Name: 평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌와 척수의 초미세구조 신경가소성을 자궁내 유전자 전달과 투과전자현미경으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 선천성 신경퇴행성 질환의 치료적 잠재력을 제공합니다.

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저자는 그들의 지원 및 동물 관리에 대 한 의료 학부, Ruhr 대학 보 훔에 동물 시설의 동료를 감사합니다.

동물 주제에 모든 절차는 함부르크와 노르 트 베스트 팔 렌, 독일의 연방 국가의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.  사용 하 여 살 균 기기, 보호 장갑 및 전체 수술을 통해 무 균 코트.
1.에 Utero 변환
<ol><li>PH 7.4에 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 원하는 대상 (4 x 1011 바이러스 성 입자 / µ L AAV1의)에 대 한 코딩 adeno 관련 바이러스 타입 1 (AAV1)를 준비 합니다. 빠른 녹색 µ 0.1 mg/L을 추가 하 고 37 ° c.에 AAV1-빠른-녹색 혼합물을 유지</li>
	<li>원하는 모양으로 얇은 모 세관 팁 준비 (길이 80 µ m와 안쪽의 외부 직경 8 m m 50 µ m의 직경), micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 (설정: 압력 = 500, 열 700, 풀 = = 0, 속도 = 80, 시간 = 200, 테이블의 자료를 참조 하십시오 < / c1 >). 그것은 4-5 m m 되도록 모 세관의 끝을 휴식.</li>
	<li>모 세관 팁 흡 인기 튜브 (44 cm x 0.7 cm)를 조립 하십시오 그리고 모 세관으로 AAV1-빠른-녹색 혼합물의 15 µ L 발음.</li>
	<li>동물 주제 전체 절차 동안 37 ° C의 일정 한 생리 적 체온 유지.</li>
	<li>Preincubation 챔버로 임신 C57Bl/6 마우스 (배아 일 14.5)를 배치 하 고 기체 4 %isoflurane 마우스 anesthetize (0.6-0.8의 체적 공기 흐름 속도와 L/분).</li>
	<li>피하, buprenorphine (몸 무게의 0.1 mg/kg) 주사.</li>
	<li>Prewarmed 수술 플레이트 (37 ° C)에 마 취 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>윤활제와 함께 눈을 커버.</li>
	<li>마 취 마스크와 마우스에 맞게 (0.6-0.8의 체적 공기 속도로 가스 1.5% isoflurane L/min) 수술 판과 면도 복 부 피부 영역에. 면도 지역을 그리고 betadine 솔루션 3 X 75% 에탄올을 닦아냅니다. 참고: 마 취 마우스의 호흡 동작을 지속적으로 모니터링 합니다. 마우스의 흡입-증발 기 패턴에 따라 isoflurane 가스의 농도 조정 합니다.</li>
	<li>마우스의 뒷 발 골을 압박 하 여 발바닥의 반사의 부재를 확인 합니다.</li>
	<li>곡선된 톱니 모양의 아이리스 포 셉 (10 cm)와 피부를 재 밌 고 직선 텅스텐 카바 이드가 위 (10 cm), 교육 년 따라 피부를 절단 한 다음, 바로 Dumont 핀셋 (12 c m, 0.2 m m으로 복 벽을 댔 지에 의해 복 부 구멍을 열으십시오 0.12 m m) x (8 cm)가 위 직선 바와 교육 알바 따라 벽을 절단 하 고.</li>
	<li>복 부 오프닝에 한 조각의 fenestrated 파라핀 영화를 놓고 마이크로-모기 hemostatic 집게 (12.5 c m, 곡선)의 양쪽 끝에 영화를 해결 합니다.</li>
	<li>자 궁 뿔 안에 태아 손상을 방지 하려면 숟가락 모양의 장치 자 궁 뿔을 노출 합니다. 자 궁 뿔에 PBS (37 ° C)의 몇 방울 똑 하 고 손해 또는 기형 자 궁 골목 안에 대 한 태아 검사.</li>
	<li>순서와 자 궁 뿔에는 태아의 위치를 문서화 합니다. 주입을 위한 원하는 위치에 도달할 때까지 배아를 자 궁 골목 안에 신중 하 게 설정 합니다.</li>
	<li>시각적으로 검사 하는 사출 사이트 (예를 들어, 뇌 심)와 염료 침투는 stereomicroscope에서 AAV1-빠른-녹색 혼합물의 1-2 µ L를 주사.</li>
	<li>주입 된 배아를 문서화 하 고 복 부 구멍으로 다시 주입된 태아와 자 궁 뿔 장소.</li>
	<li>복 부 구멍으로 PBS (37 ° C)의 몇 방울 똑. 복 벽 (사용 폴 리아 미드 6 0 크기의 봉합)과 피부 (사용 폴 리아 미드 3 0 크기의 봉합), Halsted의 모기 hemostatic 집게 (12.5 c m, 곡선)를 사용 하 여 봉합 하 여 캐비티를 닫습니다. 또는 사용 하 여 간단한 중단된 패턴 또는 스테인리스 봉합/스테이플 복 부 구멍 그리고 피부를 닫습니다.</li>
</ol>2입니다. 격리 된 조직 Telemacrophotography
