Name: 라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 미세유체 바이오리액터를 활용한 Pseudomonas aeruginosa 바이오필름 전단 응력 분석 방법을. 형광 현미경으로 실시간 성장을 관찰하여 항생제 처리 및 생물학적 복원 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작업 가능 하 게 되었다 교부 금에 의해 국립 연구소에서에 대 한 일반 의료 과학 (NIGMS) (5P20GM103427)의 국립 보건원 (NIH) 구성 요소

저자는 공개 없다.

미세 시스템 및 이미지 분석 절차 여기 confocal에서 일반적으로 발견 되는 전체 3 차원 정보를 필요로 하지 않는 형태학 속성을 확인 하는 미세 biofilm 실험 실행에 초점을 맞추고 논의 현미경 학문입니다. 이러한 포함 microcolony 층 범위 (% 범위), 표면 거칠기 거칠기 계수와 텍스처 엔트로피에 의해 측정 되었습니다. 총 상대 biofilm 세포 축적을 추정 하는 방법 또한 로그에 있는 성장 율에서 단계는 산출 될 수 있다 제공 됩니다.
이 방법에는 강조 표시 되어야 합니다 여러 작지만 중요 한 단계가 있습니다. 알코올로 인터페이스를 닦아 한 실험에서 실험에서 실험 하지만 잘 잘에서도가 다른 박테리아의 오염을 방지할 수 있습니다. 못쓰게 하 고 시드 아주 못쓰게 하면 어떤 채널 어떤 방해 없이 채널을 통해 흐르는 매체를 허용 하는 결정을 하기 때문에 중요 하 또는 막힘도 있습니다. 채널도 해서는 안 막힘 없는 기포와 함께 성공적인 실험의 기회를 높이기 위해 프라이 밍 후 (즉, 그들은 지속적으로 가득 해야 미디어) 방해. 시드 단계 박테리아의 종류에 따라 다양 한 수 있습니다 하 고 그래서 셀 첨부 파일에 대 한 최적화 되어야 합니다. 예를 들어 셀 되지 않는 경우 연결을, 표면 수정 뿌리기 전에 미세 접시에 발생 할 수 있습니다 또는 긴 외피 시간 필요할 수 있습니다. 그것은 또한 현미경에-초점 이미지를 올바르게 설정 되어는 이미지 품질을 얻을 수 있습니다 확신 하는 실험을 통해 주기적으로 모니터링 해야 합니다 있는지 확인 하는 중요 한. 초점을 경우, 현미경 및 실험 계속 조정 해야 합니다 수 있습니다. 이미지 수집 시간 동안 마지막 파장 필터와 이미지 인수 사이 발생 하는 대기 시간 동안 하나의 채널에 조명 노출을 피하기 위하여 모든 폐쇄 를 설정 해야 합니다. 몽타주 소프트웨어 매뉴얼 절차를 명시적으로 설명 하지 않았다 때문에 또한, % 표면 범위를 결정 하는 이미지 분석 집에서 설계 되었다. 또한, 이미지 분석에 확장 하 고 표면 거칠기, 등등과 같은 다른 특성을 결정 하기 위하여., 오픈 소스 코드를 파이썬 기반45 집 및 공유 gitHub 저장소에 개발 되었다. 또한 얼마나 많은 데이터를 저장 하 고 외부 하드 드라이브 또는 공유 하는 온라인 데이터 CyVerse46등 필요한 로컬 하드 드라이브에 관리 될 수에 제한이 있습니다.
CDC 원자로 등 물방울 흐름 반응 기34, 기존의 bioreactors 많은 미디어를 필요, 적은 샘플 크기를 제공 하 고 장비 살 균의 높은 금액을 요구. 반면,이 높은 처리량 플랫폼의 장점을 제어 전단, 유량, 수를 포함 하 고 가정 시험관 실험 밀접 하 게 닮은 비보에 조건. 시스템의 여러 액세서리를 포함 하 고 소프트웨어는 세심 한 설정이 필요로 하는 이벤트의 순서에 따라 수행 해야 합니다. 또한, 장비에 대 한 제공 되는 설명서 실험, 그리고 소프트웨어 명령을의 각 단계를 완전히 설명 하지 않습니다 하 고 많은 실수 채널, 성장 또는 첨부 파일의 부족의 막힘을 포함 하 여 실험 하는 동안 발생 하는 결과적으로, 또는 부족 고품질 현미경 이미지 또는 영화. 악기 자체 및 소모품, 미세 번호판 등 상대적으로 비싼 접시 당 200 달러의 가격 태그와 함께 있으며 재사용 되지 않습니다. 따라서, 기술은 강력한 결과 준다, 그러나 그것의 사용에 필요한 전문 기술 상대적으로 높은 고 분야의 전문가에 의해 반복된 훈련이 필요 합니다. 이 보고서는 biofilms 특성 연구를 이러한 bioreactors의 새로운 사용자에 게 가이드를 제공 하 여이 문제를 해결 하려고 합니다.
