Name: 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 배우세요 마우스 신생아 심근세포에서 산소 소비율을 분석하는 방법을 익히세요. 세포 외 유출 분석기를 활용한 이 기법은 심장 대사 및 미토콘드리아 기능 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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우리는 모든 로스 연구소 및 머피 연구소 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 미국 심 혼 협회 (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806)와 R.S.R. 버지니아 가치 (BX003260)에 의해 지원

신생아 쥐와 작품에 대 한 동물 보호 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학/연구소 지침 설정을 참조 하 고 하나의 기관 및 다른 적절 한 규정을 준수 하십시오. 이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)을 승인 하 고 연방 및 주 규정 준수.
1입니다. 시 약의 준비
<ol><li>25 mL 사전 소화 솔루션의 준비: (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 HBSS trypsin (0.5 mg/mL)와 보충. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. 실험 당일 사전 소화 솔루션을 확인 합니다. 참고: 그것 없이 캘리포니아2 + HBSS를 사용 하 여 중요 한 이며, Mg2 +, 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + myocyte 수축과 격리 중 후속 세포 죽음을 발생 합니다.</li>
	<li>30 mL 콜라 소화 버퍼의 준비: 콜라 (0.8 mg/mL, 약 350 U/mL) (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 HBSS 버퍼에 녹아. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. 실험의 하루에 콜라 소화 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>500 mL cardiomyocyte 문화 미디어 (성장 매체)의 준비: DMEM의 375 mL, M-199의 125 mL, 말 혈 청의 25 mL 및 FBS의 12.5 mL를 혼합. 1% 페니실린과 1% 스 솔루션으로 보충.</li>
	<li>미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 매체준비: DMEM의 게 200 mL 1 m m 나트륨 pyruvate, 2 m L-글루타민, m 그리고 10 mM 포도 당와 2 mM Hepes 보충 스트레스 테스트 매체 (DMEM NaHCO3, 없이 재료의 표참조)를 기반으로. 참고: DMEM 매체의 1 L 나트륨 pyruvate, L-글루타민, 포도 당, Hepes, 살 균, 필터 없이 만들고 4 ° C에 저장 다른 시 약을 추가 하 여 분석 결과의 날에 스트레스 테스트 매체를 준비 합니다. DMEM을 사용 하 여 매체 NaHCO3 없이 중요 합니다.</li>
	<li>사용 당일 7.4 미토 콘 드 리아 스트레스 테스트 미디어의 pH를 조정 합니다. 37 ° c 사용 하기 전에 따뜻한 미디어입니다.</li>
	<li>Oligomycin준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>FCCP준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>준비 antimycin A: DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL을 준비, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장</li>
	<li>로 테 논준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장 참고: 모든 시 약 및 솔루션이이 프로토콜에 사용 되는 표 1에 나열 됩니다.</li>
</ol>2. 수확 및 신생아 쥐 (주 1)에서 하트의 사전 소화
<ol><li>오토 클레이 브가 위, 집게, 그리고 소독 모리아 숟가락.</li>
	<li>불 임에 대 한 셀 문화 후드에 있는 모든 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>6 잘 셀 문화 접시;의 각 잘 HBSS (없이 캘리포니아2 +, 마그네슘2 +)의 aliquot 5 mL 얼음에 놓습니다. Aliquot 10 mL HBSS 10 cm 세포 배양 접시에.</li>
	<li>20 mL 50 mL의 멸 균 원뿔 튜브에 트립 신 소화 전 솔루션의 준비. 얼음에 모든 솔루션을 유지.</li>
	<li>신속 하 게 신생아 (0 일) 쥐 살 균을 위한 70% 에탄올 용액에 담근 다.</li>
	<li>(똑바로) 마 취 없이 무 균가 위를 사용 하 여 새끼를 목을 벨 한 다음 흉 강 심장에 대 한 액세스를 허용 하도록 흉 골을 따라 가슴을 엽니다. (그림 1A) 참고: 1) P0 신생아 쥐를 사용 하 여 높은 세포 생존 능력을 달성 하는 것이 중요. 2)이 안락사 메서드는 NIH와 미국 수의 의학 협회 지침 17에 따라 신생아에 대 한 허용 됩니다.</li>
	<li>좋은 위와 HBSS (캘리포니아2 +, 마그네슘2 +) 없이 포함 된 살 균 세포 문화 접시에 즉시 전송 몸에서 마음을 추출 (그림 1B).</li>
	<li>모든 잔여 폐 조직, 큰 혈관 등 을 제거 (및 심 방, 원하는 경우). 부드러운 동요를 사용 하 여 HBSS 솔루션에 마음을 씻으십시오.</li>
	<li>각 심장 좋은 위 8 조각으로 잘라내어 HBSS (그림 1C 및 1d)와 6-잘 셀 문화 판의 한 잘에 집게와 모든 심 혼 직물을 전송.</li>
	<li>HBSS, 모리아 숟가락 (그림 1D)를 사용 하 여 가득 6 잘 플레이트에 마음 잘에서 우물을 전송 하 여 마음을 씻어. 참고: 전송 마음 잘에서 잘 하는 것은 피를 충분 하다. 혈액 효소 소화를 방해 하는 때문에, 그것은 HBSS로 마음을 세척 하 고 혈액을 제거 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>트립 신 (0.5 mg/mL) 20 mL를 포함 하는 원뿔 관으로 모리아 스푼으로 마음을 전송 및 4 ° C에서 4 h (그림 1E)에 대 한 부드러운 동요와 함께 품 어.</li>
