Name: 메르켈 세포 폴리오 감염 및 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 배우세요 인간 진피 섬유아세포에서 Merkel Cell Polyomavirus 감염 및 탐지 방법을. 면역형광 염색과 형광 원위교잡법을 활용하여 바이러스 단백질과 DNA를 시각화하고 MCPyV 감염 주기를 연구할 수 있습니다.

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저자 박사 Meenhard Herlyn (Wistar 연구소)과 박사 M. 셀 레스트 사이먼 (펜실베니아 대학교) 시 약 및 기술 지원 제공 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 유용한 토론에 대 한 우리의 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) 보조금 (R01CA187718, R01CA148768 및 R01CA142723), NCI 암 센터 지원 그랜트 (NCI P30 CA016520), 그리고 펜 CFAR 수상 (P30 AI 045008)에 의해 지원 되었다.

인간의 신생아 속하고 펜 피부 질환 연구 센터에서 얻은 했다. 성인 인간 섬유 아 세포는 수술 후 폐기 정상 피부에서 얻은 했다. 모든 프로토콜은 펜실베니아 기관 검토 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 인간 피부 섬유 아 세포의 고립
<ol><li>가 위를 사용 하 여 인간의 신생아 포 피에서 지방과 피하 조직에서 트림 하 고 반쪽 또는 분기 피부 샘플을 잘라.</li>
	<li>10 mg/mL dispase PBS 항생제 antimycotic 보충에 II의 5 mL에 조직 품 어 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>멸 균 10cm 접시에서 신중 하 게 서 집게를 사용 하 여 피부 층에서 표 피를 분리 합니다.</li>
	<li>양도 2 mg/mL 콜라의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 결과 피부 조직 FBS 무료 매체 항생제 antimycotic 보충에 4를 입력.</li>
	<li>그냥 몇 거시적인 조직 집계 남아 때까지 5% CO2 주기적인 동요를 가진 4-6 h 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>Pipetting (분쇄) 위아래로 적극적으로 10 배 10 mL 피 펫과 진 피에서 단일 셀을 분리 하십시오.</li>
	<li>5 분, 180 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>DMEM 매체 1%와 10% 태아 종 아리 혈 청, 1% 비 본질적인 아미노산, 보충에 천연된 셀 접시 5% CO2에서 37 ° C에서 L-글루타민.</li>
</ol>2. 재조합 MCPyV virion 준비
<ol><li>250 (나르는 MCPyV 게놈) pR17b 플라스 미드의 다이제스트 50 µ g 200 µ L 볼륨 (37 ° C에서 4 h)에서 U의 BamHI-HF 벡터 백본 (그림 2)에서 바이러스 성 게놈을 분리.</li>
	<li>소화 DNA에 버퍼 PB (10 µ L 3 M NaAc, pH 5.2의 보충)의 1200 µ L을 추가 하 고 2 miniprep 스핀 열 (20 µ g DNA 용량)를 정화. 200 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl pH8.0, 1 mM EDTA)의 각 열에서 소화 pR17b 플라스 미드 elute</li>
	<li>50 mL 원심 분리기 튜브에 결 찰 반응 준비. 단계 2.2, 1.05 x T4 리가 버퍼의 8.6 mL 및 높은 농도 T4 리가의 6 µ L에서에서 순화 된 플라스 미드 DNA의 400 µ L를 추가 합니다. 16 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>결 찰에 버퍼 PB (10 µ L 3 M NaAc, pH 5.2의 보충)의 45 mL를 추가 하 고 진공 매니폴드 2 miniprep 스핀 열 로드를 사용 하 여. 각 열 테 버퍼의 50 µ L elute DNA의 약 30 µ g의 수익률을 기대 합니다.</li>
	<li>늦은 오후/저녁, 10 ㎝로 씨앗 6 x 106 293TT28 셀 접시 1%와 10% 태아 종 아리 혈 청, 1% 비 본질적인 아미노산, 보충 포함 DMEM 매체 hygromycin B. 없이 L-글루타민</li>
	<li>다음날 아침, 셀 약 50%는 확인 confluent. Transfection 시 약 (1.1 µ L/c m2)의 66 µ L를 사용 하 여 transfect, 다시 합자 MCPyV의 12 µ g 2.4, 세인트 식 플라스 미드 pMtB의 8.4 µ g와 9.6 µ g LT 식 플라스 미드 pADL *29의 단계에서 R17b DNA를 분리.</li>
	<li>Transfected 세포는 거의 confluent 다음 날, 셀 trypsinize 고 지속적인된 확장을 위한 15 cm 접시에 그들을 전송.</li>
