탄소 가 아닌 인큐베이터에서 센서 카트리지를 섭씨 37도에서 배양합니다. 분석 전날, YPD 국물에 준비 된 C 알비칸을 접종하고 200 rpm에서 셰이커에서 섭씨 30도에서 하룻밤 사이에 자랍니다. 분석 당일, 분석 배지에 적절한 수의 세포를 희석하여 100 마이크로리터 당 100, 000 세포의 최종 농도를 산출한다.우물 A1, B4, C3 및 D6을 제외한 분석 플레이트의 각 웰에 희석 된 세포의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 이러한 우물에 배경 보정을 위해 분석 매체의 마이크로리터 100개만 추가합니다. 비 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 플레이트를 60분 간 배양하여 세포가 플레이트 표면에 부착하도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 해당 분석 매체에서 10배 농도에서 미토콘드리아 기능 분석에 대한 화합물을 준비한다.포트 A에 SHAM 50 마이크로리터, 포트 B에 올리고마이신 50 마이크로리터, 항C에 시안화 칼륨 62 마이크로리터, 항마이신 A의 68 마이크로리터를 포트 D.Next에 추가하여, 해당 의정서에 명시된 바와 같이 10배 농도의 글리코리스틱 응력 분석체에 대한 화합물을 준비한다. 항만 B에 50 마이크로리터, 포트 B에 올리고마이신 55마이크로리터, 항만 C에 2-DG의 62 마이크로리터, 항제 A의 68 마이크로리터를 포트 D.assay 전에 추가 플럭스 분석기를 열고 분석 마법사 태브를 사용하여 분석 템플릿을 설정합니다. 단계별 지침을 따르고 설정 중에 나오는 모든 정보를 작성합니다.그룹 레이아웃을 생성하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로토콜을 설정합니다. 분석 전에 이러한 레이아웃을 저장합니다. 분석 시 분석 마법사 탭에서 열린 파일 옵션에서 해당 파일을 열어 저장된 프로토콜을 복원합니다.그런 다음 교정판을 포함하는 수화 센서 카트리지의 각 포트에 10X 화합물을 로드합니다. 센서 카트리지를 추가 플럭스 분석기의 캐리어 트레이에 로드합니다. 화면의 시작 버튼을 클릭하여 교정을 시작합니다.다음으로, 350마이크로리터를 벽면에 세포판에 부드럽게 추가하여 450마이크로리터에 최종 부피를 가져오는 세포 방해를 최소화한다. 교정판을 포함하는 유틸리티 플레이트를 분석 판으로 교체하고 분석을 계속합니다. 분석이 완료되면 센서 카트리지와 플레이트를 제거합니다.파일을 적절한 대상 폴더에 저장합니다. 이 연구에서는 C 알비칸의 생체 에너지 기능이 추가 플럭스 분석기로 평가됩니다. 미토콘드리아 단백질 mam33이 부족한 돌연변이는 또한 산소 소비율 및 세포외 산성화율에 미토콘드리아 단백질의 삭제효과를 연구하기 위한 보완균질과 함께 포함되어 있습니다.C 알비칸 야생 유형은 분당 145피코몰의 산소 소비율을 나타내며, 이는 세포외 플럭스 분석에 대한 최적의 범위 내에 있습니다. 야생형, 맘33 돌연변이 및 맘33의 기저 산소 소비율은 균주를 보완하여 차이가 없다. 유사 하 게, 유의 한 차이 균주 사이 기저 세포 외 산성화 속도에서 볼 수 없습니다.그러나, 시안화칼륨, 야생형 및 맘33 돌연변이를 함유한 복합IV를 억제함으로써, 맘33의 보완균주는 글리코리시스쪽으로 상당한 변화를 보여준다. mam33 돌연변이 균주는 그러나 화합물 IV 의존경로가 이 긴장에서 손상되었다는 것을 건의하는 보상 적인 당분해변을 보여주지 못했습니다. 글리코리스틱 스트레스 테스트에서 세포는 1시간 동안 포도당을 굶주리고 기저 산소 소비율및 세포외 산성화율을 측정한다.기아 시, mam33 돌연변이 균주는 다른 균주에 비해 상당히 낮은 산소 소비와 세포외 산성화 비율을 보여줍니다. 이것은 세포가 기아 조건에 강요될 때 호흡과 글리코리시둘 다에 대한 포도당의 손상한 이용을 건의합니다. 포도 당을 주입 한 후, 모든 균주는 산소 소비 속도와 세포 외 산성화 속도 모두의 자극을 보여줍니다.분석 판의 코팅은 칸디다 알비칸스 세포가 플레이트에 부착 할 수 있습니다. 칸디다 알비칸스 세포의 부적절한 준수는 분석 결과에 영향을 미칠 것입니다. 이 기술의 발달 후에, 그것은 생리적이고 병리학적인 조건 도중 미토콘드리아가 어떻게 작동하는지 를 해결하는 세포 모형 및 질병의 넓은 범위에서 채택되었습니다.예를 들어, 이 분석에서 환자 유래 및 제어 세포를 채용하는 것은 미토콘드리아 기능이 어떻게 변경되는지에 대한 구체적인 질문을 해결할 수 있다. 이러한 화합물은 매우 유독하기 때문에 시안화 칼륨 및 항마이신 A와 같은 미토콘드리아 억제제를 준비하는 동안 주의해야 한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜은 세포외 플럭스 분석을 통해 1차 백혈병 세포의 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 생화학적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 세포의 대사 프로파일에 대한 평가는 세포의 요구를 특성화하는 데 도움이 되어 맞춤형 치료로 이어집니다.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