</ol>3. 준비 96 잘 문화 접시 (1 일)
<ol><li>코팅 액의 5 mL을 준비: PBS 0.5% 젤라틴 (압력솥 사용 하기 전에) 및 1 %fibronectin 솔루션 포함. (예: 5 mL 젤라틴 솔루션 플러스 fibronectin 솔루션의 50 µ L)</li>
	<li>96-잘 셀 문화 플레이트의 각 음에 코팅 솔루션의 aliquot 50 µ L ( 재료의 표참조). 거품이 있으면, 거품 밖으로 빨 아 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 그들을 제거 합니다. 참고: 그것은 각 잘 코팅 솔루션의 모든 표면 영역을 커버 해야 합니다.</li>
	<li>매트릭스 코팅의 건조 수 있도록 1 시간 이상 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에 접시를 품 어.</li>
	<li>Cardiomyocytes 뿌리기 전에 어떤 잔여 코팅 솔루션을 발음.</li>
</ol>4. 효소 소화와 세포 (주 1)의 도금
<ol><li>전 콜라 소화 솔루션 37 ° C 물 욕조에 따뜻한. 참고: 이 효율적인 효소 소화를 달성 하기 위해 중요 한 단계입니다.</li>
	<li>마음과 셀 문화 후드에 4 ° C에서 사전 소화 솔루션을 포함 하는 원뿔 튜브를 이동 합니다. (그림 1 층)</li>
	<li>마음은 튜브의 맨 아래에 침 몰과 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 사전 소화 솔루션 제거 (절연 매체의 1 ~ 2 mL는 튜브에는 남아 있을 수 있습니다).</li>
	<li>튜브에 HBSS의 10 mL를 추가 합니다. 다시 일시 중단 HBSS는 마음 2-3 회 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 트립 신에 밖으로 씻어. HBSS 발음 (1 ~ 2 mL는 튜브에는 남아 있을 수 있습니다).</li>
	<li>마음으로 튜브에 미리 데워 진된 콜라 소화 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. (그림 1G)</li>
	<li>마음이 동요 하지 않고 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어 (1 소화).</li>
	<li>1 소화 후 셀 문화 후드에 튜브를 이동 합니다. 부드럽게 다시 부드럽게 10 번 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 튜브 내 마음을 일시 중단 하 여 마음을 triturate. 이 분산 마음과 심장 조직에서 나올 셀 수 있게 됩니다. (그림 1 H) 참고: Cardiomyocytes 깨지기 때문에, 부드러운 분쇄는 높은 생존 능력을 달성 해야 합니다.</li>
	<li>소화 되지 않은 조직 싱크대, cardiomyocytes (약 9-10 mL) 새로운 원뿔 관에 농축 소화 솔루션 전송 및 즉시 콜라 소화 중지를 세포 배양의 동일한 금액을 추가 하자.</li>
	<li>나머지 소화 되지 않은 심 혼 직물을 포함 하는 관으로 콜라 소화 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 심 혼 직물의 튜브를 품 어 (2 소화).</li>
	<li>4.7-4.8 절차를 반복 합니다. 참고: 여전히 훨씬 소화 되지 않은 조직의 경우, 소화 한 번 더 반복 합니다. 그러나, 대부분의 경우, 두 개의 소화 심장 조직에서 세포의 대부분을 분산에 충분 하다.</li>
	<li>새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 멸 균 셀-스 트레이너 (100 µ m 나일론 메쉬)를 배치 합니다. 세포 배양의 2-3 mL와 함께 셀 스 트레이너를 미리 젖은 고 셀 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 세포 배양의 2-3 mL와 함께 셀 여과기를 헹 구 십시오. (그림 1I)</li>
	<li>Cardiomyocytes 180 x g (그림 1J)에서 5 분을 포함 하는 원뿔 튜브 원심 세포 조직 파편을 포함 하 고 다시 세포 배양 (그림 1 L) 10 mL에 셀 펠 릿을 중단 것입니다 (그림 1 K), 상쾌한 발음</li>
	<li>부드럽게 resuspend 셀과 10 cm 세포 문화 접시 (플라스틱 코팅의 어떤 유형도 없이)에 판 셀 및 셀 문화 인큐베이터 (1 사전 도금)에서 1 시간에 대 한 품 어 (그림 1 M). 이 중 도금 단계 비-cardiomyocytes, 섬유 아 세포와 내 피 세포, uncoated 세포 배양 접시에 같은 수 있습니다. 참고: 이 시점에서, cardiomyocytes는 일반적으로 둥근 모양 나타나고 현미경 빛나는 있습니다. (그림 1N)입니다.</li>
	<li>1 h 부 화 후 부드럽게 접시 선동, 세척 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes에 농축) 10 cm 배양 접시에서 하 고 다시 반복 해 서 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 접시에 세포 배양 매체를 pipetting으로 셀을 일시 중단. 다음, 새로운 10 cm 세포 문화 접시 (어떤 코팅 없이 플라스틱)에 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes에 농축)을 전송 하 고 셀 문화 인큐베이터 (2 중 도금)에 추가 1 h에 대 한 품 어. 참고: 비 코팅 판에 연결 된 셀은 대부분 비 cardiomyocytes: 섬유 아 세포와 내 피 세포를 현미경 (그림 1O) 구상 될 수 있다.</li>
	<li>2 중 도금, 부드럽게 접시 선동, 10 cm 배양 접시에서 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes)을 씻어 후는 cardiomyocytes 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 전송 합니다.</li>
</ol>5. 셀과 셀 셀 96 잘 문화 접시 (1 일)으로 도금