세포질 분석을 수행할 수 있는 미세 시스템 미생물학, 면역학, 혈액학, 종양학, 및 줄기 세포 연구에서와 같은 다양 한 과학적 modalities에 대 한 상당한 관심을 얻고 있다. 좀 더 구체적으로, 기술 의료 응용 프로그램37,47, 미생물 구두 접착48, 결정의 효과 포함 하 여 관련성이 높은 항목을 설명 하는 많은 간행물에서 결과 녹 농 균 및 황색 포도상구균49,50에 biosurfactants 호스트 병원 체 상호 작용 대장균51, 구 준수52, 및 치료 낭 성 섬유 증53. 의 이 미세 시스템은 매우 다양 한 사실을 감안할 때, 전 세계에 걸쳐 점점 더 많은 시스템을 배포 될 것입니다 예상 된다.
일부 특정 프로토콜 단계를 신중 하 게 고려해 야 합니다. 미디어 dH2O 거품과 막힘 방지 50% 희석 수 있습니다 그러나이 경우에 필요 하지 않았다. OD600 시드에 사용의 특정 값은 무슨 조건 사용의 특정 집합에 대 한 최고의 작품을 보고 성장 실험의 시운전을 사용 하 여 결정 되어야 합니다. 바다 표범 어업 이전 우물에 거품 미세 채널에 거품으로 이어질 수 있습니다 그리고 팝 또는 피 펫 팁 밖으로 빨려에 의해 제거 되어야 한다. 그것은 작은 뱀 채널에서 박테리아를 유지 하는 것이 중요입니다. 시드 프로세스 동안 입력 및 출력 미디어의 동일한 볼륨을 함으로써, 액체 볼륨에서 압력 흐름 흐름은 시스템에서 적용 되는 압력 때문 에서만 제어할 수 있습니다. 교정 거리 설치 하는 동안 회사의 대표에 의해 설정 되어야 합니다. 이러한 설정은 각 카메라에 대 한 특정 있습니다.
이미지에 대 한 가장 대표적인 임계값을 찾을 때 발생 하는 여러 가지 도전이 있다. 최대 임계값 설정 어려운 백그라운드의 지역에 걸쳐 평균 픽셀 강도 일치 하지 않는 경우에 파편 또는 채널의 센터에 단계 위치를 선택 하 여 발생 될 수 있습니다. MM 표준 프로세스를 클릭 하 고 이러한 불일치에 대 한 개정 배경 및 음영 보정 도구를 선택 합니다. 그러나,이 도구는 일반적으로 도움이 사용자 참조 이미지로 사용할 수 있는 뿌리기 전에 채널의 이미지를가지고는 경우만. 또는, 배경/음영 참조 하는 경우 이미지는 사용할 수 없습니다, 사용자는 자신의 판단을 사용 하 여 전체 이미지에 대 한 배경을 포함 하지 않고 가장 셀 영역을 커버 하는 임계값을 설정 해야 합니다. 또는 사각형 영역을 클릭 하 여 불일치, 타원 영역, 또는 추적 지역 영역을 선택 하 여 활성 영역 보다는 전체 선택 영역을 제외 하는 측정을 대표 영역을 선택 이미지 지역 통계 표시 창 ( 분석 도구) 아래에. 대표적인 지역 활용 하는 경우 임계 밝은 필드 이미지 처리를 위한 동일한 지역 해당 FITC 이미지의 측정을 위해 사용 해야 합니다. 그것은 특정 공간 통계 (왼쪽, 위쪽, 너비, 높이, 지역, 둘레) 지역과 관련 된 그 대표적인 같은 지역 찾을 것을 기록 하는 데 도움이 및 해당 FITC 이미지에 측정.
천천히 컴퓨터를 일으키는 원인이 될 하드 드라이브에 데이터의 축적을 방지 하기 위해, 외부 하드 드라이브를 데이터 저장소에 대 한 구입하실 수 있습니다. 데이터 저장 및 촉진 데이터 공유에 대 한 또 다른 옵션은 CyVerse 생물 정보학 플랫폼. Http://www.cyverse.org/로 이동 하 여 CyVerse 시스템에 계정을 만듭니다. 일단 로그인, 검색 환경 시작 다음 "로그에 CyVerse"를 선택 합니다. "데이터"를 선택 하 고 이동 하는 폴더를 당신이. 이미지 스택 로컬 컴퓨터에 있으면 "업로드" 다음 "데스크톱에서 간단한 업로드"를 선택 합니다. 이미지 스택 파일을 찾아서 업로드에 대 한 선택. 파일 또는 폴더 CyVerse 계정이 권한을 부여 받은 경우 공동 작업자와 공유할 수 있습니다. 일반 대 중에 데이터 폴더의 공유 메타 데이터 CyVerse 승인 표준 사용 하 여 각 파일에 대 한 추가 해야 합니다. 이 절차는 하지 논의 여기이이 작업의 범위에 포함 되지 않은 때문에.