이 동영상은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 활성화된 인간 NK 세포의 에너지 대사를 분석하는 방법을 보여줍니다. 전자 전달 사슬 복합체의 다양한 억제제는 산소 소비율 또는 OCR을 통해 측정되는 ATP 합성에 영향을 미치며 세포 대사 및 생체 에너지학에 대한 통찰력을 제공합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 인간 NK 세포의 에너지 대사 실시간 모니터링

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.

실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 생물에너지 모니터링

이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

알코올 남용은 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지학의 억제로 인해 폐포 대식세포(AM) 면역을 손상시킵니다. 우리는 최근에 에탄올(EtOH) 노출이 AM에서 미토콘드리아 호흡에 대한 글루타민 의존성을 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 본 명세서에서는 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 EtOH 처리된 AM에서 미토콘드리아 호흡을 위한 글루타민의 사용을 결정하기 위한 방법을 제공합니다.

Modulatic Flux Bioanalyzer를 사용하여 만성 에탄올에 노출된 폐포 대식세포의 연료 공급원으로서의 글루타민 평가

여기에서는 골수, 비장 및 경색된 심장에서 대식세포를 추출하고 이후에 살아있는 세포의 대사 플럭스를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

비장 및 심장 대식세포와 골수 단핵구의 생체 외 대사 플럭스 분석

이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 Saccharomyces eubayanus 의 전사 활성을 측정하여 포도당에서 맥아당으로의 전이를 모니터링함으로써 대사 적응의 실시간 분석을 가능하게 하고 다양한 조건에서 산업 발효를 위한 균주 최적화를 지원합니다.

생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

이 프로토콜은 1차 마우스 미세아교세포에서 대사 재프로그래밍을 정량화하기 위해 해당분해 스트레스 검사를 비용 효율적으로 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 및 염증 자극 후, 신선하게 준비된 pH 조정 시약을 사용해 세포외산성화 속도(ECAR)를 측정한 후, 단백질 정규화를 통해 당해질 변화를 정확하고 재현 가능하게 평가합니다.

세포외 플럭스 분석법을 이용한 1차 미세아교세포의 당화 연구

학습하세요 Candida albicans에서 미토콘드리아 호흡과 당분해 기능을 정제 없이 측정하는 방법을. 이 기술은 유전자 조작과 화학 조절자의 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

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