<ol><li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>셀 밀도 103 셀/잘 200 µ L (그림 1 P)의 마지막 볼륨에 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 x 10-30 사이 기질 코팅 96 잘 셀 문화 접시에 접시. 배경에 대 한 웰 스 A1, A12, H1, 및 H12 사용:이 웰 스 (셀)에 다른 우물으로 문화 매체의 200 µ L를 추가. 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에 접시를 품 어. 참고: 이 연구에서는 산소 소비는 10 x 103, 20 x 103또는 30 x 103 셀/잘 같은 다른 셀 밀도 사용 하 여 시험 되었다. (그림 2A)입니다. 또한, 위의 절연 직후 cardiomyocytes는 일반적으로 둥근 모양 나타나고 현미경 빛나는 있습니다. 실행 가능한 세포 문화 16-24 h 이내 밖으로 평평 것입니다.</li>
</ol>6. 산소 소비 분석 결과 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기 (주 2)를 사용 하 여
참고: 산소 소비 분석 결과 셀 도금 후에 1 일 실시 될 수 있습니다 이상. 신생아 cardiomyocytes 교양이 프로토콜 최대 7 일 이내에 살아남을 수 있는 사용 하 여 격리 게시.
<ol><li>플럭스 분석기 센서 카트리지 수 화 ( 재료의 표참조) 적어도 3 시간 동안, 하지만 이상적으로 분석 결과 전에 하루 종일. Calibrant 솔루션의 200 µ L를 추가 유틸리티 플레이트의 각 우물에 넣어 센서 카트리지 다시 유틸리티 접시에 ( 재료의 표참조)와 CO2 또는 O2 보충 없이 37 ° C 배양 기에서 품 어.</li>
	<li>한 시간 분석 결과 전에 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 중간에 세포 배양을 변경 합니다. Cardiomyocytes는 약 합니다. 따라서, 부드럽게 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 미디어를 제거 하 고 미리 따뜻하게 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 미디어의 200 µ L 셀을 두 번 세척. 두 번째 세척 후 미리 따뜻하게 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 미디어의 175 µ L을 추가 하 고 37 ° C 배양 기 CO2 또는 O2 보충 없이 셀 문화.</li>
	<li>집중된 테스트 화합물을 준비 합니다. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트, 3.0 mL 각 16 µ M oligomycin, 9 µ M FCCP, 그리고 20 µ M로 테 논 및 20 µ M antimycin, 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 중간에 모두의 혼합을 준비 합니다. 참고: 각 화합물 농도 설명에서 테스트 되었습니다. 그러나, 자신의 실험실에서 각 화합물의 농도 titrating 필요 하다.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫 (그림 1 분기)를 사용 하 여 센서 카트리지의 인젝터 포트를 각 화합물의 25 µ L를 로드 합니다. 볼륨 및 최종 농도 표 2에 설명 되어 있습니다.</li>
	<li>세포 외 유출 분석 결과 프로토콜을 설정 합니다. 프로그램에서 설명 하는 표 3.
</li>
	<li>프로그램을 시작 합니다. 첫째, 캘리브레이션 (그림 1R) 용 기계로 센서 카트리지를 넣어. 교정 단계 완료 되 면 시험 접시에 대 한 calibrant를 교체 합니다. 참고: 제조업체에서 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여, 우물과 각 화합물의 그룹 및 포트를 나타냅니다.</li>
	<li>원하는 경우, 분석 결과, 후 신중 하 게 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 모든 분석 결과 매체를 삭제 하 고 셀 문화 microplate 단백질 분석 결과 사용 하 여 미래의 셀 정규화-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>단백질 함량을 측정 합니다. 50 µ L 표준 RIPA 세포 세포의 용 해 솔루션의 추가 ( 재료의 표참조). 완전 세포를 lyse을 30 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어. 새로운 투명 플랫 바닥 96 잘 시험 접시에 모든 자료를 전송 합니다.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 분석 결과 BCA 단백질 농도 측정. 참고: 기질과 잘 코팅 각 잘에서 높은 단백질 농도에서 발생 합니다. 따라서, 실제 세포 단백질 농도를 배경 well(s) (셀)의 금액을 뺍니다. 셀에서 파생 된 단백질 농도 96 잘 문화 접시에서 낮습니다. 또한, 단백질 농도 잘 기질 코팅으로 인해 우물에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 셀 번호를 사용 하 여 OCR을 정상화 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 연구에서 우리는 분리 하 고 마우스 신생아 cardiomyocytes 경작에 대 한 간단한 프로토콜을 설립 했다. 사용 하 여 이러한 cardiomyocytes, 우리는 또한 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용 하 여 산소 소비 속도 측정 하는 조건을 최적화. 프로토콜을 사용 하 여 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 얼마나 다양 한 요인이 그대로 기관 측정 될 것 이다 가까운 심장의 주 작업 세포에 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 있습니다. 우리의 프로토콜은 이전에 게시 프로토콜16,18에 다릅니다. 첫째, 높은 생존 능력을 달성 하기 위해 출생 시 즉시만 새끼는 다른 프로토콜16,19에 일반적으로 사용 되는 나이 (P3에 P0 새끼), 3 일 일 0에서에서 사람 대신 (예: P0)를 사용...

