합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

이 프로토콜은 PODS의 합성 및 적용을 설명, 단백질과 펩티드의 사이트 특정 바이오 컨저게이션에 대한 새로운 시약. 이 기술은 전통적인 말레니드 티올 기반 바이오 컨쥬션에 비해 현저한 개선을 나타냅니다. 이 절차의 가장 큰 장점은 시약이 이루어지는 단순성입니다.

이 방법을 사용하면 시약을 거의 모든 실험실에서 합성할 수 있습니다. 10 밀리리터 라운드 바텀 플라스크에서 아미노페닐 옥사디아졸 티올100밀리리터를 메탄올 3밀리리터에 녹입니다. 용액에 360 마이크로리터의 이소프로틸레틸레틸라민과 마그네틱 스터드 바를 추가합니다.

고무 스토퍼로 플라스크를 밀봉하고 실온에서 10 분 동안 용액을 저어줍니다. 1밀리리터 유리 주사기를 사용하여 고무 스토퍼를 통해 구멍을 뚫고 32 마이크로리터의 이오도메탄을 혼합물에 빠르게 넣습니다. 혼합물이 실온에서 45분 동안 반응하도록 합니다.

25밀리리터 라운드 바텀 플라스크에서 10밀리리터디클로로메탄의 10밀리리터에 밥 보호 카복실산 387밀리그램을 녹입니다. 용액에 480 마이크로리터디소프로필틸레틸라민, EDCI 264밀리그램, 200밀리그램의 애니라인, 마그네틱 교반바를 추가합니다. 플라스크를 유리 스토퍼로 밀봉하고 실온에서 5일 동안 반응을 저어줍니다.

반응이 완료되면 반응 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고 1-대구염 5밀리리터로 세 번 세척합니다. 유기 상을 수집하고 분리 깔때기로 전송합니다. 그런 다음 탄산 나트륨 1개를 한 다음 물로 유기 상을 씻습니다.

다음으로, 유기 상을 수집하고 물의 흔적을 제거하기 위해 황산 마그네슘을 추가합니다. 그런 다음 중간 유리 프릿을 사용하여 혼합물을 필터링합니다. 회전 증발기를 사용하여, 오프 화이트 고체를 감당하기 위해 감소 된 압력에서 휘발성 용매를 제거합니다.

이에 따라, 에틸 아세테이트의 10 밀리리터에서 고립 된 고체를 재용해. 그런 다음 사이클로헥산 30 밀리리터를 점진적으로 추가하여 제품을 침전시합니다. 중간 유리 프릿을 사용하여 용액을 걸이하여 카바메이트 제품을 백색 분말로 가져옵니다.

10 밀리리터 라운드 바텀 플라스크에서, 디클로로메탄의 4 밀리리터에 카르바메이트의 30 밀리그램을 녹입니다. 천천히 70% m-클로로퍼벤조산49밀리그램과 마그네틱 스터디 바를 혼합물에 넣고, 플라스크를 유리 스토퍼로 밀봉합니다. 실온에서 밤새 저어서 궁극적으로 노란색 혼합물을 생성합니다.

다음 날, 혼합물을 분리 깔때기로 옮기. 그런 다음 혼합물을 0.1-어금니 나트륨 수산화나트륨과 물로 씻어낸다음 물을 씻는다. 유기 상을 수집하고 물의 흔적을 제거하기 위해 황산 마그네슘을 추가합니다.

그런 다음 중간 유리 프릿을 사용하여 혼합물을 필터링합니다. 25 밀리리터 라운드 바텀 플라스크에서, 디클로로메탄의 두 밀리리터에 카르바메이트의 30 밀리그램을 녹입니다. 혼합물에 마그네틱 스터드 바를 추가합니다.

