Name: 환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 배우세요 환경 샘플에서 높은 처리량 siderophore 심사 방법을 이용하여 토양과 식물 조직의 철 이용성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 미생물 군집 내에서 siderophore 활성을 신속하게 측정하여 농업 생산성과 토양 건강을 개선하는 데 활용됩니다.

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저자는 실험실 절차, 수확 하는 밀 유전자 형에 대 한 리 Opdahl, 워싱턴 주 콩코드 포도 연구 위원회 및 자 급 농업에 대 한 워싱턴 주립 대학 센터에 Kalyani Muhunthan를 감사 하 고 싶다 고 BIOAg에 대 한 자연 자원이이 작업을 지원 하기 위해 부여 합니다. 추가 자금 해치 프로젝트 1014527 통해 미국 농 무부/NIFA에 의해 제공 했다.

참고: 필드 사이트의 위치: 워싱턴 주립 대학, 식물 병 리 농장 (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). 씨앗은 기계적인 화분을 사용 하 여 10 월 19 일, 2017에 뿌린 씨. 각 밀 유전자 headrows, 대략 1 미터 떨어져 루트 시스템의 중복을 피하기 위해 심은 했다. 식물 및 토양 샘플 2018 년 8 월 9 일 때 식물은 추수에 대 한 준비에 수집 되었다. 샘플 4 밀 genotypes의 3 개의 복제에서 모았다: PI561727, PI561725, 매드 슨, Lewjain.
1입니다. 수정 된 M9 매체의 준비
<ol><li>사용 나2포4∙7H2O (12.8 g/200 mL), KH2포4 (0.3 g/200 mL), M9 소금 솔루션 준비에 NaCl (0.5 g/200 mL), 및 NH4Cl (1 g/20 mL) 시 약.</li>
	<li>이중 이온된 수 (ddH2O) 100 mL에 MgSO4∙7H2O의 18 g를 사용 하 여 준비 0.75 M MgSO4∙7H2o.</li>
	<li>CaCl2∙2H2O의 1 M ddH2o.의 100 mL와 CaCl2∙2H2O의 14.7 g를 추가 하 여 확인</li>
	<li>DdH2O 감동과 156 mL으로 파이프의 6.048 g을 용 해 하 여 버퍼 솔루션을 준비 합니다. 5 M NaOH와 6.8에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>DdH2o.의 100 mL으로 포도 당의 20 g을 용 해 하 여 20% 포도 당 (포도 당 monohydrate)를 준비</li>
	<li>모든 압력솥 하지만 포도 당 개별적으로 솔루션을 준비 합니다. 필터 소독 압력가 마로 소독 (0.22 μ m) 후 M9 미디어에 추가 위한 포도 당 솔루션.</li>
	<li>파이프 버퍼 솔루션, M9 소금 솔루션의 40 mL, CaCl2·2H2O 솔루션의 20 μ의 156 mL, MgSO4·7H2O, 266 μ는 biosafety에 함께 20% 포도 당 솔루션의 4 mL를 혼합 하 여 수정 된 M9 매체 준비 캐비닛, 사용 무 균 기법입니다.</li>
	<li>수정 된 m 9의 보존에 대 한 컨테이너를 밀봉, 커버, 자외선 으로부터 보호 하기 위해 4 ° c.에 알루미늄 호 일</li>
</ol>2. CA-Fe-한 천 매체의 준비
<ol><li>산은 CAS 분석 결과 활용 이전 2 h의 최소 100 m m HCl/100 m m HNO3 모든 유리 세척.</li>
	<li>알루미늄 베이킹 팬을 실험실 급료 모래 가득 준비와 알루미늄 호 일로 다룹니다. 30 분을 정해 121 ° C에 고압.</li>
	<li>20 mL ddH2O 0.0365 g을 추가 하 여 HDTMA (hexadecyltrimethylammonium 브 로마 이드)를 준비 하 고 가용 화를 촉진 하는 37 ° C에서 솔루션을 배치.</li>