지속적인 심장 수축 기능을 하려면 cardiomyocytes ATP1의 형태로 주로 세포 에너지의 지속적인 공급을 유지 해야 합니다. 에, ATP의 대략 95%는 미토 콘 드리 아 중요 한 역할 bioenergetic 심장 기능2,3에서 보여주는 산화 인 산화를 통해 주로 미토 콘 드리 아에 의해 생성 됩니다. 그는이 개념을 지 원하는 미토 콘 드 리아 기능의 dysregulation 심근과 심장 마비4,5이어질 수 있습니다. 반대로, 미토 콘 드리 아 기능을 복원 표시 되었습니다 실패의 심장 기능을 개선 하기 위해6,7심장. 따라서 미토 콘 드리 아 생체의 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능 cardiomyocytes에의 소설 레 귤 레이 터를 식별만 심장 에너지 생산의 기계 론 적인 통찰력을 공개 하지 않습니다 하지만 또한 이어질 것입니다 통찰력을 제공할 수 있습니다. 심장 질환6,8치료에 새로운 치료 목표의 개발.
온 마음에 비해, 매우 순수 하 고, 섬유 아 세포와 내 피 세포10같은 마음에서 비 myocytes의 최소한의 오염 있습니다 myocytes 및 비 myocytes9, cardiomyocyte 문화의 혼합물을 포함 하. 또한, 신생아 강아지에서 cardiomyocytes 격리 성인 마음10,11에서 고립 세포에 비해 시간의 작은 금액에 많은 수의 셀을 배양 수 있습니다. 가장 중요 한 것은, 기본 교양된 성인 마우스 cardiomyocytes 짧은 생존 시간 (예: 24 시간)와 장시간에 포인트 드 차별화. 신생아 마우스 cardiomyocytes 살아남을 수 그리고 문화, cardiomyocytes10마약 화합물 및 미토 콘 드리 아의 기능에 유전자 조작의 효과 테스트에 이상적에 7 일 이상에 대 한 조작. 물론, 성인 및 신생아 셀 사이의 중요 한 생물 학적 차이가 있다 하지만 미토 콘 드 리아 기능 포함 하는 연구의 다양 한 종류에 대 한 적절 한 게 신생아 셀의 문화에 대 한 사용할 수 있는 더 긴 기간.
날짜 하려면, 기본 교양된 신생아 마우스와 쥐 cardiomyocytes 심장 생체12,13연구 모델로 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 연구 산소 소비 속도 (OCR)을 측정 하 고 쥐와 쥐 신생아 cardiomyocytes14,15산화 용량을 평가 하는 세포 외 유출 분석기를 사용 합니다. 쥐에 비해, 하는 동안 마우스 신생아 cardiomyocytes의 세포 생존 능력 낮은 이며 더 큰 다양성16했다. 또한, 유전자 조작된 마우스 모델에서 세포를 공부 하는 능력 만드는 마우스 셀 모델 매우 중요 하다. 감안할 때 그 OCR 연구 세포 수 및 밀도 뿌리기에 너무 민감합니다, 일관 된 셀 생산량 및 생존 능력 달성을 재현 하 고 신뢰할 수 있는, 간단한 프로토콜의 개발이 필요 합니다.
여기, 우리는 최적화 된 프로토콜 개발 된 OCR 분석에 대 한 교양된 마우스 신생아 cardiomyocytes 함께 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 보고 합니다. 이 프로토콜은 매우 분석 결과의 재현성을 증가 한다. 또한, 프로토콜 소설 및 OCR 분석, 재현 방법 제공 뿐만 아니라 또한 필요한 myofibrillar 기능을 공부 하 고 세포내 있을 수 있습니다 같은 다른 실험적인 목적을 위한 큰 크기 문화에 적응 될 수 있습니다. 신호 경로.
특히,이 프로토콜 고립과 96 잘 셀 문화 접시에 신생아 마우스 cardiomyocytes의 문화에 대 한 일 절차를 설명합니다. 또한, 그것은 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 절차를 설명 합니다. 모든 솔루션에 사용 되는 살 균 또는 살 균 필터링. 모든 도구는 75% 에탄올에 의해 살 균. 우리는 절차의 다양 한 부분에 대 한 테이블의 자료 를 제공합니다. Cardiomyocytes 경작에 대 한 모든 절차 및 단계는 표준 셀 문화 후드에서 수행 됩니다. 이 프로토콜은 신생아 마우스 마음 한 쓰레기 (약 8-10 새끼)에서 격리에 대 한 개발. 그러나, 프로토콜 또한 cardiomyocytes 여러 담가에서 분리 하는 데 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>안티마이신 A</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td>는 미토콘드리아 세포 여과기 100 &mu<td>의 복합체 III을 억제합니다</td></tr><tr><td>. m 모공</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>소화되지 않은 조직을 포착하기 위해</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>콜라겐 분해 효소 분해 용액을 만들려면</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SIGMA</td><td>75351</td><td>미토 코드드 스트레스 테스트 매체를 만들려면</td></tr><tr><td>DMEM 고 포도당</td><td>Life technologies</td><td>11965-092</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>를 만들려면NaHCO3, 포도당, 피루브산, 글루마닌 및 헤페가 없는 DMEM</td><td>SIGMA</td><td>D5030-10X1L</td><td>미토코드드리아 스트레스 테스트 매체</td></tr><tr><td>FCCP(카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존)</td><td>를</td> 만들기 위해SIGMA <td>C2920</td><td>미토콘드리아 호흡</td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td>을 분리하려면<td>생명 기술</td><td>26140-079</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>피브로넥틴을 만들기 위해 소 플라즈마</td><td>SIGMA</td><td>F1141-5MG</td><td>조직 배양 플레이트용 코팅 용액 만들기 위해</td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질에서 젤라틴</td> 심장 해부용 <td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>조직 배양 플레이트용 코팅 용액 만들기 위해</td></tr><tr><td>HBSS(Hank의 균형 잡힌 소금 용액, Ca2+, Mg2+ 없음)</td><td>Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>심장을 씻고 사전 소화 및 콜라 그내 소화 용액을 만들기 위해</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Fisher scientific</td><td>15630080</td><td>미토 코드리아 스트레스 테스트 배지를 만들기 위해</td></tr><tr><td>말 혈청</td><td>Life technologies</td><td>26050-088</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>SIGMA</td><td>G-3126</td>을 만들기 <td>위해 미토 코드리아 스트레스 테스트 배지</td></tr><tr><td>M-199</td><td>를 만들기 위해Cellgro</td><td>10-060-CV</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>Moria 스푼 Fisher</td><td>과학</td><td>NC9190356</td><td>마음을 씻기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>올리고마이신</td><td>SIGMA</td><td>75351-5MG</td><td>미토콘드리아 ATP 합성효소</td></tr><tr><td>RIPA 완충제</td> 억제 <td>Fisher scientific</td><td>89900</td><td>단백질 분석을 위해 세포를 용해</td></tr><tr><td>로테논</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>미토콘드리아의 복합체 I 억제</td></tr><tr><td>해마 XFe96 세포 외 플럭스 분석기</td><td>산소 소비율</td><td></td> 분석에 사용되는 애질런트 <td></td> 장치</tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>플럭스 분석기 배양 플레이트, 센서 카트리지 및 캘리브런트 패키지</td></tr><tr><td>소듐 피루브산</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>미토코드드리아 스트레스 테스트 매체를 만들기 위해</td></tr><tr><td>직선 가위</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>91401-12</td><td>심장 해부용</td></tr><tr><td>주사기 필터 0.2 &mu; m 크기</td><td></td><td></td><td>소화 매체의 멸균 여과 용</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>USB Corporation</td><td>22715-25GM</td><td>사전 소화 용액을 만들기 위해</td></tr></tbody></table>