여기, 우리는 형광의 형성에 전단 응력의 영향을 측정 하는 방법을 시연할 예정 이다는 자동된 높은 처리량 미세 시스템을 사용 하 여 녹 농 균 (P. 녹 농 균) PA01 biofilms.
Biofilms는 미생물, 박테리아, 세포 외 고분자 물질을 지원에 연결 하 고 일반적으로 액체와 고체 표면1인터페이스에서 찾을 수 있습니다 의해 조직 등의 사회. 개선 수 질 물 공급 라인 및 고집 불통의 bioremediation 화합물2,3와 같은 이러한 biofilm 커뮤니티 환경에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, biofilms 매우 바람직하지 않은 결과 함께 인간의 건강에 유해한 수 있습니다. 예를 들어 엉덩이 무릎 임 플 란 트 등 의료 기기 표면 어디 biofilm 축적 도전 하고있다 심각한 의료 합병증4,5발생의 한 유형입니다. Biofilms 수 또한 같은 강, 호수, 자연의 물 시스템을 입력 하 고 박테리아 감염6,,78인 식 수에 오염에 지도 하는 물 공급 관을 침투. Biofilms 해양 환경에서 형성 된 배와 다른 사람이 만든 기판에 고착 하 고 증가 마찰 증가 연료 소비9,10리드 주요 경제 및 환경 문제를 제시. 같은 Tributyltin, 항균 성 코팅, 이러한 문제를 방지 하기 위해 개발 되었습니다 하지만 해양 생물11독성이 있다.
P. 녹 농 균 은 높은 번성 기능 다양 한 환경 및 nutrimental 조건12그램 음성 박테리아입니다. P. 농 균 지역 사회와 병원 획득 감염의 일반적인 원인은 이며 밀접 하 게 될 관련 부상, 심한 화상, immunocompromised 호스트 등을 같은 낭 성 섬유 증 (CF)5,12, 발견 13, 에이즈, 그리고 암 환자5,13. P. 농 균 biofilms의 대형은 가장 심각 하 게 만성 폐 감염5이 질병 대 한 죽음의 주요 원인이 되는 CF에 연결 되었습니다.
P. 녹 농 균, PA01의 참조 스트레인이이 보고서에 사용 되 고는 향상 된 녹색 형광 단백질 (PA-EGFP)를 표현 하기 위해 유전자 변형. EGFP 돌연변이 형태의 GFP 큰 형광 속성 biofilm 분석 제자리에 형광 현미경 검사 법14,,1516를 사용 하 여 수 나타냅니다. 형광 분석의이 종류는 biofilms의 연구에 대 한 유리한 GFP는 세포 성장 및 기능17크게 방해 하지 않는 때문입니다. 예를 들어 대장균 세포 GFP와 태그를 제어 박테리아17에 비해 어떤 독성 효과 겪어 없이 잘 하 고 지속적으로 성장. 다른 보고서는이 주장을18,,1920입증할. 또한, EGFP 같은 형광 기자를 사용 하 여 신속 하 고 간단 하 고, 아직 죽은 세포는 신속 하 게21형광을 중단 하기 때문에 라이브 셀으로 측정 됩니다.
Biofilms는 다른 흐름 율을 가진 포함 하는 다양 한 환경 조건에서 성장할 수 있다. 예를 들어 영화 성장할 수 있다 높은 전단 응력에서와 같은 강, 높은 물 흐름 조건22큰 미생물 다양성 리드에. 반대로, 서 있는 물 연못 또는 구두 biofilms는 훨씬 낮은 전단 힘23경험. 유량, 이외에 있다 biofilm 접착, 표면 거칠기 등 hydrophobicity, 미디어 구성, 영향을 미치는 다른 요인 그리고 심지어 박테리아 세포 표면1,4,7, 24. 조건 또한 공간 구조 나 형태는 biofilm의 변화를 일으킬 수 있습니다. 이 움직이는 액체에 의해 발휘 된 전단 응력 등 환경 조건 또는 양분 가용성 및 종 같은 생물학적 요인에 그라디언트 시스템, 세포의 운동 성 및 특정 단백질에는 세포 외에 존재 고분자 물질25,,2627 어떤 조건에서 biofilm 잔디 같은 것은 biofilm 거친, 솜 털, 또는 버섯 모양의28도 다른 조건 (부드럽고 평평한), 동안. 체계적이 고 양적 biofilm 잔디와 버섯 구조 사이의 질적 차이 미세한 이미지에서 명확 하 게 볼 수 있습니다, 하는 동안 필요한 영화 구조와 영화 내에서 생물 학적 프로세스 사이의 관계를 이해 형태를 설명 하는 방법. 연구자에 의해 연구에 대 한 제안 형태학 속성 다공성, 프랙탈 차원, diffusional 길이, 층, microcolony 볼륨, 거칠기 계수, 그리고 텍스처 엔트로피29,30 microcolony 지역 포함 .