	<li>10 m m HCl을 준비 하 고 1mm FeCl3·6H2O 10 m m HCl 용 매로 사용 하 여 생성. 메 마른 자기 볶음 바도 부드럽게 저 어 하는 동안 CA의 0.0302 g ddH2O 25 mL를 추가 합니다. 계속 부드럽게 (어두운 붉은 검은 색으로 솔루션 회전)을 저 어 하는 동안 CA 솔루션의 25 mL를 1 m m FeCl3·6H2O (10 m m HCl)의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>천천히 부드럽게 교 반 (이 어두운 블루 솔루션 생성) Fe-CA 솔루션으로 하는 동안 HDTMA 솔루션의 20 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>375 mL ddH2O, 부드러운 교 반으로 파이프의 15.12 g을 용 해 하 여 버퍼 솔루션을 준비 합니다. 5 M NaOH와 6.8에 pH를 조정 합니다. 450 mL를 볼륨을가지고 물을 추가 합니다. Agarose의 5 g을 솔루션에 추가 합니다. 고압 파이프 솔루션 및 CAS Fe 솔루션 30 분 동안 121 ° C에서 버퍼.</li>
	<li>신중 하 게 그들의 각각은 압력가 마로 소독 후 CA Fe 솔루션의 전체 biosafety 내각에서 파이프 버퍼의 전체에 추가 합니다.</li>
	<li>50 ° c.에 물 욕조에 혼합된 솔루션 배치 참고: 갓 응고 매체에 CAS-Fe, 복잡 하 고 냉각 결과의 강 수에서 50 ° C 결과에 장기 저장으로 각 시험 전에 CAS-Fe-한 천 매체에서 모든 시 약을 준비 합니다.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 메 마른 모래와 50 ° c 열 멸 균 시 보트를 배치 보트, 분명, 평면-바닥, 살 균 96 잘 microplate에 각 음을 신속 하 게 aliquot 100 µ L를 CA-Fe-Agar를 전송 합니다.</li>
</ol>3. Pyoverdine/EDTA 표준 준비
<ol><li>Pyoverdine 준비<ol>
<li>800 μ M pyoverdine 표준 준비 (호박 산, 2-hydroxy glutaramide, 및 pyoverdine-succinaminde 형태의 혼합 재료의 표참조), 이전 준비 수정된 M9 매체에.</li>
		<li>400, 200, 100, 50, 25, 12.5에이 솔루션 및 6.25 μ M 솔루션을 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EDTA 표준 준비<ol>
<li>Disodium ethylenediaminetetraacetic 산의 0.594 g 추가 (EDTA: C10H14N2나2O8.2H2O), 3200 μ M EDTA 표준 준비 이전 준비 수정된 M9 매체의 500 ml.</li>
		<li>1600에이 솔루션을 희석 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 그리고 6.25 μ M 솔루션.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표준 곡선 생성<ol>
<li>Pyoverdine 및 CAS 철 한 천 매체의 100 μ를 포함 하는 96-잘 microplate의 우물을 EDTA의 각 농도의 100 μ를 추가 합니다. 각 농도의 중복 기술 복제를 확인 합니다. 또한, 추가 M9와 빈 우물 (EDTA 또는 pyoverdine).</li>
		<li>Microplate 리더를 사용 하 여, 흡 광도 측정 (420에 nm, 665 nm) 22 ° C, 및 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 흡 광도 측정에서 1, 6, 및 24 시간 보육 후. 참고: 420 nm 측정, pyoverdine 또는 EDTA 포함 하 웰 스의 흡 광도에서 흡 광도를 감 하십시오. 665 대 한 nm, pyoverdine 또는 우물의 흡 광도에서 포함 된 EDTA의 흡 광도 뺍니다. 그런 다음 로그10µ M pyoverdine (EDTA) 흡 광도 측정에 대 한 역행 이다. 샘플 결과 해석의 용이성에 대 한 흡 광도 사용 하 여 x 축으로 하 고 y 축으로10µ M pyoverdine (EDTA) 로그.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 환경 샘플의 수집: 토양 및 식물 조직