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

미토 콘 드리 아 및 산화 대사는 심장 근육 기능을 유지 하기 위한 중요 합니다. 연구는 미토 콘 드 리아 기능 장애는 심장 마비에서 장애인된 심장 기능에 중요 한 기여 요인으로 나타났습니다. 대조적으로, 결함이 있는 미토 콘 드리 아 기능을 복원 하는 것은 실패에 심장 기능을 개선 하기 위해 유익한 효과 있을 수 있습니다. 따라서 규제 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능에 대 한 새로운 레 귤 레이 터를 식별 심장 질환 치료를 위한 새로운 치료 목표를 개발 하는 데 사용할 수 있는 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, 심장 myocyte 미토 콘 드리 아 호흡 독특한 셀 문화 시스템을 사용 하 여 분석 된다. 첫째, 프로토콜은 신속 하 게 격리 하 고 높은 생존 신생아 마우스 cardiomyocytes 문화 최적화 되었습니다. 다음, 96-잘 포맷 세포 외 유출 분석기는 이러한 cardiomyocytes의 산소 소비 속도 평가 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 우리 시드 조건을 최적화 하 고 그 신생아 마우스 cardiomyocytes 산소 소비 속도 세포 외 유출 분석기에서 쉽게 평가 될 수 있다 설명 했다. 마지막으로, 우리는 우리의 프로토콜 큰 문화 크기에 적용할 수 및 다른 연구, 세포내 신호 등 및 수축 성 기능 분석 주의.

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 마음 하루 0 신생아 강아지에서 격리 했다. 5 x 105 셀/강아지 가져온, 그리고 cardiomyocytes 10 x 103, 20 x 103또는 잘/30 x 103 셀, 96 잘 접시 (그림 2A)에서 밀도에 씨를 뿌리고 있었다. 야간 문화, 후 cardiomyocytes 발견 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착 된 거의 연결 되지 않은 셀 (첨부 되지 않은 셀 계속 나타납니다으로 라운드 하 고 반짝이, spreadout는 건강 하 고, 연결 된 셀에 비해) 있었다 ( 그림 2A 그리고 B)입니다. 이 시점에서, 자발적 계약 cardiomyocytes 쉽게 볼 수 있었다. 30 x 103 셀/잘 시드 밀도...