<ol><li>
버퍼의 준비
	<ol>
<li>녹이는 14.95 g Na2HPO4 의 KH2포4 감동 200 rpm에서 증류수 1 L의 2.18 g Sörensen의 버퍼 (1 리터)를 준비 합니다. 관류의 임신 강아지 및 새끼는 출생에서 기간 사용 바늘의 적절 한 크기 복 부 또는 intragastric 주입에 대 한 하 고 터미널 나트륨 pentobarbital 마 취 농도 180 mg을 초과 하지 않는 다는 것을 확인 / 몸 무게의 킬로그램입니다.</li>
		<li>75 ° C에 증류수 500ml를가 열 하 여 Mugnaini의 고정 솔루션 (5 L)를 준비 하 고 200 rpm, 5의 200 µ L 추가의 감동 아래 paraformaldehyde 분말 50 g을 추가 N NaOH, Sörensen의 버퍼의 추가 1, 500 mL, 1750 mL의 증류수 그리고 25%도 500 mL. 최대 5000 mL 증류수에 채우십시오. 이 마지막 버퍼를 사용 하 여 재 관류에 대 한. 참고: 후드 Mugnaini의 고정 솔루션을 준비, 보호 안경을 착용 하 고 연기를 피하십시오. 관류의 더 나은 시각화에 대 한 메 틸 렌 블루 (0.05 g/L)를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 관류 및 조직 분리
	<ol>
<li>Transcardially perfuse (배아 연구)의 경우 transduced 배아 또는 표준 절차6,7에 따라 원하는 나이 (예를 들어, 출생 후 하루 24)에 태어난된 transduced 술집 임신 쥐 11,12,13,14,15,,1617, 복 터미널 sodium pentobarbital을 사용 하 여 마 취 (200 mg/kg의 몸 무게).</li>
		<li>마우스 transcardially 주입 덤플링 솔루션 (500 U) 쥐를 고취 26 G, 바늘으로 하 고, 고정, 전에 1을 사용 하 여 시체에서 피를 제거 하 고 그들에 게 40 ° C prewarmed Mugnaini의의 30 mL와 함께 transcardially를 perfuse에 PBS의 10 mL와 함께 transcardially 고정 솔루션입니다. 참고: 성인 쥐에 대 한 복 부 대동맥14를 통해 대체 역행 관류를 수행 합니다.</li>
		<li>(예를 들어, 뇌 또는 척수)의 perfused 조직 분리 하 고 후 위 4 ° c.에 다른 24 h에 대 한 Mugnaini의 고정 솔루션의 적어도 10 mL에 조직</li>
		<li>조직을 실 온에서 3 h에 대 한 PBS의 10 ml 씻으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agarose, 문서에 포함 하 고 단면
	<ol>
<li>재현할 수 단면 각도8,,910특별 한 프레임에 고립 된 조직 (예를 들어, 뇌)를 조정 합니다. 또는, 조정 가능한 절단 두께 vibratome를 사용 합니다.</li>
		<li>신경 조직 프레임에 배치 하 고 telemacrography에 대 한 조직 조정 좌표를 문서화 합니다.</li>
		<li>3% 낮은 녹는 agarose 포함 매체 준비: Sörensen의 버퍼의 100 ml에서 agarose의 3 세대를 추가 하 고 90 ° c 물 욕조에 섞어가 열</li>
		<li>조직을 포함 하는 프레임에 3 %agarose (30 ° C)를 붓는 다. 따뜻한 금속 블록과 프레임을 커버 하 고 경화 될 때까지 기다립니다. 경화, 동안 포함 된 조직 및 그것의 좌표 프레임 내에 이미지를 telemacrographic 장치를 사용 합니다.</li>
		<li>절단 간격에 해당 하는 첫 번째 프레임의 좌표와 agarose 임베디드 조직 프레임으로 전송.</li>
		<li>원하는 두께 (예를 들어, 1.5 m m)의 섹션으로 얇고 진동 면도날으로 장치 내장된 조직 컷 ( 재료의 표참조). 참고: 면도날의 활공을 높이기 위해 내장된 조직에 글 리세 린 몇 방울 똑.</li>
		<li>PBS의 각 조직 섹션 이미지와 폴더에 이미지를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 격리 된 조직 준비
참고: 후드 아래 떨고 플랫폼에 단단히 closable 뚜껑 유리 접시에 외피의 모든 추가 단계를 수행 합니다.
<ol><li>PBS에서 2 x 30 분 조직 단면도 씻어. 실 온에서 2 h의 2% 수성 오스뮴 tetroxide 솔루션 (OsO4) 섹션을 품 어. 주의: 오스뮴 tetroxide 독성 이며 그것은 피부와 접촉할 때 유해할 수 있습니다.</li>
	<li>PBS에서 2 x 30 분 osmicated 섹션을 씻어.</li>
	<li>10-15 분 동안 실 온에서 30%, 50%, 70% 에탄올에 섹션을 품 어 (옵션: 4 ° C에서 70% 에탄올에서 밤새 품 어).</li>