Bioreactors는 biofilms의 연구에서 실제 생활 조건31을 모방 하는 데 사용 됩니다. 똑 흐름 원자로 (DFR) 낮은 전단 환경을 미디어에 영양소 높은 세포 밀도32biofilm을 형성 하는 시간이 지남에 표면에 부착 하는 셀에 걸쳐 천천히 흐름을 나타냅니다. CDC 원자로 지속적으로 미디어 내 회전 교 반 막대의 제어에 의해 높은 전단 응력 유체 환경을 만드는 bioreactors 채워진 탱크33. 생물 반응 기의이 유형은 간단 하 게 설정, 하지만 그들은 상대적으로 낮은 샘플 크기, 미디어, 미디어 똑 흐름 125 µ L/분 똑 흐름 원자로에서 배열에서 생산 하는 유해 폐기물의 큰 금액의 높은 소비 때문에 범위에 제한 됩니다. 이상 1 mL/분 CDC 원자로 및 고압 대용량 유리 및 폐기물 미디어34의 필요를 Biofilms 성장 하지 않는다 균등 하 게 물방울 흐름 반응 기에서 표면에 걸쳐 미디어의 낮은 전단 P. 농 균 박테리아의 큰 대기업 따라 따라서 후행, biofilm 성장 매우 부드러운 되지 않습니다 원인과 고르지 샘플 수 없습니다 있기 때문에 형광 현미경 검사 법35,36 으로 쉽게 분석.
몇 가지 일반적인 생물 제한만 미디어의 밀리 리터, 고 반응 접시는 작고 쉽게 일회용 압력가 마로 소독37후 중간 처리량 미세 생물을 사용 하 여 극복 됩니다. 또한, 우물의 수에 따라 실행, 충분 한 양의 데이터를 의미 있는 통계 분석을 제공 하는 하나의 반응 기에서 많은 복제를 수행할 수 있습니다. 그림 1, 허용 온도 포함 하 여 제어 된 조건 하 고는 흐름 속도38,,3940, 미세 현미경 시스템의 다른 구성 요소에 표시 됩니다. 생물 낮은 환경에서 또는 생물 의학 분야에서 발생 하는 보다 현실적인 시나리오를 모방 하는 높은 전단 조건 적용 시각화 아래 PA01 EGFP 태그의 형광을 형광 현미경과 결합 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> 그림 1 : 미세 시스템의 개별 구성 요소. 개별 구성 요소는 왼쪽에서 오른쪽으로 나열 됩니다: 1. CCD 카메라, 2. 높은 해상도 거꾸로 현미경 자동 단계와 자동 형광 모듈, 자동 초점 모듈, 3. 4 판 단계: 이미징 시스템 인터페이스, 5: 수동 현미경 단계 제어, 6: 증기 트랩, 7: 이미징 시스템 컨트롤러 (온도 조절기 포함) 8: 하드웨어 컨트롤러, 9: 형광 컨트롤러, 10: 무정전 전원 공급 장치, 11: 이미지 저장, 12에 대 한 외부 하드 드라이브: PC 워크스테이션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
미세 접시의 발췌는 그림 2에 표시 됩니다. 48 웰 스가 가장 일반적으로 사용 되는 격판덮개에 의하여 이루어져 있다. 한 실험에는 1 개의 입구 및 1 개의 출구 우물, 2 웰 스의 총 필요합니다. 항균 처리 및 미디어 채널에서 채널을 다양 하 고 6 개의 채널의 각 열에 대 한 전단 흐름 제어 실험에 대 한 24 동시 수행할 수 있는 세균성 긴장 등 다양 한 실험 조건, 수 있습니다. 실험 온도 또한 접시에 걸쳐 한 온도 설정으로 제어 됩니다. 미세 채널 각 채널에는 충분 한 배 압 및 제어 전단 제공 하 문석 영역 표시.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> 그림 2: 미세 채널 보기 창을의 시각화. 미세 채널 그들 연결 2 개의 입구와 출구 웰 스는 빨간색과 녹색 염료는 강조 표시 됩니다. 염료 보이도록 뱀 지역 유체 흐름 시 충분 한 배 압 및 제어 전단 만드는 각 채널에서 합니다. (빨간색 동그라미) 안에 각 보기 채널 원하는 파장 몇 군데 될 수 있습니다. 밝은 분야 (맨 위) 및 형광 (아래)은 20 X 목표를 사용 하 여 PA01 EGFP biofilm 단일 채널의 현미경 이미지. 눈금 막대 = 80 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
단계적으로 가이드는 형광 현미경 검사 법 사용 하 여 다른 전단 환경 소설 biofilm 실험을 실시와 함께 결합 된 미세 bioreactors의 사용자를 허용 하도록 제공 됩니다. 이 방법은 박테리아, 균 류와 조류, 의료 및 환경 응용 프로그램41,,4243있는 등 외 다른 미생물을 포함 하는 실험의 확장에 대 한 수 있습니다. 자세한 접근 PA01 EGFP 문화, 접종 48-잘 접시 미세 장치 및 소프트웨어를 설정, 형광 현미경, 설정 하 고 biofilm 범위, 성장 속도를 소프트웨어 분석을 설명 하는 방법을 설명 하 고 표면 거칠기 같은 형태학 속성.