이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

이 프로토콜은 마우스 심근세포에만 알려진 높은 이중 BBT를 분리하고 배양할 수 있게 합니다. 미토콘드리아 기능을 평가하기 위해 심근세포의 산소 소비율은 실제 은 플럭스 분석기로 분석될 수 있다. 이 기술의 장점 중 하나는 심근세포의 산소 소비가 96웰 형식으로 그들의 부착 상태에서 쉽게 측정될 수 있다는 것입니다, 이는 많은 수의 복제와 함께 여러 조건의 테스트를 가능하게 합니다.이 혈관은 심장학의 연구 영역에 중요한 통찰력을 제공합니다. 산소 소비 이외에, 우리는 또한 다른 신진 대사 매개 변수를 연구할 수 있습니다., 그레이 그리스와 과산 편산화 등. 심근 세포의 높은 가변성을 달성하는 것은이 실험에 대 한 중요 한.이를 위해서는 마음의 효율적인 소화가 필요합니다. 신생아 심근세포는 매우 깨지기 때문에 심근세포의 부드러운 취급도 중요합니다. 세포 배양 후드에서, 6웰 세포 배양 판의 각 웰에 HBSS의 알리쿼트 5ml를 알리쿼트하고 얼음에 놓습니다.또한, 10cm 세포 배양 접시에 HBSS 10ml를 알리쿼트한 다음, 50ml멸균 원추형 튜브에 트립신 전소화식 용액 20ml를 준비한다. 모든 솔루션을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 심혼을 추출하고 HBSS를 포함하는 멸균 세포 배양 접시로 즉시 이송한다.잔류 폐 조직과 더 큰 혈관을 제거하십시오. 부드러운 동요를 사용하여 HBSS에서 심장을 씻으시면 됩니다. 그 후, 미세 한 가위로 심혼을 8개로 자르고, HBSS를 가진 6웰 세포 배양 판의 한 우물로 집게로 심장 조직을 전송합니다.모리아 숟가락을 사용하여 HBSS로 채워진 6 웰 플레이트에서 잘 전달하여 심장 조직을 씻어 내보도록 하십시오. 그런 다음 심장 조직을 트립신 20ml를 포함하는 원추형 튜브로 옮기고 4 시간 동안 섭씨 4도에서 부드러운 교반으로 배양하십시오. 이 절차에서 콜라게나아제 소화 용액을 섭씨 37도에서 수조에 미리 데우겠습니다.심장 조직과 소화 전 용액을 함유 한 원적 튜브를 섭씨 4도에서 세포 배양 후드로 옮는다. 심장 조직이 튜브의 바닥에 가라 앉게하고 10ml 세로지 피펫을 사용하여 소화 전 용액을 제거하십시오. 다음으로, 튜브에 10ml의 HBSS를 추가합니다.10ml 세로지피펫을 사용하여 트립신을 씻어 내기 위해 HBSS2 에서 3 번 심장 조직을 다시 중단합니다. HBSS를 흡인하고 심장 조직으로 튜브에 미리 따뜻해지는 콜라게나아제 소화 용액 10ml를 추가합니다. 첫 번째 소화를 위해, 동요없이 10 분 동안 37 섭씨 37도에서 수조에 심장 조직으로 튜브를 배양하십시오.그 후, 튜브를 세포 배양 후드로 이송한다. 10ml 세로지 피펫을 사용하여 10회 부드럽게 다시 페일링하여 조직을 트리투레이합니다. 이것은 심장이 분산하고 세포가 심장 조직에서 풀어 놓일 수 있게 합니다.소화되지 않은 조직이 가라앉도록 하십시오. 심근세포에 농축된 소화된 용액을 새로운 원내 튜브로 옮기고 즉시 동일한 양의 세포 배양 배지를 추가하여 콜라게나아제 소화를 막습니다. 그런 다음 10ml의 콜라게나아제 소화 용액을 나머지 소화되지 않은 심장 조직을 포함하는 튜브에 추가합니다.두 번째 소화를 위해 10 분 동안 37섭씨 수조로 심장 조직으로 튜브를 배양하십시오. 첫 번째 소화의 절차를 반복하고 콜라게나아제 소화를 중지하기 전에 심근 세포에 농축 된 소화 된 용액을 새로운 원적 튜브로 옮춥시다. 다음으로 멸균 세포 스트레이너를 새로운 멸균 50ml 원문 튜브에 놓습니다.세포 배양 배지의 2 ~ 3 ml로 세포 스트레이너를 미리 적시고 세포 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 이어서, 세포 배양 배지로 세포 스트레이너를 헹구는다. 그런 다음, 180배의 중력에서 5분 동안 심근세포가 함유된 원심관을 원심분리합니다.5 분 후, 슈퍼 내수를 흡인하고 세포 배양 배지의 10ml에서 세포 펠릿을 재놓습니다. 세포를 10cm 세포 배양 접시에 접시에 접시를 매고 1 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 부드럽게 접시를 동요.10ml 세로지피펫을 사용하여 접시 위에 세포 배양 배지를 반복적으로 피펫하여 비 부착 세포를 씻어 내고 세포를 재차단합니다. 그런 다음, 비 부착 세포를 새로운 10cm 세포 배양 접시로 옮기고 다른 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 부드럽게 접시를 동요하고 비 부착 세포를 씻어.