	<li>이미지 왼쪽 및 45 °의 각도로 오른쪽에서 샘플에 적용 되는 LED RGB 빛8,9,10 (2 x 15w)에서 70% 에탄올에 osmicated 표본. 검은 요리와 지루한 검은 백그라운드를 사용 하 여 산란 하 고 조명 하는 동안 빛의 반사를 최소화 하기 위해. 주의: 이미징 동안 건조 섹션을 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>시리즈는 폴더에서 이미지를 수집 하 여 좌표 섹션 이미지의 아틀라스를 만듭니다.</li>
	<li>100% 에탄올 (2 x 30 분)과 상 온에서 100% 프로필 렌 산화물 (2 x 30 분)에서 표본 품 어. 주의: 솔루션을 변경 하는 동안 건조 섹션을 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>부드럽게 유리 바 교 반 하면서 수 지의 260 mL 유리 용기 무수 물 dodecenylsuccinic의 240 mL 믹스. 이질성, 거품, 및 얼룩에 대 한 정기적으로 확인 합니다. 아주 부드럽게, 적어도 45 분 동안 손으로 저 어.</li>
	<li>수 지/프로필 렌 산화물 1: 2와 1: 1의 비율로 준비 하 고 추가 3% 가속기 (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).</li>
	<li>1:2 단계에서 3.8 2 h를 누른 1:1 포함 솔루션에서 단계에서 3.8 2 h에 대 한 실 온에서 회전 바퀴에 솔루션을 포함 조직 품 어.</li>
	<li>조직 평면 폴 리 프로필 렌 요리에서, 신선한 수 지 3% 가속기를 포함 하는 조직 커버 놓고 12 24 h에 대 한 65-85 ° C에서 임베디드 조직 치료 합니다.</li>
	<li>포함 된 조직 실내 온도에 아래로 냉각 하 고 폴 리 프로필 렌 요리에서 수 지 포함 견본을 제거.</li>
</ol>4. 정량 분석에 대 한 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수 선택
<ol><li>
관심의 영역을 매핑
	<ol>
<li>관심 (예를 들어, 해 마 또는 소 뇌)의 영역을 선택 하 고이 지역에 있는 아틀라스 (3.5 단계)에서 이미지를 선택 하 여 섹션 아틀라스에서 영역을 지역화.</li>
		<li>섹션 이미지에 관심 분야의 경계를 스케치 하 고 찾기/첨가 수 지 표본에 지역 경계.</li>
		<li>스크래치 마크는 미세 바늘 게이지 (26 G, 1)를 사용 하 여 수 지 표본에 관심 (예를 들어, 해 마 또는 소 뇌)의 영역의 테두리.</li>
		<li>트리밍에 대 한 수 지를 부드럽게 하거나, 또는 트리밍 장치를, 얇은 잎, 또는 사 포를 사용 하는 오븐에서 85 ° C를 수 지 표본 열.</li>
		<li>면도날으로 수 지 표본에서 관심 영역을 삭제할 ( 재료의 표참조). 접착제 (직경 8 mm)와 1 cm의 길이 예를 들어, 필요한 구경의 아크릴 유리의 바에는 견본을 탑재 합니다. 세미-ultrathin 단면화 및 탑재 된 견본을 정돈 한다.</li>
		<li>Semithin (0.75 µ m) 준비와 ultrathin (70 nm)는 ultramicrotome를 사용 하 여 잘린된 영역 섹션: 0.75 µ m 두께 1.5 m m/s 및 70 nm 두께 0.7 m m/s에 그것을 설정.</li>
		<li>유리 캐리어 semithin 섹션을 수집 하 고 1% 톨루이와 섹션 (4 분)에 대 한 PBS에 블루 얼룩.</li>
		<li>섹션 이온된 수에 여러 번 씻는 다. 얼룩진된 섹션 4 x를 사용 하 여 가벼운 현미경 검사 (0.1 ∞의 나 /-), 10 (0.22 ∞/0.17의 없음), x 40 (0.65 ∞/0.17의 없음), x (1.25 ∞/0.17의 없음) 목표 x 100.</li>
		<li>니켈 격자에 ultrathin 섹션을 수집 합니다. 180에 가장을 격자를 주제로 kV 및 3, 200 x, 6, 000 x, 및 8, 000 배 확대.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TEM 분석
	<ol>
<li>양적 TEM 분석 (예를 들어, 소포 및 미토 콘 드리 아 또는 myelinated 및 nonmyelinated 축 삭 boutons)에 대 한 관심의 ultrastructural 매개 변수를 선택 하 고 이러한 매개 변수 3, 500 x, x 6000 및 8000 x 배율 TEM 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Utero에서 변환의 중요 한 단계는 주입. 정확한 주입 뇌 심 또는 관심의 다른 영역으로 경험 및 실습 기술 필요합니다. 얇은 microcapillary 팁, 덜 조직 손상이 발생할 수 있습니다; 그러나,이 사출 압력을 증가 하는 비용입니다. Utero electroporation19,20,,2122, 달리 utero에서 변환 후 삽입 된 배아의 생존 율은 아주 높다. 자 궁 경적의 모든 배아 배아 자 궁 뿔의 뿌리에 위치 하 고 자 궁 낭 내에서 재조정 해야 하는 경우에 주입 수 있습니다. 사출 및 분석의 발달 단계는 과학적 질문에 적용할 수 있습니다.
뇌 심에 주입, AAV1 입자는 전체 심 실 시스템을 통해 척수를 통해 배포 됩니다. 해 마와 소...