	<li>필요에 따라 확장 시 293TT 세포의 작은 수 고 MCPyV LT (CM2B4)에 대 한 얼룩 경우 수행 및 VP1 (MCV VP1 토끼30) transfection 효율을 결정 하. 이 단계에서 핵 LT 신호를 볼 수 있습니다 하지만 VP1 식 아마 되지 않습니다 감지.</li>
	<li>15 cm 접시 때 거의 합칠 (보통 5-6 일 후 초기 transfection), 3 15 cm 요리에 셀을 전송. 그들은 거의 confluent 될 때 바이러스 수확 프로토콜을 아래에 따라 15 cm 요리에서 세포를 수확. 참고: 필요에 따라 단계 2.8에서에서 설명 하는 경우로 품질 관리를 수행 합니다. 세포의 대부분은 MCPyV LT와이 단계에서 긍정적인 VP1 이어야 한다.</li>
	<li>바이러스를 수확, 셀 trypsinize 하 고 RT에서 5 분 동안 180 x g 에서 스핀은 상쾌한을 제거 합니다. 한 셀 펠 릿 볼륨 DPBS Mg (9.5 m m MgCl2 와 1 x 항생제 antimycotic DPBS)의 추가. 다음 추가 25 m m (1 개 M pH 9 재고 솔루션)에서 황산 암모늄 뒤 0.5% 트라이 톤 X-100 (10% 주식 솔루션에서), ATP 의존 DNase의 0.1%와 0.1 %Benzonase. 잘 혼합 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>얼음에 15 분 동안 혼합물을 품 어 고 5 M NaCl의 0.17 볼륨을 추가 합니다. 믹스와 4 ° C 원심 분리기에서 12000 x g 에서 10 분에 대 한 또 다른 15 분 회전을 위해 얼음에 품 어. 상쾌한 명확 하지 않으면 부드럽게 튜브를 반전 하 고 회전 단계를 반복 합니다. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송.</li>
	<li>단계 2.11에에서 설명 된 대로 다시 0.8 M NaCl와 스핀 보완 하는 DPBS의 한 볼륨을 사용 하 여 펠 릿 resuspend</li>
	<li>2.11와 2.12, 단계에서 supernatants 결합 하 고 한 번 더 단계 2.11에에서 설명 된 대로 회전.</li>
	<li>바탕 (27%, 다음 33%, 39%)에 의해 얇은 벽 5 mL polyallomer 튜브에 iodixanol의 그라디언트를 부 어 3 mL 주사기를 사용 하 여 ~0.7 mL 단계 긴 바늘 또는 p1000 피 펫 장착.</li>
	<li>준비 된 iodixanol 그라데이션에 명확히 포함 하는 바이러스 상쾌한의 3 mL을 로드 합니다.</li>
	<li>3.5 h 234000 x g 와 SW55ti로 터에서 16 ° C에 대 한 스핀. 가속 및 감속 속도를 설정 합니다.</li>
	<li>Ultracentrifugation, 후 시 튜브 (각 분수는 ~ 400 µ L) 12 분수를 수집 합니다.</li>
	<li>바이러스의 존재에 대 한 분수 dsDNA 시 약 및/또는 VP1에 서쪽 오 점 분석 (MCV VP1 토끼30). 피크 dsDNA 또는 VP1 풀 그라데이션 분수 콘텐츠 그리고 양이 많은 PCR 바이러스 성 게놈에 해당31를 계산 하 여 재고 특성. -80 ° c.에 MCPyV virion 재고 저장</li>
</ol>3입니다. 감염
<ol><li>유지 하는 기본 인간 피부 섬유 아 세포 DMEM에 1%와 10% 태아 종 아리 혈 청, 1% 비 본질적인 아미노산 L-글루타민. 합류에 도달, 분할 아래로 회전 없이 fibroblasts 1:4. 참고: MCPyV 감염 효율성을 사용 하 여 기본 fibroblasts 구절 5와 적극적으로 도금의 시간에 나누어 12 사이.</li>
	<li>인간 피부 섬유 아 세포, 감염 매체를 발음 하 고 세척 DPBS 셀.</li>
	<li>0.05%의 1 mL을 추가 접시에 트립 신-EDTA와 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>셀 접시에서 오고 있다 다는 것을 확인 하는 현미경 검사.</li>
	<li>DMEM/F12 매체 포함 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF와 3 µ M의 10 mL를 추가할 CHIR99021, 모두는 MCPyV 감염24, 접시를 자극 하 고 15 mL 튜브에 셀 솔루션을 전송.</li>
	<li>2 분, 180 x g 에서 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한. DMEM/F12 매체 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF와 3µM를 포함 하는 셀 resuspend CHIR99021 mL 당 104 셀 x 2-4.</li>
	<li>보충 96 잘 접시의 각 음에 1 mg/mL 콜라 유형 IV 세포 현 탁 액의 200 µ L 씨 MCPyV virion 주식 얼음에 녹여 감염 된 것으로 각 2500 ~ 5000 셀에 대 한 iodixanol의 1 µ L 당 MCPyV virions (에서 계산된 단계 2.18)의 109 바이러스 성 게놈에 해당 추가 합니다.   접시의 사이드를 부드럽게 누르고 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>5% CO2 48-72 시간에서 37 ° C에 외피, 후 추가 20 %FBS 각 잘 하.</li>