<ol><li>0.22 μ m 필터링 ddH2O 70% 에탄올, 다음 샘플링 장비 (삽과가 위)를 세척 하 고 샘플링 하기 전에 살 균 기술을 유지 하 고 감소를 샘플 사이 종이 타월로 닦아 교차 오염을.</li>
	<li>삭제할 필드, 식물에서 식물 조직 (곡물 및 촬영) 하 고 쉽게 원하는 토양 및 루트 샘플을 혼돈으로 몰아 위해 충분 한 촬영 수염을 떠나 레이블이 플라스틱 스토리지 가방에 넣어.</li>
	<li>깊은 작은 루트 공 약 15 cm와 23 c m excavate를 실험실 환경에서 샘플 준비를 위한 별도, 레이블이 지정 된 비닐 봉지에 넣습니다. 이 단계는 맥 퍼 슨 외.27의 방법에 비슷합니다.</li>
	<li>얼음에 직접 모든 샘플 (곡물, 촬영, 대량 토양, 그리고 별도 가방에 루트 공)을 놓고 샘플 siderophore 생산 분석 결과 대 한 처리는 될 때까지 4 ° C에서 유지 합니다.</li>
	<li>별도 루트는 대량, 느슨하게 연결 rhizosphere 토양과 밀접 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양으로 토양 샘플을 관련.<ol>
<li>가방에서 루트 볼을 걸릴. 루트 볼에서 토양을 부드럽게 흔들어. 토양, 떨어져 동요는 토양 함께 가방에 왼쪽 "대량" 토양 구성.</li>
		<li>고무 망치를 사용 하 여 추가 루트 공을에서 토양을 제거. 이것은 느슨하게 연결 rhizosphere 토양 이다.</li>
		<li>엄격 하 게 바인딩된 샘플 뿌리를 복용 하 고 원심 분리기 튜브에 넣고 단단히 바인딩된 rhizosphere 토양을 생성 합니다. 30 mL ddH2O와 소용돌이의 추가 2-3 분 위해 그것. 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양 슬러리 희석을 뿌리를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. siderophore 농축 문화와 CAS Fe siderophore 생산 분석 결과의 준비
참고: 모든 유리 산은 분석 실험을 시작 하기 전에 세척 되어야 합니다.
<ol><li>(각 3 개의 토양 샘플 형식)에 대 한 토양 시료 준비<ol>
<li>혼합 한 토양 가능한 가방을 열지 않고 샘플 가방 안에 각 토양 샘플을 균질. 참고:이 자연 토양 공간 가변성을 줄이는 데 도움이 됩니다 및 일반 토양 샘플링 절차에 맞춥니다. 다른 방법 환경 샘플, 적절 한, 그리고 실험 설계에 따라 균질에 활용 될 수 있습니다.</li>
		<li>후 각 샘플 철저 하 게 혼합, aliquot 및 수정 된 M9 매체의 20 mL에 각 토양의 2.0 g를 일시 중단, 다음 10-3 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 희석.</li>
		<li>엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 샘플에 대 한 수정 된 M9 매체의 20 ml rhizosphere 토양 슬러리의 2 개 mL를 추가 후 희석 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 10-3 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 샘플 (루트, 촬영 및 곡물) 준비<ol>
<li>표면 샘플 70% 에탄올으로 소독. 30 초 동안 높은에 믹서 기를 사용 하 여 수정 된 M9 매체의 20 ml에서 신선한 조직의 2.0 g macerate 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브 샘플 전송 다음 희석 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 10-3 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fe 제한을 통해 Siderophore 생산의 농축<ol>