아니 광자는 전자의 깊이 학년에서 ultrathin 조직 표본을 침투 수 있습니다. 이 가벼운 현미경 검사 법 기술에 비해 미세 구조의 나노미터 해상도 이미지를 캡처에 가장 귀중 한 장점을 특성. 예를 들어 가장 미토 콘 드리 아, melanosomes, 등 다양 일 분 비과 립, microtubules, microfilaments, 섬 모, microvilli, 및 세포 접합 (세포 표면 세포내 세포의 시각화 수 있습니다. 전문화), 특히 신 경계1,2,,34synapses. 현재 방법론 연구의 전반적인 목표는 utero에서 변환의 가장 최신의 기술을 결합 하 여 태아 간섭에 따라 개발 하는 동안 신경가 소성에 변화의 ultrastructural 인식 이다. 관심의 virally 인코딩된 단백질 중앙 신 경계5,6,7,6척수 포함 하 여에 utero에서 불리고 되어 있다. 예를 들어, 함께 가장 utero에서 변환 사용 되었습니다 L1 및 핵 수용 체 단백질 사이 상호 작용에 관해서는 특히 L1 불충분 한 쥐에서 소성을 학습 하는 모터에 세포 접착 분자 L1의 효과 공부 하 고 소 뇌 신경7에서.
Neuroplasticity 매개 변수 분석 신 경계 내의 작은 지역의 지역화에 대 한 정확한 정보가 필요합니다. 따라서, 그것은 ultrastructural 세부 사항 및 다른 구조에 관하여 그들의 정확한 지형 방향을 설명 하기 위해 적절 한입니다. 현재 연구에서 특정 준비 방법 빛과 전자 현미경 검사 법에 따라 다른 형태학 분야의 상세한 조사에 제공 됩니다. 이 이렇게 결합 조직 조작, 마우스 뇌와 척수의 utero에 변환 시작 하 고 관류 고정, 다음의 몇 가지 기술을 몰드-포함, 그리고 가장에 대 한 처리 하는 조직. 포함 및 가장에 대 한 조직의 처리 사이 포함 하는 필수적인 단계는의 정확한 microphotographic 및 낮은 확대 설명서에 대 한 허용 간섭 빛 반사 기술을 사용 하 여 조직의 설명서 조직 표본8,,910. 현재 접근에 통합,이 기술은 신경 조직 표면 및 가장에 대 한 그들의 준비에 앞서 표본 조각 프로필의 지형 및 구조 정보를 검토 하는 연구를 수 있습니다.
전체 두뇌를 단면에 대 한 특별 한 프레임 stereotaxic 좌표에 해당 합니다. 이 프레임과 신경 조직에서 영역의 형태 3 차원 (3D) 재건 혜택 형태학 분석에 사용할 수 있습니다. 시각화 된 섹션의 macrographs 지형 좌표를 할당 빌드하고를 순차적으로 번호가 매겨진된 섹션 조직 아틀라스에 지도.
수 지 처리, 후 포함 된 조직 ultrathin 섹션으로 구분 됩니다 (< 70 nm) 위에서 언급 한 조직 아틀라스의 지도 따라 선택된 영역을 포함. 그들의 내용의 및 단지 내에 인접 구조에 연락처의 소성 매개 변수 (예: 횡단면 프로필 영역 시 냅 스 boutons 또는 axonal 섬유)의 고해상도 이미지를 얻기 위해 가장 ultrathin 섹션 대상이 됩니다. neuropil입니다.
여기에 설명 된 방법으로 마이크로-그리고 nanostructures 시각화 된 macrostructures에서 부드러운 전환 utero에서 변환 개발의 긴장 후 형태학 신경가 소성의 비교 심층 연구를 허용 시스템입니다.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol</td><td>Serva</td><td>36975</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 1'' 바늘</td><td>Henke-Sass, Wolf GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>410 공기 펌프용 마취 장치</td><td>생물 의학 기기(Univentor)</td><td>8323102</td><td></td></tr><tr><td>아데노 관련 바이러스 혈청형 1(AAV1)</td><td>UKE(Viral Core Facility)</td><td>-</td><td>AAV1의 참고 문헌 및 타겟 영역은 https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ 및 다음의 문헌을 참조하십시오: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. 권나, Schaffer DV. Pharm Res. 2008년 3월; 25(3):489-99. 혈청형 1, 2, 5의 바이러스 캡시드와 pseudotype된 재조합 AAV 바이러스 벡터는 중추신경계의 다른 부위로 전달된 후 차등 효율과 세포 영양성을 나타냅니다. 버거 C, 고르바튜크 OS, 벨라르도 MJ, 페덴 CS, 윌리엄스 P, 졸로투킨 S, 라이어 PJ, 만델 RJ, 무지츠카 N. 몰. 2004년 8월; 10(2):302-17. 자가 보완적 재조합 아데노 관련 바이러스(scAAV) 벡터는 DNA 합성과 독립적으로 효율적인 transduction을 촉진합니다. 맥카티 DM, 모나한 PE, Samulski RJ. 유전자 Ther. 2001 8 월; 8(16):1248-54.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>저겔화 아가로스</td></tr><tr><td>에어 펌프</td><td>생물 의학 기기(Univentor)</td><td>Eheim 100</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>CIBA-GEIGY</td><td>23857.9</td> 조직 흡입기 튜닝 어셈블리 <td>매립용 수지</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>호흡 마스크 마우스 알루마이트 알루미늄</td><td>생물 의학 기기(Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>Temgesic</td><td>앰플</td><td>진통제</td></tr><tr><td>모세혈관</td><td>Science-Products</td><td>GB100TF-10</td><td>충전재</td></tr><tr><td>Dodecenylsuccinic 무수물</td><td>Fluka</td><td>44160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋(#3, 12cm, 스트레이트, 0.2 x 0.12mm)</td><td>FST</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td>필립스</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon 봉합사(Ethilon, 6-0 및 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>-</td><td>폴리아미드</td></tr><tr><td>눈 윤활제</td><td>Bepanthene-Fast</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>주입된 액체의 시각화를 위한</td></tr><tr><td>가스 라우팅 스위치 4/2 커넥터</td><td>Biomedical Instruments(Univentor)</td><td>8433020</td><td></td></tr><tr><td>홀스테드 모기 지혈 겸자(12.5cm, 직선)</td><td>FST</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>25 000 I.E./5</td></tr><tr><td>mL 마우스용 인덕션 박스 수평으로 움직이는 뚜껑이 있습니다. 내부 치수: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. 벽 두께: 6 mm</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>홍채 집게(10cm, 곡선, 톱니)</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위(11cm, 스트레이트, 텅스텐 카바이드)</td><td>FST</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran OP Tisch, 전기 가열, sm 외부 치수: 257mm x110mm x 18mm. 가열 면적: 190mm x 90mm 호흡 마스크 탈출 이소플루란 제거는 규정에 따라 하향</td> 조정됩니다. <td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane (Attane)</td><td>JD medical</td><td></td><td>흡입 마취</td></tr><tr><td>LED RGB 조명</td><td>카메오</td><td>CLQS15RGBW</td><td>LED 2 x 15 W</td></tr><tr><td>광학 현미경 기본 DM E</td><td>Leica-4x</td><td></td> <td>(N.A. 0.1 &infin;/-), 10x (N.A. 0.22 &ninf;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &infin;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &infin;/0.17) 대물렌즈</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Science-Products</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>모기 지혈 겸자(12.5 cm, 곡선)</td><td>FST</td><td>13010-12</td><td></td></tr><tr><td>니켈 그리드, 200 메쉬</td><td>Ted Pella</td><td>1GC200</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 (VIII)-oxid</td><td>Degussa</td><td>73219</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드</td><td>Fluka</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Schick</td><td>87-10489</td><td></td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨 (Narcoren)</td><td>Merial GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TC01mR 1-Channal 온도 컨트롤러</td><td>피드백 포함 생물 의학 기기 (Univentor)</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Technovit 4004 두 구성 요소 접착제</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telemacrodevice</td><td>Canon-Canon</td><td></td> <td>Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f / 3.5-5.6 IS STM 대물, 확장 150 mm 미만, 수동 확장 튜브 7 mm 링, 14 mm 링, 28 mm 링, 매크로 리버스 링 (58 mm), 캐논 복사 스탠드.</td></tr><tr><td>Thermopuller P-97</td><td>Sutter Instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>얇은 진동 면도날 장치</td><td>Krup-Szabo</td><td></td> <td>얇은 블레이드</td></tr><tr><td>톨루이딘 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경 C20</td><td>Phillips</td><td>-</td><td>최대 200 kV</td></tr><tr><td>Tygon 6/4 모든 부품 연결용 튜빙 재료 외경: 6 mm 내경: 4 mm Wa ll 두께: 1 mm</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut E</td><td>Reichert-Jung-ultramicrotome</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univentor Scavenger</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>8338001</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 가위(8cm, 직선)</td><td>FST</td><td>15009-08</td><td></td></tr></tbody></table>년