<table><tbody><tr><td>염화암모늄, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td>최소 매체 구성의 일부</td></tr><tr><td>BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>910-0047</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>BF 1000Z</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물, ACD 등급</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>최소 매체 조성의 일부</td></tr><tr><td>포도당, 무수, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td>최소 매체 조성의 일부</td></tr><tr><td>황산마그네슘 ACS 등급</td><td>VWR</td><td>EM-MX0070-1</td><td>최소 매체 조성의 일부</td></tr><tr><td>인산칼륨 Monobasic, ACS 등급</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td>최소 매체 조성의 일부</td></tr><tr><td>Pseudomonas Aeurginosa GFP</td><td>ATCC</td><td>15692GFP</td><td>이 연구에 사용된 GFP 변형이 있는 Pseudomonas aeurinosa 박테리아 균주 PA01.</td></tr><tr><td>염화나트륨, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td>최소 매체 조성의 일부</td></tr><tr><td>인산나트륨, 모노 염기성, 무수, 시약 등급</td><td>VWR</td><td>97061-942</td><td>최소 매체 조성의 일부</td></tr></tbody></table>

라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

형광 현미경과 함께 생물 체 외에서 높은 처리량 미세 세균의 biofilm 성장 형태학, 녹 농 균 (P. 녹 농 균) 등을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여기, 우리는 시스템을 사용 하 여 표면 거칠기 등 피 농 균 스트레인 표현 하는 향상 된 녹색 형광 단백질 (PA01 EGFP PA01의 조직상 엔트로피 형태학 속성과 성장 속도 론을 공부 하는 방법을 설명 합니다. ). 자세한 프로토콜 성장과 PA01 EGFP 문화를 시드하는 방법을 설명 합니다, 설정 하는 방법 현미경 및 자동 실행, 이미지 분석을 성장 율 및 형태학 속성에 의해 제어 되는 전단 세력의 다양 한 사용 하는 미세 장치입니다. 이 문서는 결국 미세 플랫폼을 사용 하 여 박테리아, 균 류, 또는 조류 biofilms의 다른 변종으로 적용 될 수 있는 PA01 EGFP biofilms의 연구 개선 하는 기술에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다.