심근세포는 새로운 50ml 원내 튜브로 옮킨다. 다음으로, 96웰 세포 배양판의 각 웰에 50마이크로리터의 코팅 용액을 알리싱하여 96웰 배양판을 준비한다. 거품이 있는 경우 20 마이크로리터 파이펫을 사용하여 제거합니다.매트릭스 코팅의 건조를 허용하기 위해 적어도 한 시간 동안 37섭씨에서 플레이트를 배양한다. 그런 다음 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포를 초세포 매트릭스로 플레이트하여 96웰 세포 배양판을 웰당 10~30,000개의 밀도로 코팅한다.그리고 인큐베이터에 세포를 배치합니다. 산소 소비 분석을 제거하려면 플럭스 분석기 센서 카트리지를 최소 3시간 동안 수화하고, 200마이크로리터의 교정용액을 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 놓고 CO2 또는 O2 보충 없이 섭씨 37도에 적어도 3시간 동안 배양하십시오.분석 1시간 전에, 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고 전동미토콘드리아 응력 시험 배지의 200 마이크로리터로 세포를 세척한다. 두 번째 세척 후, 미리 따뜻해진 미토콘드리아 응력 테스트 배지의 175 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 이산화탄소 나 산소 보충제없이 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.미토콘드리아 응력 시험 배지에서 각 시험 화합물 3ml를 준비한다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 화합물의 25 마이크로리터를 센서 카트리지의 인젝터 포트에 로드합니다. 세포의 상태 와 모든 전처리는 비커플러 FCCP의 주입에 의해 유도 된 최대 복원에 영향을 미칠 수 있습니다.분리제에 대한 세포 민감도도 변경될 수 있으므로 각 특정 치료에 대해 FCCP의 작업 농도를 최적화하는 것이 중요합니다. 그 후, 여분의 세포 플럭스 분석 프로토콜을 설정하고 프로그램을 시작합니다. 먼저 센서 카테리리지를 장비에 넣어 교정합니다.교정 단계가 완료되면 분석 플레이트의 교정판을 교체하십시오. 원하는 경우, 분석 후, 신중하게 멀티 채널 파이펫을 사용하여 모든 분석 매체를 폐기. 그리고 단백질 분석체를 사용하여 향후 세포 정상화를 위해 세포 배양 미코플레이트를 음수 20도에 저장합니다.설명된 프로토콜을 사용하여, 심혼은 96웰 플레이트에서 웰 당 10, 20 또는 30,000세포의 밀도에서 종자 및 심근세포0일로부터 분리되었다. 하룻밤 배양 후, 심근세포는 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착되어 있고 부착되지 않은 세포가 거의 없었다. 이 시점에서, 자발적으로 수축 심근 세포 쉽게 볼 수 있었다.잘 당 30, 000 세포의 파종 밀도는 세포가 퍼지면서 파종 후 하루 만에 합류를 보였다. 심근세포는 육종 알파 액틴, 심근세포 특이적 마커에 대한 항체로 면역염색되었다. 여기에 도시된 바와 같이, 대부분의 세포는 심근세포 분리의 높은 순도를 나타내는 알파 액틴의 양성 얼룩을 보였다.하나의 전형적인 미토콘드리아 스트레스 테스트의 계획은 여기에 표시됩니다. 미토콘드리아 스트레스 테스트는 산소 소비율의 기본 선 측정으로 시작하여 ATPA를 억제하는 올리고 묘신의 주입에 따른다. 이어서, 분리제 FCCP는 최대 산소 소비속도를 측정하기 위해 주입되었다.마지막으로, 두 개의 전자 수송 복합 억제제의 주입으로, 미토콘드리아 호흡은 완전히 중지하고 OCR은 가장 낮은 수준으로 감소. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면. 높은 생존을 달성하는 것이 중요합니다.따라서 신생아를 사용하고 심근세포에서 심장 조직을 부드럽게 처리하는 것이 중요합니다. 새로운 또는 기존 유전자 조작 마우스 라인을 사용 하 여, 이 방법은 쉽게 심장에 생물 에너지 조절에 대 한 새로운 메커니즘을 이해로 이어질 수 있는 데이터로 번역 될 수 있습니다. 미토콘드리아는 심장 기능에서 중요한 역할을 합니다.우리는 이 방법이 신진대사를 산화하고 심부전 을 치료하기 위한 새로운 치료 목표를 찾는 새로운 규제 기관 및 통로를 식별하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.