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 utero 변환 후 ultrastructural neuroplasticity 매개 변수

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

현재 연구 관심사의 단백질에 의해 영향을 명확 하 게 확인 된 지형 구조에서 ultrastructural 매개 변수는 정확한 morphometrical 분석에 utero 변환 전송 전자 현미경 (TEM)와 결합 그 바이러스 전송을 통해 유기 체에 도입 되었습니다. 이 결합 된 접근 다음 지형 탐색 지도 조직 아틀라스에서 ultrastructural 식별 macrostructural에서 부드러운 전환에 대 한 수 있습니다. 에-utero-불리고 조직의 고해상도 전자 현미경 계시는 neuropil와 소성 매개 변수, cross-sectioned 시 냅 시스 bouton 지역, 시 냅 스 소포 내 미토 콘 드리 아의 수의 좋은 열 대권 외는 bouton 프로필, 시 냅 스 연락처, cross-sectioned axonal, 수 초 두께, myelin lamellae 수 및 미토 콘 드리 아 프로필의 cross-sectioned 분야의 길이. 이러한 매개 변수의 분석 유전자 구성의 바이러스 성 전송에 의해 영향을 받는 신경 영역에 ultrastructural가 소성의 변화에 대 한 필수적인 통찰력을 보여준다. 이 결합 된 방법만 사용할 수 없는 신경가 소성에 유전자 조작된 생체 약물의 직접 효과 공부 하지만 또한 가능성 (예를 들어, 컨텍스트에서 신경가 소성의 utero 구조 연구 신경 퇴행 성 질병)입니다.

쥐의 안정적이 고 빠른 마 취에 대 한 수많은 안전 매개 변수 고려 되었다, 하 고 마 취 단위의 최적화 된 작업 영역 적절 한 (그림 1A)으로 판명. 단위는 쥐와 쥐와 같은 작은 동물에 성공적인 수술에 필요한 정밀 액체 isoflurane 및 주위 공기의 혼합을 제어 하도록 설계 되었습니다. 공기와 isoflurane 원하는 설정에 따라 기화 기에 혼합 하 고 동물 (그림 1A)에 상자에 또는 마스크를 통해 전달 됩니다. 폐품 수집 및 생성 될 수 있습니다 어떤 잉여 isoflurane 가스는 안전한 작업 환경을 제공 합니다. 가스는 수집 하 고 카트리지 (그림 1A)에 있는 활성 탄을 통과.
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전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