	<li>감염 5% CO2 72 96 시간에서 37 ° C에서 진행을 허용 합니다.</li>
</ol>4. immunofluorescent 얼룩
<ol><li>20 분에 대 한 PBS에 3 %paraformaldehyde 단계 3.9에서에서 얻은 셀을 수정 합니다.</li>
	<li>PBS 가진 셀을 두 번 씻어.</li>
	<li>차단/permeabilization 버퍼에 셀을 품 어 (0.5% 트라이 톤 X-100, PBS에 3% BSA 0.22 μ m 필터를 통해 필터링) 1 시간에 대 한 실시간에.</li>
	<li>다음 주 항 체와 세포를 품 어: 마우스 단일 클로 널 안티-MCPyV LT (CM2B4) (1:1000)와 토끼 polyclonal 안티-MCPyV VP1 항 체 (1: 2000), 3 h에 대 한 실시간에.</li>
	<li>PBS 가진 셀 세 번 씻어.</li>
	<li>2 차 항 체와 세포를 품 어: Fluor 594 염소 반대로 마우스 IgG (1:1000) 및 Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG (1: 500) RT에 1 시간.</li>
	<li>PBS와 셀 세 번 씻어.</li>
	<li>0.5 µ g/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)와 셀 counterstain</li>
	<li>유리에 마운트 coverslips 슬라이드 및 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 분석.</li>
</ol>5. 현장에서 DNA-HCR
참고:이 기술은 coverslips에 셀 시드할 수 해야 합니다. 이 목적을 위해 (3 단계) 위에서 설명한 감염 조건 24-잘 플레이트 형식 조절 수 있습니다.
<ol><li>셀 수정 4 %coverslips 교양 PFA PBS로 두 번 10 분 워시는 coverslips에 대 한 PBS에 다음 취급 하룻밤 4 ° C에서 세포를 permeabilize을 70% 에탄올과. 참고: 고정 된 샘플 수 있는 몇 일 동안이 상태에 남아 있습니다.</li>
	<li>사전 조사 교 잡 버퍼와 에탄올을 대체 하 고 실시간에 60 분 동안 배양 하 여 샘플을 교배</li>
	<li>Probe(s) (1 µ M)를 희석 (표 1) 프로브 교 잡에서 1: 500 희석 30 분 사전 교 잡 단계 끝 이전에 솔루션을 버퍼링 하 고 45 ° c.에 품 어</li>
	<li>외피는의 끝에, 현미경 슬라이드에 coverslip 당 희석된 프로브 믹스의 ~ 10 μ 플라스틱. 장소 coverslips, 셀-사이드, 교 잡 조사의 그들의 각각 방울 혼합. 가장자리와 고무 시멘트의 자유 금액으로 슬라이드에는 coverslips의 뒤를 봉인.</li>
	<li>94 ° C에서 3 분에 대 한 추가 조사와 함께 열 블록의 편평한 측에 슬라이드를 설정 하 여 슬라이드를 열. 습도 챔버 슬라이드를 전송 하 고 하룻밤 45 ° C에서 품 어. 간단한 습도 챔버를 하려면 메 마른 종이 타 올 dH2O와 고무 가스 켓으로 밀봉 하는 플라스틱 컨테이너의 하단에서 약간 축이십시오. 참고: 고무 시멘트를가 열 하는 동안 수 거품 짧게. 그러나, 인감 휴식 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 벗 겨 집게와 고무 시멘트 고 백업 coverslips 셀 사이드 24-잘 접시의 우물 합니다. 세 번 RT에서 프로브 워시 버퍼와 coverslips을 씻어.</li>
	<li>RT에서 증폭 버퍼 (24-잘 접시에서 200 µ L)에 coverslip 품 어 30-60 분.</li>
	<li>한편, 두 개의 레이블된 oligonucleotide 헤어핀 90 94 ° C로가 열 하 여 별도 PCR 튜브에 프로브 (표 1)을 인식의 각 anneal s 고 빛 으로부터 보호 하면서 30 분에 대 한 RT를 냉각. 증폭 버퍼, 1시 50분의 희석에 각각 두 개의 헤어핀을 믹스.</li>
	<li>24-잘 접시 뚜껑의 오픈 얼굴 파라핀 영화를 늘려서 증폭 반응에 대 한 화면을 확인 합니다. 50-100 µ L 방울 머리 핀/증폭 버퍼 혼합물 각 coverslip 파라핀 필름에의 플라스틱 집게를 사용 하 여 신중 하 게는 coverslips 사전 증폭 솔루션에서 제거. 다공성 일회용 없애 가장자리를 만져는 coverslip 건조 및 증폭 물방울에 아래로 셀 측을 두십시오.</li>
	<li>습도 챔버에는 coverslips를 들고 접시 뚜껑을 배치 하 고 어둠 속에서 RT에서 밤새 품 어.</li>
	<li>웰 스에 한 번 더는 coverslips를 반환 합니다. 5 샘플을 품 어 x SSCT [염화 나트륨 나트륨 시트르산 (SSC) 0.1% Tween 20 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 x 5] 샘플 5 두 번 씻어 0.5 µ g/l DAPI에서 실시간 1 h 포함 된 실시간에 x SSCT</li>
	<li>현미경 슬라이드에는 coverslips를 탑재 합니다. 셀을 분석 하 고 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 샘플 이미지.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