그림 4 보여줍니다 백분율 thresholded 지역 시간이 지남에 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2의 전단 흐름에서 실행 하는 24 시간에서. Biofilm 범위 또는 % 임계값 영역 (C [%]) 모든 3 개의 전단 설정 달랐다. Biofilm 범위는 1.0 다 인/cm2 전단에서 가장 빠른 임계값 영역 2-5%에서 100로 증가 성장 200 분 후 @0 분 후 고정 단계에 도달 했습니다. 0.5 다 인/cm2, biofilm 범위 지연 됐다 고 800 분 후 100% 범위를 도달 하는 400 분에 증가 하기 시작 했다. 0.2 다 인/c m2 에서 가장 낮은 전단 명확 하 게 biofilm 범위, 백분율 범위 500 분에 증가 하기 시작 하지만 결코 넘어 65% 임계값 영역에 도달에서 가장 느린 증가 보여주었다. 이러한 결과 표시 전단 biofilm 표면 범위에 직접적인 영향을 미쳤다. 높은 전단 사실은 미디어는 biofilm 빨리 증식 할 수 있도록 더 많은 영양소와 박테리아를 제공 biofilm 성장 위한 더 최적의 상태를 가능 하 게 것 같았다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> 그림 4: 사용 하 여 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/cm2 24 h 이상 기간 동안 백분율 임계값 영역, 총 biofilm 축적, 거칠기 계수, 및 텍스처 엔트로피. ) 백분율 임계값 영역 (C [%]). 데이터는 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 했다. b) 기간에 24 h 이상 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2 를 사용 하는 시간의 기능으로 총 biofilm 축적 (상대 측정). 검은 라인은 최소 제곱 지 수 모델에 맞는. 데이터는 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 했다. PA01 EGFP의 c) 거칠기 계수 0.2, 0.5, 1.0 다 인/cm의 전단 응력 값을 사용 하 여2 이상 24 h. 데이터 모니터링 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 했다. d) 텍스처 엔트로피 PA01 EGFP의 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/cm2. 의 전단 응력 값을 사용 하 여 각 전단 조건에 대 한 채널에서 얻은 데이터 (Valquier-플 린, H. Sutlief, 앨 러 배 마, 웬트워스, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그림 4 b이 이다 그림 4는에 표시 된 결과와 일치. Biofilm 축적 (N[rel]) 시점 이미지에서 GFP 신호는 그 자리에서 살아있는 세포 밀도에 비례 하는 가정에 따라 측정 되었다. 총 상대 측정 biofilm 축적 기간, 24 h 이상 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2 을 사용 하는 시간의 기능으로 증가 하 고 낮은 전단 응력 높은 전단 응력에서 거부 했다 성장 율을 보여 줍니다. 양적 성장 율을 계산할 수 있는 지 수 성장 주는 명확한 기간 있다.
그림 4 c 는 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2의 전단 흐름에 거칠기 계수 (Ra)을 보여 줍니다. 표면 거칠기, 표면 거칠기 계수에 의해 계량 측정 영화의 두께 프로 파일에 분산 합니다. 공식적인 정의
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
Ti 가 i-번째 두께 측정, T는는 평균 두께 이며 N 은 두께 측정30의 수 있습니다. 이 조사에 설명 된 절차는 살아있는 세포와 관련 된 두께 측정 합니다. 셀의 평면 배열 평균에서 두께의 중요 한 변이 거칠기 계수 1 보다 큰 얻을 것입니다 하는 동안 0의 거칠기 계수를 얻을 것입니다. 성장 속도 영화의 백분율 임계값 범위에 전단 영향와 마찬가지로, biofilms는 시간이 지남에 따라 다른 topographies 전시. 전반적으로, R는는 감소 모든 전단 조건을 나타내는 모든 표면 부드럽게 된 시간이 지남에. 그러나, 0.2 다 인/cm의 낮은 전단에 비해 0.5와 1.0 다 인/c m2 의 높은 전단 설정 결과 매끄러운 표면에 빠른 전단 흐름을 부드럽고 더 심지어 표면과 높은 전단 기여 나타내는 시간이 지남에 1.0 다 인/cm2 0.2 R는는아래에 도달.
부드럽게, 규칙, 또는 표면 거칠기 또한 텍스처 엔트로피 (테)에서 표현할 수 있습니다. 테는 이미지 분석에 2 차원 이미지에서 임의성의 정도 측정 하는 데 사용 하는 속성입니다. 그것의 계산 Haralick 외에의해 정의 된 회색 레벨 동시 발생 매트릭스에 따라., 픽셀 값을 한 위치에서 다른 위치44에서 픽셀 값으로 상관 여부에서 보이는. 상관 관계의 높은 수준의 낮은 엔트로피를 이어질 것입니다. 그림 4 d 묘사 0.2, 0.5 및 1.0 다 인/c m2의 전단 흐름에서 테. 테 모든 전단 조건 하지만 1.0 다 인/cm 최대 테 (1.0) 보다 900 분 낮은 전단 응력에 도달에서 가장 높은 전단 응력에 대 한 시간이 지남에 따라 증가 합니다. 0.2 다 인/c m2 의 낮은 전단 낮은 테 (0.8) 1000 분 후 최대를 도달 했다. 그러나, 0.5 다 인/c m2 의 중간 전단 응력의 최대 테 (1.2) 높거나 낮은 전단 응력 조건 보다 훨씬 늦게 도달.
거칠기 계수와 테 다른 기능을 측정합니다. 편평한 필름 낮은 거칠기 계수와 낮은 엔트로피 것 동안, 두께에 상당한 변이 가진 영화 높은 거칠기 계수 했 하지만 수 낮은 엔트로피 변화는 무작위 보다는 오히려 정현파 경우. 이 경우에, R는는 감소 증가 전단 스트레스와 시간 동안 테 동향 시간이 지남에 biofilm 형성에 적용 하는 스트레스를 전단에 직접 관련이 있을 수 없습니다.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> 그림 S1 : 이미지 캡처 제어 소프트웨어 창의. 다중 차원 수집 메뉴 소프트웨어 창이 (맨 위). 제어 모듈 자동 실행 (하단)에 대 한 설정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> 그림 S2 데이터를 검토 하기 위한 소프트웨어의 캡처 이미지. 관심 분석 도구 메뉴에서 검토 다중 차원 데이터 도구를 사용 하 여 데이터 집합을 선택한 후 응용 프로그램 창. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리 악기를 포함 한 녹색 형광 단백질을 표현 하는 녹 농 균 biofilms에 전단 응력 효과의 분석을 위한 형광 현미경과 함께 더 높은 처리량 미세 생물의 사용 설명 설정, biofilm 범위, 성장 율, 및 형태학 속성의 결정.