우리의 결합된 접근은 자궁에 있는 초기 신경계에 초기 발달 내정간섭 후에 초구조신경 가소성 매개변수가 어떻게 변화하는지 대답하는 것을 돕습니다. 우리 방법의 주요 장점은 조직 아틀라스 내의 미리 정의 된 좌표 시스템에서 매크로 메소 마이크로 및 나노 구조의 고해상도 이미지를 획득하는 것입니다. 우리의 방법의 의미는 선천성 신경 퇴행성 질환에 대한 번역 치료 잠재력입니다.예를 들어, 자궁 경색 기법에서 이를 사용하여 배아 단계에서 치료 및 구조. 우리의 방법은 다른 모델에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스 종은 관심 영역뿐만 아니라 변경할 수 있습니다.처음으로 우리의 방법을 시도하는 연구원은 전자 현미경 화상 진찰을 위한 조직을 준비하는 방법의 지식뿐만 아니라 심오한 외과 훈련이 필요합니다. 먼저 원하는 표적을 위해 아데노 관련 바이러스 유형 1 코팅의 11가지 바이러스 입자에 4회 10번 을 포함하는 맞춤형 모세관 팁을 적재하고, 패스트 그린 염료로 흡착튜브에 부착한다. 라벨이 부착된 아데노 관련 바이러스 입자의 15마이크로리터를 모세관에 추가합니다.다음으로, 마취배아의 날 14.5 임신 마우스에서 발가락 꼬집어에 대한 반응의 부족을 확인하고, 피부를 소독한다. 곡선 된 세상 홍채 집게와 직선 텅스텐 초경 가위를 사용하여 리나 중앙 값을 따라 피부 절개를합니다. 직선 두몬트 핀셋을 사용하여 복막 벽을 잡고, 직선 반나스 가위와 라인나 알바를 따라 계속하고 복부 개구부 위에 회귀 파라핀 필름의 조각을 배치하고 뿔 내부의 배아를 손상시키지 않고 자궁 뿔을 노출하는 숟가락 같은 장치를 사용합니다.자궁 경적에 섭씨 37도 PBS를 몇 방울 떨어 뜨린 후 자궁 낭 내부의 손상이나 기형에 대한 배아를 검사합니다. 각 주사에 대해 원하는 위치가 달성 될 때까지 배아를 주머니 안쪽에 주의 깊게 돌립니다. 배아가 제자리에 있을 때, 각 태아에 Fast Green 표지된 바이러스 입자 용액의 1~2개의 마이크로리터를 주입하십시오.모든 배아가 주입된 후 자궁 뿔을 복강으로 다시 배치하고 37도 섭씨 PBS를 복부에 몇 방울 더 넣습니다. 그런 다음 폴리아미드 6-0 크기의 봉합사를 사용하여 간막 벽과 폴리아미드 3-0 크기의 봉합사 및 Halsted의 모기 혈전성 집게를 닫아 피부를 닫습니다. 텔레 매크로 사진에 대한 관심의 격리 된 조직을 포함하려면, 재현 가능한 단면 각도와 특수 프레임에 조직 샘플을 배치하고 좌표를 문서화.조직이 덮을 때까지 30도 섭씨 3%아가로즈로 프레임을 채우고 아가로즈가 굳어질 때까지 플라스틱 뚜껑으로 프레임을 덮습니다. 아가로즈가 경화되는 동안 텔레 매크로 그래픽 장치를 사용하여 내장된 조직과 프레임 내의 좌표를 이미지합니다. 아가로즈가 고화되면, 아가로즈 임베디드 조직을 첫 번째 프레임의 좌표에 해당하는 절단 갭으로 프레임으로 옮기는다.얇고 진동하는 면도날을 가진 장치를 사용하여 임베디드 조직을 적절한 실험 두께의 섹션으로 자른다. 그런 다음 PBS의 각 조직 섹션을 이미지화하고 이미지를 폴더로 수집합니다. 전염 전자 현미경 검사법을 위한 조직 샘플을 준비하기 위하여는, 생물 안전 캐비닛에서, PBS에 있는 2개의 30 분 세척으로 조직 단면도를 세척하고, 실온에서 2% 수성 osmium tetroxide 용액에 2 시간 인큐베이션에 선행됩니다.인큐베이션이 끝나면 PBS에서 30분 동안 2회 더 세척하고 표시된 대로 순차적으로 10-15분 에탄올 몰입으로 섹션을 탈수합니다. 70%에탄올 침수 후, 각 샘플을 둔한 검은 색 배경에 검은 색 접시에 넣고 45도 각도로 왼쪽과 오른쪽의 샘플에 적용된 LED RGB 빛 아래 의 표본을 70% 에탄올로 이미지합니다. 폴더에서 일련의 샘플 이미지를 수집하여 좌표로 섹션 이미지의 아틀라스를 만듭니다.