인간의 피부 조직에서 피부 섬유 아 세포의 분리, 재조합 MCPyV virions의 준비, 배양된 세포, immunofluorescent 얼룩이 지 고 HCR 기술에서 적응 하는 민감한 물고기 방법의 감염을 포함 하 여, 위에서 설명한 방법입니다 MCPyV 감염27를 분석 하는 연구원을 사용 해야 합니다. 생체 외에서 MCPyV 감염을 달성 하는 가장 중요 한 단계 중 하나는 높은 titer virion 준비의 생산 이다. 여기에 설명 된 재조합 MCPyV virions의 준비에 대 한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 idoxanol 용 매11,12의 mL 당 1012 게놈 사본의 바이러스 titers를 얻을. 이러한 높은 titer MCPyV 준비 우리가 주 피부 세포 유형으로 지금까지 HDFs를 식별 하기 위해 전체 MCPyV 감염을 지원 하기 위해 나타나는<...

메르켈 세포 폴리오 (MCPyV)는 드물지만 적극적인 피부 암, 메르켈 세포 암 (MCC)1,2와 관련 된 작은, 이중 가닥 DNA 바이러스 이다. 고객 센터, 약 33%의 사망률의 흑색 종3,4를 초과합니다. MCPyV는1,~ 5 kb5 일찍 하 고 늦게 지역1코딩에 비 코딩 규제 지역 (NCRR)에 의해 bisected의 원형 게놈. NCRR 복제 (오 라), 바이러스 성 전사6,7에 대 한 양방향 발기인의 바이러스 성 기원을 포함 되어 있습니다. 초기 지역 대형 T (LT), 작은 T (sT), 57kT, 대체 LT ORF (알토), 뿐만 아니라 autoregulatory 미르1,8,,910라는 종양 항 원 단백질을 인코딩합니다. 늦은 지역 capsid 단백질 VP1, VP211,,1213인코딩합니다. LT와 세인트 베스트 공부 MCPyV 단백질은 바이러스 성 DNA 복제 및 MCPyV 유도 tumorigenesis5를 지원 하기 위해 표시 되었습니다. MCCs의 최대 80%에서 관찰 되었다, 주인 게놈으로 MCPyV DNA의 클론 통합 가능성이 바이러스 양성 종양 개발14,15에 대 한 원인 요소입니다.
고객 센터의 발생률은16지난 20 년 동안 3 배. 무 증상 MCPyV 감염 또한 일반 인구17,,1819에 대폭적 이다. 고객 센터 진단의 증가 수 및 MCPyV 감염의 높은 보급, 바이러스 그리고 종양 잠재력의 우리의 이해를 향상 시킬 필요가 있다. 그러나, MCPyV 생물학 및 종양 메커니즘의 여러 측면에 불완전 하 게 이해20남아 있다. 이것은 MCPyV 설립된 셀 라인11,12,21,,2223 에 가난 하 게 복제 하 고, 최근까지, 피부 세포 MCPyV를 지원 하기 때문에 크게 감염 된22되지 않았습니다 했다. 완전히 MCPyV 및 호스트 세포와의 상호 작용을 조사 하기 위해 기계 연구 전파 바이러스5셀 문화 시스템의 부족에 의해 방해 되어 있다.
우리는 기본 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFs) 신생아 인간의 포 지원 강력한 MCPyV 감염에서 모두 고립 생체 외에서 발견 및 비보 전24. 이 연구에서 우리는 MCPyV24에 대 한 첫 번째 셀 문화 감염 모델 설립. 이 모델 시스템을 기반으로, 우리는 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 유전자는 WNT/β-catenin 신호 통로 및 다른 성장 인자에 의해 유도 MCPyV 감염 자극 보였다. 또한, 우리는 FDA 승인 MEK 적 trametinib MCPyV 감염5,25을 효과적으로 억제 한다 발견. 이 연구에서 우리 또한 설립 인간 피부 섬유 아 세포24,25, 격리 하기 위한 프로토콜 집합 MCPyV virions11,12, MCPyV 감염 인간 피부 섬유 아 세포에 수행 준비 24 , 25 그리고 경우 얼룩26에 의해 감지 MCPyV 단백질. 또한, 우리는 원래의 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR) 기술27 감염 된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 탐지 하기 위한 매우 중요 한 물고기 기술을 (HCR DNA 물고기)를 개발 하기 위해 적응. 이러한 새로운 방법을 MCPyV MCPyV 감염에 세포질 응답의 감염 주기를 공부 하는 데 유용 있을 것입니다. MCPyV 감염을 유지 하는 자연 호스트 저수지 셀 셀을 MCC 종양을 알 수 없는 남아 있습니다. 우리이 원고에서 설명 하는 기술은 다양 한 종류의 인간의 세포 저수지 셀을 식별 하 고 고객 센터 종양의 기원 검사에 적용할 수 있습니다. 우리의 설립된 방법, HCR DNA 생선, 다른 DNA 종양 바이러스의 검출에 호스트 세포 상호 작용의 특성 또한 채택 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GLUTAMAX I, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>L-글루타민</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF 단백질, CF</td><td>R& D systems</td><td>236-EG-200</td><td>섭씨 -80도에서 보관</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td>섭씨 -80도에서 보관</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>SML1046</td><td>섭씨 -80도에서 보관</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 IV 형</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티-마우스 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11032</td><td>Protect</td></tr><tr><td>from light Alexa Fluor 488 염소 안티-토끼 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>시그마</td><td>D1556</td><td>빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>안티-MCPyV LT (CM2B4)</td><td>산타크루즈</td><td>sc-136172</td><td>Lot # B2717</td></tr><tr><td>MCV VP1 토끼</td><td></td><td>다클론 세럼 #10965</td><td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td><td>Corning</td><td>354060</td><td>Store at -80 °C</td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease Sigma</td><td></td><td>E8263</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td><td>EPICENTRE</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>Probe hybridization buffer</td><td>Molecular technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe wash buffer</td><td>Molecular technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>증폭 완충액</td><td>분자 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 표지 헤어핀</td><td>분자 기술</td><td>B4</td><td>Protect</td></tr><tr><td>from light Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>Buffer PB</td><td>Qiagen</td><td>19066</td><td></td></tr><tr><td>블루 miniprep 스핀 컬럼</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>T4 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5602</td><td></td></tr></tbody></table>