<li>실 온에서 50 mL 원심 분리기 튜브를 품 어 고 160 rpm에 흔들.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. CAS-Fe agar 분석 siderophore 생산 환경 샘플에서의 검출
<ol><li>24, 48, 및 72 h 농축 문화를 시작한 후, 1 mL 샘플이 농축 튜브를 사용 하 여 메 마른 기술 및 원심 분리기 10000 x g에서 2 mL 원심 분리기 튜브에 1 분 동안 이용할 셀에서 제거 합니다.</li>
	<li>분리 된 상쾌한을 수집 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여, 중복 또는 microplate에 3 중 CA-Fe-Agar의 100 μ 솔루션에는 상쾌한의 100 μ를 추가 합니다. 또한 (공백)로 살 균 M9 매체의 100 µ L를 추가 합니다. 28 ° c.에 접시를 품 어</li>
	<li>자체 살 균 2 mL 원심 분리기 관으로 나머지 상쾌한 고 각 샘플 (결정 접시에는 추가 되지 않습니다)에 대 한 펠 릿을 일시 중단 합니다. 각 샘플 상쾌한 튜브에 살 균 글리세롤의 400 μ를 추가 하 고 글리세롤 주식을 만드는 펠 릿을 resuspend. 나중 분석-80 ° C에서 재고를 고정 합니다. 참고:이 단계는 어떤 선호 사내 프로토콜에 따라 글리세롤 주식을 생성 하 수정할 수 있습니다.</li>
	<li>6, 24, 48, 및 72 h 420 nm 파장에서 흡 광도 측정 한다.</li>
	<li>표준 곡선에서 생성 pyoverdine 또는 EDTA를 사용 하 여 pyoverdine 해당 측면에서 흡 광도 측정 한 샘플을 해석 하는. 참고: Pyoverdine EDTA에 비해 우수한 표준 결정 했다 (아래를 보라), 그래서 EDTA 현재 연구에서 결과 해석에 사용 되지 않았습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 작품의 기본 결과 양적 siderophore 생산/환경 샘플에서 활동을 측정 하는 동안 미생물을 생산 하는 siderophore에 대 한 신속 하 게 풍부 하 게 사용할 수 있는 새로운 방법론의 생산 이다. 방법론은 빠르고, 단순 하 고 비용 효율적인, 그리고 결과 사용 하 수 있는 복잡 하 고 소설 샘플 형식에서 siderophore 활동을 탐지 하는 방법을 보여 줍니다 (예를 들어., 토양 및 식물 조직). 프로토콜 또한 농축 문화의 글리세롤 주식의 생산 귀착되는 반입할 수 있습니다 쉽게 시간을 통해 DNA 또는 RNA를 통해 철 결핍 동안 미생물 지역 사회 구조와 기능에 교대의 연구를 수용 하기 위해 기반 기술 . 그 검사 siderophore 생태 연구에서 활동의 활동에 관심이 또한 가능성이 수이 방법에서 혜택. 결과 또한 pyoverdine 등가물 (pyoverdines는 환경28 및 약29측면에서 중요 한 side...

Siderophores는 중요 한 생체 철 chelation bioavailability, 하지만 다양 한 미생물 쿼럼 감지, 미생물 공장-호스트, 신호에서 배열 하는 지상파와 수생 생태계에 추가적인 목적에 주로 관여 식물 성장 촉진, 협력 및 복잡 한 미생물 지역 사회1,2내 경쟁. Siderophores 분류할 수 있습니다 광범위 하 게 그들의 활성 사이트 및 구조 기능, 4 개의 기본 형식 만들기: 카복실산, hydroxamate, catecholate, 및 종류3,4혼합. 많은 미생물 검출 한 종류 이상의 siderophore5 및 복잡 한 사회, 생물 biosynthesize의 대부분에서에서 막 수용 체 siderophores1의 더 넓은 다양 한의 통풍 관을 허용 하도록 할 수 있다 6. 최근 작품이 나타냅니다 siderophores는 특히 중요 한 지역 사회 수준에 남북 왕국 통신 및 생물 지구 화학적 전송7,,89,10에도 ,11.