시편을 30분 100% 에탄올 인큐베이션 2개로 처리하고, 실온에서 30분 100% 프로필렌 산화물 배양 2개를 넣습니다. 시료가 배양되는 동안, 신선하게 준비된 수지와 1대 2 비율로 소실렌 산화물을 혼합하고 두 솔루션모두에 3%의 가속기를 추가합니다. 두 번째 프로필렌 옥사이드 인큐베이션 후, 실온에서 2시간 동안 1-2 수지 프로필렌 옥사이드 방류 매체 용액으로 샘플을 옮기고, 실온에서 1대 1 수지 프로필렌 옥사이드 에 2시간 배양한다.두 번째 인큐베이션이 끝나면 조직을 평평한 폴리프로필렌 접시로 옮기고, 65~85°C에서 12~24시간 동안 3%의 가속기를 함유한 신선한 수지로 내장된 조직을 치료한다. 그런 다음 조직을 실온으로 식히고 폴리 프로필렌 접시에서 수지 임베디드 표본을 제거합니다. 관심 영역을 매핑하려면 이전에 준비된 이미지 아틀라스에서 관심 영역이 포함된 이미지를 선택합니다.관심 영역의 테두리를 단면 된 이미지에 스케치하고, 현미경 아래 임베디드 시편에 이러한 테두리를 광학적으로 중첩시키고, 1 인치 26 게이지 바늘을 사용하여 이러한 영역테두리를 수지 시편에 긁어. 그런 다음 수지의 부드러워지기 위해 표본을 섭씨 95도로 가열합니다. 다음으로, 오븐에서 따뜻한 수지 표본을 꺼내서 면도날을 사용하여 관심 영역을 소비합니다.표본을 적절한 구경의 막대를 들고 있는 아크릴 유리에 접착하고, 반및 초박형 단면에 장착된 시편을 다듬습니다. 초미세토메를 사용하여 반박형 0.7마이크로미터 및 초박형 70나노미터 섹션을 획득하여 유리 캐리어의 반박형 섹션과 니켈 그리드의 초박형 섹션을 수집합니다. PBS에서 1%Toluidine 블루로 반박형 부분을 4분 동안 염색한 다음, 빛 현미경으로 단면을 검사하기 전에 탈이온화된 물에 여러 개의 세설이 뒤따릅니다.초박형 단면은 추가 수정 없이 180킬로볼트에서 전염 전자 현미경 검사법에 의해 직접 평가될 수 있다. 단면 후, 조직 조각은 방금 입증 된 것처럼 텔레 매크로 사진으로 이미지됩니다. 미루와 에탄올 침지 후, 단면도는 간섭 라이트 텔레 맥로그래피에 의해 다시 이미지화되어 각 조직 표면에 대해 특별히 색이 지정된 패턴을 드러냅니다.추가 탈수 및 수지 포함 후, 관심 영역을 선택하고 전송 전자 현미경 검사법을 위해 추가 처리됩니다. 해마와 소뇌에서, 이끼 섬유 시냅스는 큰 사전 시냅스 부폰을 포함하여 다른 시냅스에 비해 독특한 초구조적 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 그들의 단면 단면도에서, boutons는 소포와 미토콘드리아의 광대 한 수를 포함하고, 아주 수시로 몇몇 수지상 척추를 둘러싸는.척수에서 등쪽 푸니큘러스에는 올리고드렌드로글리아가 골수화한 많은 축산 섬유가 들어 있습니다. 대지 섹션에서는 척수의 두 후불 뿔 사이에서 등색 성균을 찾을 수 있습니다. 전송 전자 현미경 이미지에서 단면 된 골수화 축축이 둥글게 나타나고 축을 둘러싼 myelin 칼집이 라멜라에서 구성됩니다.제조된 아틀라스 및 초구조 파라미터의 미세지형 투과 전자 현미경 이미지는 다양한 치료 조건 하에서 상이한 부분의 형태학적 신경가소성의 비교뿐만 아니라 동일한 영역 내의 파라미터 간의 비교에도 도움이 된다. 자궁 에서 자궁 트랜스듀션을 시작하기 전에 철저히 계획하고 준비해야 하며, 합병증이 있을 경우 재료와 계측기의 백업을 해야 합니다. 우리의 방법에 따라, 관심의 정의 된 분자의 초구조 추적을 위한 전자 현미경 검사전에 면역 금 라벨링과 같은 다른 기술을 추가 할 수 있습니다.전체 유기체의 전체론적 보기로 시작하여 분자 지형을 향해 확대, 우리는 연구하고 조직 기능과 형태 사이의 관계를 조작 할 수 있습니다. 오스뮴 테트옥사이드는 위험합니다. 이 시약으로 작업 할 때 항상 후드 아래에서 작동하고 보호 안경과 손 장갑을 착용해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