메르켈 세포 폴리오 감염 및 탐지

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

메르켈 세포 감염 폴리오 (MCPyV)는 메르켈 세포 암 종 (MCC), 매우 공격적인 형태의 피부 암으로 이어질 수 있습니다. 기계 연구 MCPyV 분자 생물학 및 종양 메커니즘을 완벽 하 게 조사를 적절 한 셀 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 우리가 수행 하 고 기본 인간 피부 세포의 MCPyV 감염 검출을 위한 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 프로토콜 immunofluorescent (IF) 얼룩이와 현장에서 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR), 매우 민감한은 인간 피부 섬유 아 세포의 고립 재조합 MCPyV virions의 준비 및 바이러스 감염의 탐지 설명 제자리 교 잡 (물고기) 접근에서의 형광 본 프로토콜 관심이 연구원은 다른 세포 유형 또는 MCPyV 감염을 지 원하는 셀 라인을 식별 하 여 적응 될 수 있다. 설명된 물고기 접근 감지 감염 된 인간 피부에 바이러스 성 DNAs의 낮은 수준에 대 한 또한 적응 수 있습니다.

이 원고에 설명 된 프로토콜 HDFs (그림 1)의 거의 균질 인구의 격리 허용. Immunofluorescent 얼룩에 의해 같이, 거의 100%는 인간의 피부 세포 격리를 사용 하 여이 프로토콜에서 설명 하는 조건을 했다 긍정적으로 스테인드 피부 섬유 마커, vimentin, 및 콜라겐 나24, 그러나 인간에 대 한 부정적인 포 피 keratinocyte 마커 K14 (그림 1). 그림 2 는 ultracentrifuge 농도 후 재조합 MCPyV 게놈 및 virion 샘플을 사용 하 여 MCPyV virions를 생성 하는 과정을 보여준다. 그라데이션 ( 그림 2B화살표에 의해 표시...

여기, 우리는 프로토콜 기본 인간 피부 섬유 아 세포 MCPyV와 감염을 제시. 프로토콜은 제자리 교 잡에 피부 섬유 아 세포의 분리, MCPyV virions, 바이러스 감염, 면역 형광 염색 법, 형광의 준비를 포함 한다. 이 프로토콜은 MCPyV에 의해 특성화 MCPyV-호스트 상호 작용 및 다른 세포 유형 infectable을 발견에 대 한 확장할 수 있습니다.