그리고 400 마이크로리터의 트리플루오로아세트산과 플라스크를 유리 스토퍼로 밀봉합니다. 그런 다음 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 저어줍니다. 반응이 완료되면, 회전 증발기를 사용하여 실온에서 압력 저하하에서 휘발성을 제거하여 유성 잔류물을 얻습니다.

기름진 잔류물을 7밀리리터의 물에 녹입니다. 그리고 분리 깔때기로 전송합니다. 에틸 아세테이트 4밀리리터로 수성 용액을 세 번 씻으시다.

1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에서 PODS 10밀리그램과 디메틸 설프리산화물 300마이크로리터를 용해하십시오. 그런 다음 용액에 N- N-diisopropylethylamine의 26 마이크로 리터를 추가합니다. 15.2 밀리그램의 DOTA NCS를 디메틸 설프리산화물 100마이크로리터에 녹이고 솔루션을 PODS 용액과 결합합니다.

마이크로원심분리기 튜브를 밀봉하고, 상온에서 밤새 배양하는 반응을 허용한다. 다음으로, 저단백질 결합 1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 859마이크로리터의 PBS를 장착한 트라스투주맙 스톡 용액의 61마이크로리터를 희석시다. 이 혼합물에, 물에 TCEP의 갓 만든 10 밀리 머 마일로 용액의 6.7 마이크로 리터를 추가합니다.

반응 혼합물에 밀리리터 당 1밀리그램 PODS-DOTA 용액 73마이크로리터를 추가합니다. 마지막으로, 마이크로 센트심분리기 튜브를 밀봉하고 실온에서 2 시간 동안 용액을 배양하십시오. PODS 합성은 견고하고 신뢰할 수 있습니다.

아미노페닐 옥사디아졸 티올의 단백질 제단백질 화및 대체는 정량적 수율로 티오에테르 를 제공했습니다. 티오에테르 1과 boc 보호 카르복실산의 결찰은 55%의 수율로 2개의 화합물을 산출했습니다. 산화는 90%의 수율로 화합물 3을 제공했습니다.

그리고 bocs 보호 그룹의 제거는 98 %의 수익률로 PODS를 산출했다. 각 제품의 ID는 양성자 NMR, 탄소 NMR 및 고해상도 MS를 통해 확인되었습니다. 첼라토르 DOTA의 이소티오야네이트 베어링 변종은 PODS의 펜던트 아민에 결합되어 75%의 수율로 양기능 첼레이터를 획득하였다. 제품의 ID는 양성자 NMR, 탄소 NMR 및 고해상도 MS를 통해 확인되었습니다. PODS-DOTA의 사이트 선택적 생체 경련은 HER2 표적 항체 trastuzumab에 여기에 도시된다.

항체의 힌지 영역의 이황화물 연계는 선택적으로 감소되었고, 항체는 DOTA 베어링 면역conjugate를 80% 수율을 감당하기 위해 PODS-DOTA로 배양되었다. MALDI-TOF 분석은 항체 당 1.8 DOTA의 라벨링 정도를 밝혔다. 이는 인간, 인간화 및 키메라 IgG1 항체의 범위에 걸쳐 일관되게 남아 있습니다.

그러나, 동일한 조건은 뮤린 IgG1 항체에 대해 1.5의 라벨링 정도를 가진 면역콘주게이트를 생성한다. 이 화합물의 빛 감도 로 인해 호일로 덮인 혈관에 있는 모든 반응을 유지하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 제품의 전체 수율이 증가합니다.

이 프로토콜은 PODS-DOTA의 합성을 설명하는 동안, 유사한 절차는 형광, 독소 및 기타 첼레이터를 포함한 광범위한 잠재적 인 화물에 적용 될 수 있습니다. 이 방법은 다양한 분야에서 사용될 수 있는 잘 정의된 균일성 및 매우 안정적인 면역콘주게이트의 시공을 용이하게 할 것이다. 이 실험의 1 단계에 추가 된 요오도메탄은 유해한 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 연기 후드에 사용되어야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.