출처: Lutz, D., et al. 발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 형질도입 후 초미세구조 신경가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 마우스 배아에서 자궁 내 주사를 통한 바이러스 형질도입을 보여줍니다. 임신한 쥐를 수술을 위해 준비하고 정중선 절개를 하여 자궁 뿔을 노출시킵니다. 원하는 유전자를 포함하는 바이러스와 추적 염료의 혼합물을 표적 위치의 자궁 주머니 내의 배아에 주입합니다. 그런 다음 봉합하기 전에 자궁 뿔을 다시 배치합니다.

마우스의 자궁 내 바이러스 형질도입

출처: Lutz, D., et.al.  발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 전달 후 초구조적 신경 가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 특급 (2019). 이 비디오는 새끼 쥐의 뇌 절편에 대한 준비 및 투과 전자 현미경(TEM) 분석을 보여줍니다. 이 프로토콜은 수지에 내장된 오스뮴 테트록사이드 고정 조직으로 시작하여 관심 영역을 분리하기 위한 정밀한 트리밍과 초박형 절개술을 통해 각각 광학 현미경 및 TEM을 사용하여 시각화된 반박형 및 초박형 절편을 생성합니다.

투과 전자 현미경을 사용한 마우스 뇌 절편의 초구조 분석

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

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새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.

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이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

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평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

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