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

이 방법은 개발 중 생물막 의 성장과 행동 특성에 영향을 미치는 주요 환경 조건을 식별하는 방법과 같은 생물막 개발에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다중 채널, 마이크로 유체 플레이트가 통계적으로 유의한 결과를 빠르게 획득할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 생물막 구조에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 항생제 치료 및 생물 학적 치료에 적용 될 수있다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 투쟁 할 것 이다, 프로토콜및 세심한 기술의 세부 사항에 주의 주의 하기 때문에, 필요 하기 때문에. 소프트웨어에 계측기연결오류가 발생하지 않도록 PC 워크스테이션을 먼저 켜고 형광 모듈을 켭니다. 형광 셔터가 켜졌는지 확인하고 하드웨어 컨트롤러를 켭니다.다음으로 이미징 시스템 컨트롤러와 CCD 카메라를 켭니다. 그런 다음 이미징 스테이션을 켭니다. 모든 장비가 준비되면 제어 응용 프로그램을 시작하고 플레이트 측면에 있는 레이블에 있는 플레이트 번호를 입력합니다.프라이밍을 위해 먼저 접시 바닥의 유리 표면을 만지지 않고 포장에서 48 개의 미세 유체 플레이트를 제거하고 렌즈 조직으로 플레이트 바닥에 유리 슬라이드를 청소하십시오. 마이크로 유체 채널을 프라임하기 위해, 피펫 200 마이크로 리터37 섭씨 최소 배지를 출력에 잘, 거품을 피하기 위해 주의. 그런 다음 접시를 플레이트 스테이지에 놓습니다.에탄올로 인터페이스를 닦아 에탄올이 건조되면 플레이트 스테이지에 밀봉합니다. 제어 모듈의 수동 모드에서는 액체를 37도에서 Luria-Bertani 국물으로 설정하고 최대 투명도는 평방 센티미터당 5 개의 단음으로 설정합니다. 출력 우물을 클릭하여 출력에서 입력으로의 흐름을 활성화하여 채널을 프라임합니다.5분 후 흐름을 일시 중지하여 시드를 준비하고 스테이지에서 플레이트를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음, 마이크로 유체 채널로 이어지는 내부 원으로부터 배지를 제거하지 않고 출력에서 잔류 배지를 잘 흡인한다. 실험 채널을 시드하려면 최소 배지 300마이크로리터를 입력에 잘 넣고 세균 배양 300마이크로리터를 출력에 잘 첨가합니다.플레이트를 이미징 스테이지로 돌려보내서 플레이트에 놓기 전에 에탄올로 인터페이스를 닦고 라이브 카메라 피드를 사용하여 단일 채널에 집중합니다. 라이브 피드를 시각적으로 모니터링하는 동안, 약 2 ~4 초 동안 평방 센티미터 당 1 ~ 2 dym에서 흐름을 재개하고, 세포가 실험 채널에 입력할 수 있도록하지만 뱀 채널이 아닌, 1 시간 동안 온도 제어 단계에 플레이트를 두고, 세포가 부착 할 수 있도록. 부착 기간이 끝나면 스테이지에서 플레이트를 조심스럽게 제거하고 채널을 방해하지 않고 출력에서 박테리아를 잘 흡인합니다.그런 다음 새 파이펫 팁을 사용하여 입력 우물에서 매체를 제거합니다. 소프트웨어에서, 현미경 이미지 수집을 제어하기 위해 다차원 인수를 열고 시간 경과, 다중 단계 위치 및 다중 파장을 선택합니다. 저장 탭에서 간단한 기본 이름을 만들어 파일이 있는 경우 곡어 기본 이름을 선택합니다.설명에 실험의 필수 세부 사항을 포함합니다. 디렉토리 를 선택하려면 모든 파일이 시간 경과 탭에서 저장되는 폴더를 선택하고 실험 시간의 지속 시간을 24 시간으로 조정하고 실험 전반에 걸쳐 5 분마다 이미지를 획득하는 시간 간격을 설정합니다. 라이브 카메라 피드와 10x 목표를 사용하여 플레이트에 새겨진 채널 번호 위 또는 아래에 있는 채널의 중앙에 초점을 맞추고 스테이지 위치를 설정합니다.20배 목표로 전환하고 채널 내에서 최적의 시야 영역과 초점 평면을 찾습니다. 그런 다음 새 설정을 사용하여 목록에 스테이지 위치를 추가합니다. 파장 메뉴에서 파장의 수를 3으로 설정하고 첫 번째 파장을 FITC 100% 카메라로 설정하고, 10밀리초 노출 시간으로, 두 번째 파장은 50%카메라로 50%를 표시하고, 노출 시간이 3밀리초이고 세 번째 파장은 모두 닫히므로, 획득 시간 사이의 마지막 채널에는 빛이 남아 있지 않습니다.자동 실행 편집 메뉴에서 프로토콜 설정 탭을 열고 적절한 실험 전단 속도로 전진 방향으로 흐름이 설정된 24시간 지속 시간으로 새 프로토콜을 설정합니다. 추가 및 저장을 클릭하여 프로토콜을 저장하고 시퀀스 설정 탭을 엽니다. 새로운 시퀀스를 설정하려면 모든 채널의 기본 유체로 Luria-Bertani 국물을 37도에서 선택합니다.채널 1에서 12까지의 채널에 대한 단계 반복 1에서 첫 번째 실험 전단 속도로 프로토콜을 선택하고 모든 채널을 활성화합니다. 채널 13에서 24까지의 경우 두 번째 실험 전단 속도로 프로토콜을 선택하고 모든 채널을 활성화합니다. 그런 다음 적용 및 저장을 선택하여 시퀀스를 저장하고 AutoRun 메뉴를 열어 AutoRun에 사용할 저장된 시퀀스를 선택합니다.시간 별 성장 생물막 실험을 설정하려면 최대 1,300마이크로리터의 멸균 최소 배지를 마이크로 유체 플레이트의 입력 웰에 추가하고 플레이트를 이미징 단계로 되돌려 놓습니다. 그런 다음 에탄올로 인터페이스를 닦고 접시를 밀봉합니다. 프로토콜과 시퀀스가 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다.시작을 선택하고 자동 실행을 시작하고 즉시 클릭하여 현미경 이미지 컬렉션을 시작합니다. 첫 번째 이미지 수집이 끝나면 일시 중지를 클릭하고 밝은 필드 파장에서 라이브 이미지 모드를 선택합니다. 각 스테이지 위치를 보려면 이동을 선택하고 현재로 설정하여 새 설정을 설정합니다.그런 다음 다음 예약된 인수를 시작하기 전에 이력서를 클릭합니다. 이 대표적인 시간적 생물막 성장 실험에서, 생물막 커버리지 또는 백분율 임계 값 표면적, 전단이 생물막 표면 커버리지에 직접적인 영향을 미쳤음을 나타내는 세 가지 전단 설정 모두에 대해 상이했다. 바이오필름 축적의 총 상대측정은 시간의 함수로서 증가하여 가장 높은 전단 응력에서 가장 낮은 전단 응력으로 성장률이 감소했습니다.각 조건하에서, 양적 성장률을 계산할 수 있는 기하급수적인 성장의 명확한 기간이 있었습니다. 전반적으로, 모든 전단 조건에서 시간이 지남에 따라 거칠기 계수가 감소하여 모든 생물막 표면이 부드러워졌음을 나타냅니다. 그러나 가장 낮은 전단과 비교하여 전단 설정이 높아져 시간이 지남에 따라 표면이 부드러워져 더 빠른 전단 흐름이 더 부드럽고 균일한 표면에 기여한다는 것을 나타냅니다.또한, 모든 전단 조건에 대해 시간이 지남에 따라 텍스처 엔트로피 또는 형태의 임의성이 증가했습니다. 이 절차를 수행하는 동안 지정된 시퀀스를 따르고 각 단계를 정확하게 수행하는 데 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 필요한 기술은 마스터하기 위해 몇 가지 실행을 취할 수 있습니다.이 절차에 따라 HBLC 또는 GCMS와 같은 다른 방법은 포도당과 같은 아직자의 농도에 대한 추가 질문에 응답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 생물막 분야의 연구원들이 통제된 실험 조건과 수치료 샘플링을 통해 일반 흐름 환경을 실시간으로 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. BSL2 세균균과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 보호 장비를 착용하고 적절한 폐기물 프로토콜을 사용하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