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근원:엘레트라 레오1, 루이자 H.D. 카르도소1, 사빈 슈미트1, 에리히 그나이거11오로보로스 악기이 비디오는 산소 플럭스가 살아있는 포유류 세포와 투과화된 포유류 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 다양한 호흡 상태를 특성화하기 위해 디지토닌, 대사 기질, ADP, 언커플러 및 억제제를 순차적으로 사용하는 방법을 보여줍니다. 생성된 산소 플럭스 프로파일은 정의된 조건에서 미토콘드리아 기능과 에너지 결합 효율을 나타냅니다.

살아있는 세포와 투과화된 세포에서 미토콘드리아 호흡을 평가하기 위한 산소 플럭스 측정

해당작용은 여러 생물학적 시스템에서 정의하는 대사 마커입니다. H+의 세포외 플럭스를 측정하여 해당과정을 모니터링하는 것은 일반적이지만, 정량적이고 명확한 보정이 필요합니다. 여기에서는 세포 외 산성화의 호흡기 및 해당작용 원인을 구별하기 위해 세포 외 플럭스 데이터를 수집하고 수정하는 방법을 보여줍니다.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.

실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 생물에너지 모니터링

산소 소비율 (OCR)은 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시이며 다른 질병 모델을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 Seahorse XF 분석기를 사용하여 다른 방법보다 생리 학적으로 관련성이 높은 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다.

성인 마우스의 급성 스트리아탈 슬라이스의 산소 소비율 측정

인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

여기에서는 골수, 비장 및 경색된 심장에서 대식세포를 추출하고 이후에 살아있는 세포의 대사 플럭스를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

비장 및 심장 대식세포와 골수 단핵구의 생체 외 대사 플럭스 분석

우리는 형질막을 선택적으로 투과시키는 프로토콜을 제시하여, 기질과 억제제의 표적 전달을 가능하게 하여 배양된 세포에서 미토콘드리아 산화 인산화(OXPHOS)를 평가하고, 일반적으로 이러한 분석을 방해하는 원형질막 수송 장벽을 극복합니다. 이 기법을 사용하여 우리는 OXPHOS 기능이 무스카린 작용제와 길항제에 의해 어떻게 조절되는지 입증했습니다.

디지토닌 투과화된 BE(2)-C 신경모세포종 세포에서 산화적 인산화 결합의 콜린성 리간드 의존 조절

이 글에서는 성체 제 브라피시 뇌실의 산소 소비율과 세포외 산성화 속도를 정량화하여 산화 및 당분해 대사 능력을 특성화하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

세포외 플럭스 분석법을 이용한 전체 재생 제브라피시 뇌실의 체외 대사 활동 평가

배우세요 마우스 신생아 심근세포에서 산소 소비율을 분석하는 방법을 익히세요. 세포 외 유출 분석기를 활용한 이 기법은 심장 대사 및 미토콘드리아 기능 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

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