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

우리는 메르켈 세포 폴리오마 바이러스 감염에 대한 첫 번째 세포 배양 모델을 제시했다. 프로토콜은 진피 섬유아세포의 격리, MCPyV 바이러스 감염의 준비, 면역 형광 염색 및 시상 혼성화에서형화를 포함한다. 이 프로토콜은 바이러스 유전자의 과발현과 관련된 유물을 피하면서 MCPyV 전염성 주기 및 숙주 세포와의 상호 작용을 연구할 수 있게 합니다.시작하려면 가위 한 쌍을 사용하여 인간의 신생아 포피에서 지방 및 피하 조직을 다듬습니다. 피부 샘플을 반이나 분기로 자릅니다. 항생제 항mycotic로 보충 된 밀리 리터 디스 기반 II NPBS 당 10 밀리그램의 5 밀리리터에 조직을 배치합니다.하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오. 다음 날, 미세 절 집게를 사용하여 10 센티미터 접시에 진피 층에서 표피를 조심스럽게 분리하십시오. 결과 진피 조직을 15 밀리리터 원내 형질 관에 전달하여 항생제-해부학으로 보충된 FBS 프리 배지에서 밀리리터 콜라게나아제 타입 IV당 2 밀리리터 5밀리리터를 함유하고 있습니다.시료를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 배양하고 4~6시간 동안 주기적인 흔들림을 가하면 몇 개의 거시적 조직 골거체만 남게 됩니다. 그 후, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 시료 용액을 10번 위아래로 피펫하여 진피로부터 단일 셀을 방출합니다. 원심 분리기는 180g에서 5분간, 상체를 폐기합니다.DMEM 배지를 보충하여 해리된 세포를 플레이트. 늦은 오후 또는 저녁에, 씨앗 6 백만 293TT28 세포를 보충 DMEM 매체를 포함 하는 10 센티미터 접시에 세포. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다.다음 아침, 세포가 약 50%의 컨실루티,이 세포를 트랜스펙트 66 마이크로리터의 트랜스페트 R17B DNA, 8.4 마이크로그램의 ST 발현 플라스미드 pMtB, 및 9.6 마이크로그램의 LT 발현 플라미드 pADL을 통해 세포를 트랜스펙트한다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 세포를 배양합니다. 다음 날, 전염된 세포가 거의 혼잡할 때, 세포를 트립시로 하고 계속 확장을 위해 15센티미터 접시로 옮기습니다.그 요리가 거의 혼잡해지면 세포를 새로운 15센티미터 요리 3개로 옮기게 합니다. 그 새로운 요리가 거의 혼잡하게 될 때, 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 세포를 수확. 실온에서 180g의 원심분리기는 5분간.그런 다음 상체를 제거하고 DPBS 마그네슘의 세포 부피를 추가합니다. 25 마이크로몰라 암모늄 황산염을 추가하고, 그 다음으로 0.5%트리톤 X-100, 0.1%벤조나아제, ATP 의존DNAe의 0.1%를 넣습니다. 잘 섞어서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오.다음 날, 15 분 동안 얼음에 혼합물을 냉각. 다음으로, 염화 나트륨의 0.17 부피를 추가합니다. 얼음에 섞고 인큐베이션을 15분 더 기다립니다.10 분 동안 섭씨 4도에서 12,000g의 원심 분리기. 상체가 명확하지 않은 경우 튜브를 부드럽게 반전시키고 원심 분리를 반복하십시오. 이 후, 새로운 튜브에 상체를 전송합니다.염화 나트륨 의 0.8 두더지로 보충 DPBS의 1 부피에서 펠릿을 다시 중단. 원심분리기는 섭씨 4도에서 12,000g으로 10분 간. 상체가 명확하지 않은 경우 튜브를 부드럽게 반전시키고 원심 분리를 반복하십시오.두 개의 수퍼나티와 원심분리기를 섭씨 4도에서 12,000g으로 10분간 다시 결합합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 iodixanol의 그라데이션을 얇은 벽5 밀리리터 폴리알로머 튜브로 증착합니다. 준비된 iodixanol 그라데이션 위에 명확한 바이러스 함유 상체의 3 밀리리터를 로드합니다.SW 55 Ti 로터가 있는 원심분리기는 234,000g, 섭씨 16도에서 3.5시간 동안 가속과 감속을 느리게 설정합니다. 초원심분리가 완료되면 실리콘 튜브에서 12개의 분수를 수집합니다. 세포를 유지 및 분리 한 후, 10 밀리리터의 보충 DMEM 및 F12 배지에서 접시에.세포 용액을 15 밀리리터 튜브로 전송합니다. 원심 분리기 180g에서 2분 동안. 상체를 버리고 밀리리터 당 20,000~40,000개의 세포 밀도에서 보충된 DMEM 및 F12 배지에서 세포를 다시 중단한다.이어서, 종자 200 또는 400 마이크로리터는 콜라게나아제 타입 IV의 밀리리터당 1밀리그램으로 각각 24 또는 96웰 플레이트의 각 웰로 보충한다. MCPyV 비론 스톡을 영하 80도 냉동고에서 제거하고 얼음 위에 놓아 해동하십시오. 