출처: Cayron, J., et al. 스트레스 치료 하에서 박테리아 성장에 대한 다중 규모 분석. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 스트레스 조건에서 박테리아 세포를 이미징하기 위해 미세유체 플레이트를 준비하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 배양과 스트레스 유도 항생제 배지를 도입한 후 세포 로딩 및 현미경 설정을 도입하는 과정을 간략하게 설명합니다. 그런 다음 위상차 모드의 타임랩스 이미징을 사용하여 세포 분열 억제로 인해 DNA 함량이 증가한 길쭉한 사상형 세포의 발달을 관찰합니다.

미세유체 챔버를 사용한 스트레스 하에서 박테리아 성장의 현미경 분석

출처: Sutlief, A. L. 외 자동화된 고처리량 마이크로유체 시스템을 이용한 Pseudomonas aeruginosa 의 전단 응력에 대한 생세포 분석. J. Vis. 경험 (2019).이 영상은 박테리아 배양에서 전단 응력 연구를 위한 마이크로플루이딕 플레이트 준비 과정을 보여줍니다. 채널에 배지를 프라이밍한 후, 박테리아 세포를 실험 채널에 도입하여 부착을 위해 배양합니다. 잔류 배지와 배양물을 제거하여 이후 전단 응력 실험을 준비합니다.

박테리아 세포를 이용한 마이크로플루이딕 플레이트 준비

이 연구는 크게 생리학 관련 전단 흐름에 따라 세포 롤링 연구의 처리량을 증가, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 캐스케이드 및 환자 세포의 외인성 개체군의 전신 전달 다음 세포 호밍의 중요성을 원점 다단계 셀에서 셀 압연의 중요성을 감안할 때,이 시스템은 세포 기반 치료를 개선하기위한 스크리닝 플랫폼으로 잠재력을 제공한다.

의 체계적인 분석 체외 셀 롤링

여기, 유체 전단 응력에서 내 피 세포의 문화 및 유전자 표정 분석에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 포함 된 동시에 주택 및 제어 환경에 양이 많은 PCR에 대 한 참조 외 인 RNA 사용 하 여 여러 흐름 챔버 모니터링에 대 한 물리적 배열이입니다.

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

이 프로토콜은 시험관 내에서 암성 및 비암성 세포주의 기계적 특성의 정량화를 설명합니다. 암세포와 정상 세포의 역학에서 보존된 차이는 예후와 진단에 영향을 미칠 수 있는 바이오마커로 작용할 수 있습니다.

단세포 물질 특성 측정을 위한 전단 분석 프로토콜

배우세요 미세유체 바이오리액터를 활용한 Pseudomonas aeruginosa 바이오필름 전단 응력 분석 방법을. 형광 현미경으로 실시간 성장을 관찰하여 항생제 처리 및 생물학적 복원 연구에 활용할 수 있습니다.

라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여

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