감염될 각 2500에서 5000개의 세포에 대해 iodixanol의 1개의 마이크로리터 당 MCPyV virions의 10억 바이러스 게놈 등가물을 추가합니다.접시의 측면을 부드럽게 누르고 5 %의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양하십시오. 먼저, 10분 동안 PBS에서 4%PFA로 커버 슬립에 세포를 고정한 다음, PBS로 커버 슬립을 두 번 세척하고 세포를 투과화하기 위해 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 70%에탄올로 치료합니다. 다음 날, 에탄올을 프로브 수분 공급 버퍼로 교체하고 실온에서 60분 동안 배양하여 시료를 미리 혼성화합니다.혼성화가 시작되기 30분 전, 프로브 혼성화 용액의 프로브를 1:500 희석으로 희석하고 섭씨 45도에서 배양합니다. 배큐어가 완료되면, 각 커버 슬립에 대한 현미경 슬라이드에 희석 된 프로브 혼합물의 약 10 마이크로 리터. 각 커버 슬립 셀 면을 각각의 혼성화 믹스 액적에 놓습니다.자유로운 양의 고무 시멘트를 사용하여 각 커버의 가장자리와 뒷면을 슬라이드로 밀봉합니다. 열 블록의 평평한 쪽에 슬라이드를 설정하고 3 분 동안 섭씨 94도로 가열합니다. 그 후 슬라이드를 가습 챔버로 옮기고 하룻밤 사이에 섭씨 45도에서 배양하십시오.다음 날, 조심스럽게 고무 시멘트를 벗겨 집게를 사용합니다. 커버 슬립 셀 측을 24 웰 플레이트의 우물에 올려 놓고 실온에서 프로브 워시 버퍼로 세 번 씻습니다. 커버 슬립을 포함하는 각 웰에 200 마이크로리터의 증폭 버퍼를 추가하고 실온에서 30~60분 동안 배양합니다.한편, 각각 90초 동안 섭씨 94도로 가열한 다음 30분 동안 실온으로 냉각하여 별도의 PCR 튜브에서 프로브를 인식하는 올리고뉴클레오티드 헤어핀두 개 각각을 음침합니다. 1:50의 희석에 증폭 버퍼에 함께 머리핀을 혼합. 다음으로, 12웰 플레이트 뚜껑의 열린 면 위에 파라핀 필름을 스트레치하여 증폭 반응을 위한 표면을 만듭니다.각 커버 슬립에 대한 파라핀 필름에 헤어핀 혼합물의 파이펫 50-100 마이크로리터 방울. 집게를 사용하여, 조심스럽게 사전 증폭 용액에서 각 커버 슬립을 제거하고 건조 다공성 일회용 닦아에 가장자리를 터치. 각 말린 커버 슬립 셀 면을 증폭 액적에 놓습니다.플레이트 뚜껑을 가습 챔버로 옮기고 실온과 어둠 속에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 24 웰 플레이트의 우물에 커버 슬립을 반환합니다. 각 웰에 밀리리터 당 0.5 마이크로그램의 농도로 DAPI를 포함하는 5X SSCT를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.그 후 실온에서 5X SSCT로 샘플을 두 번 세척합니다. 세척된 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 장착하고 반전된 형광 현미경을 사용하여 세포를 분석하고 샘플을 이미지화합니다. 이 연구에서는, 인간 진피 섬유아세포의 거의 균질한 인구는 고립됩니다.면역형성 염색은 고립된 인간 진피 세포의 거의 100%가 진피 섬유아세포 마커, 바이멘틴 및 콜라겐을 위해 긍정적으로 염색되지만 인간의 포피 케나티노사이클 마커 K14에 대해 부정적임을 보여준다. MCPyV virions는 그 때 생성된 후에 그라데이션의 코어에 집중된 MCPyV virions의 밴드를 시각화한 후에, 500 마이크로리터 분획이 수집되고 MCPyV qPCR은 피크 분획을 식별하기 위하여 수행됩니다. MCPyV에 감염된 HDFs의 면역형염색 이미지는 여기에 표시되며, LT 양성, VP1 양성 또는 LT 및 VP1 양성 세포가 MCPyV 감염에 대해 양성으로 간주됩니다.셀의 30% 이상이 LT 양성이며 10% 이상은 VP1 양성입니다. 감염된 세포에서 복제된 MCPyV 게놈은 HCR DNA 물고기와 면역형광-HCR DNA FISH를 사용하여 검출됩니다. HCR-DNA FISH는 복제 공장에서 존재하는 MCPyV DNA의 현지화를 드러내지만, 면역형광-HCR-DNA FISH 방법은 복제 센터에서 MCPyV DNA와 LT 단백질의 동시 검출을 허용합니다.최고의 바이러스 감염 효율을 달성하기 위해, MCPyV는 요오독사놀이 세포에 독성이기 때문에 마이크로리터 당 적어도 2 x 10 ~ 8번째 바이러스 게놈에 집중되는 것이 매우 중요합니다. 진피 섬유아세포의 MCPyV 감염에 이어 면역형광, 면역 차단, 면역포지시비케이션 및 qPCR 기반 분석등을 포함한 많은 분자 생물학적 분석이 수행될 수 있다. 우리가 설명한 감염 시스템은 연구원이 핵 밀매 및 바이러스 성 포장 같이 MCPyV 감염의 단계를 공부하는 가능하게 합니다.MCPyV는 BSL-2 바이러스입니다, 그러나 실험실 조정에서 달성된 양에 있는 병리학을 위한 그것의 잠재력에 관하여 거의 알려져 있습니다. 따라서, 연구원은 바이러스에 노출을 피하기 위해 예방 조치를 취해야 한다.

merkel-cell-polyomavirus-infection-and-detection

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

숙주 세포 요인은 설치 및 Kaposi의 육종 (KS)의 유지에 중요한 역할을한다. 우리는 KSHV에 감염된 DMVEC 전지 변경 숙주 세포 요소를 식별하는 방법을 설명하고, KS 종양 조직 인치 바이러스에 의해 변경 세포 유전자 소설 치료제에 대한 잠재적인 대상 (S) 역할을합니다.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

이 비디오에서는 MCPyV 비리온에 감염된 세포를 현장 혼성화 연쇄 반응을 통해 MCPyV 특이적 게놈을 검출했습니다. 또한 DNA-HCR 기술을 FISH와 결합하여 감염된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 시각화했습니다.

HCR-DNA FISH: 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 검출하기 위한 형광 현장 혼성화 기술

이 비디오에서는 273TT 세포를 사용하여 메르켈 세포 폴리오마바이러스 또는 MCPyV 비리온을 제조하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 재조합 MCPyV 비리온의 고역가를 생성하는 데 도움이 됩니다.

재조합 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCPyV) 비리온 제제: 고역가 재조합 MCPyV 비리온을 생산하는 기술

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

이 동영상은 거대세포바이러스(HCMV)의 중화를 측정하기 위해 고안된 면역형광 분석을 보여줍니다. 바이러스 특이적 항체는 바이러스와 혼합되어 인간 섬유아세포 세포와 함께 배양됩니다. 항체는 바이러스를 중화하여 숙주 세포를 감염시킬 수 없게 만드는 반면, 중화되지 않은 바이러스는 세포를 감염시킵니다. 배양 후, 중화 정도는 면역형광을 사용하여 바이러스에 감염된 세포를 정량화하여 결정됩니다.

인간 거대세포바이러스의 중화를 측정하기 위한 면역형광 방법

이 프로토콜은 포르말린이 고정된 파라핀 내장 생검 조직에서 거대세포바이러스의 qPCR 검출을 설명하며, 이는 빠르고 민감하며 특이적이며 모호한 헤마톡실린 및 에오신 또는 면역조직화학적 염색 패턴을 해석하는 데 유용합니다.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

피부는 인간 병원체인 단순 헤르페스 바이러스 1형(HSV-1)의 표적 조직 중 하나입니다. HSV-1의 조직 침입 경로를 조사하기 위해 피부의 가장 바깥쪽 층을 나타내는 쥐 표피 시트의 생체 외 감염 모델을 구축했습니다.

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

이 원고에서, 프로토콜은 tdTomato 및 eGFP를 발현하는 양방향 리포터 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 이용하여 BK-폴리오마바이러스 전사 활성의 FACS 기반 측정을 수행하기 위해 제시된다. 이 방법은 바이러스 전사에 대한 신규 화합물의 영향을 정량적으로 결정할 수 있게 한다.

유세포측정을 통한 BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

이 프로토콜은 phorbol 12-myristate 13-아세테이트로 바이러스 용해 주기를 유도할 때 인간 P3HR1 세포주에서 Epstein-Barr 바이러스 입자의 분리를 허용합니다. 이어서 바이러스 제제에서 DNA를 추출하고 실시간 PCR을 수행하여 바이러스 입자 농도를 정량화합니다.

P3HR1 세포주에서 엡스타인-바 바이러스의 분리 및 정량화

배우세요 인간 진피 섬유아세포에서 Merkel Cell Polyomavirus 감염 및 탐지 방법을. 면역형광 염색과 형광 원위교잡법을 활용하여 바이러스 단백질과 DNA를 시각화하고 MCPyV 감염 주기를 연구할 수 있습니다.

메르켈 세포 폴리오 감염 및 탐지

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