크롬 azurol 반발 (CA) 사용 되었습니다 chelating 요원으로 30 년 이상 철 (Fe)에 바인딩할 CAS Fe 복잡 한 매체에 쉽게 식별 색상 변화를 만들기의 분리에 ligands (즉, siderophores)의 추가 발생할 수 있습니다 같은 방법으로 12. 때에 CAS Fe와 바인딩되어, 염료 로얄 블루 색상으로 나타납니다 및 CAS Fe 복잡 한 분리, 매체 Fe13를 청소 하는 데 사용 하는 리간드의 종류에 따라 색상 변경. 1987 년, Schwyn 및 Neilands에 의해 설립 초기, 액체 기반 매체 미생물 대상14, 성장 습관과 제한15, 뿐만 아니라 금속 철, 외의 다양 한 변화를 수용 하기 위해 여러 가지에서 수정 되었습니다 포함 하 여 알루미늄, 망간, 코발트, 니켈 카드뮴, 리튬, 아연16, 구리17, 그리고 심지어 비소18.
많은 인간 병원 체, 뿐만 아니라 식물 성장 촉진 미생물 (PGPM)로 확인 되었습니다 siderophore 생산 생물3,,1920및 중요 한 rhizosphere와 종종 테스트 endophytic PGPM 긍정적인 siderophore 생산4. 전통적인 철 기반 액체 방법은 결정 격리 재배 siderophore 생산21의 테스트에 적응 되었습니다. 그러나, 이러한 기술을 전체 (미생물), 협력에 미생물 커뮤니티의 중요성 및 토양 및 식물 시스템22siderophore 생산의 잠재적인 규칙을 인식 하지. 그 이유로, 우리는 siderophore 생산 기반으로 전통적인 CAS 분석 결과, 하지만 복제, 측정, 안정성 및 반복성을 microplate에의 용이성, 주어진된 환경에서의 높은 처리량 커뮤니티 수준 평가 개발 분석 결과입니다.
이 연구에서는 siderophore 생산을 탐지 하기 위한 비용, 높은 처리량 CAS Fe 시험 siderophore 생산에서 복잡 한 샘플 (즉, 토양 및 식물 조직 homogenates)의 농축을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 대량, 느슨하게 연결, 그리고 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양 조건 (어떻게 토양 루트 였던) 곡물, 촬영, 및 4 개의 뚜렷한 밀 (Triticum aestivum L.) genotypes에서 루트 조직 취득 했다: Lewjain, 매드 슨, PI561725, 그리고 PI561727입니다. 그것은 밀 genotypes 근본적인 차이 모집 및 다양 한 커뮤니티를 생산 하는 siderophore에 차이가 발생할 수 있다는 가설 했다. 특정 관심의 이다 미생물 지역 사회는 관대 알루미늄 ALMT1 (Malate 전송 1 알루미늄 활성화)를가지고 있기 때문에, PI561725 isogenic 선, 연관의 차이와 비교 알루미늄 중요 한 PI561727 isogenic 선, 유전자, almt123,,2425,26의 비-알루미늄 반응 형태를 소유 하는. 연구의 주요 목적은 미래의 일에 대 한 문화를 유지 하면서 복잡 한 샘플 형식의 siderophore 농축 문화에서 siderophore 생산 양적 평가의 간단한, 빠른 방법 개발 했다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Apex</td><td>LF451320014</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 베이킹 팬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄, 과립</td><td>Fiesher Scientific</td><td>152315A</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 및 살균기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Fiesher Scientific</td><td>171428</td><td></td></tr><tr><td>CAS (Chrome Azurol S)</td> <td>Chem-Impex Int'l Inc)</td> <td>000331-27168</td><td></td></tr><tr><td>포도당 일 수화물 (포도당), 결정 성 분말</td><td>Fiesher Scientific</td><td>1521754</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 디 소듐 염, 디 하이드레이트, 크리스탈</td><td>J.T.Baker</td><td>JI2476</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤, 무수</td><td>베이커 분석</td><td>C22634</td><td></td></tr><tr><td>HDTMA (세틸 트리메틸 암모모늄) 브로마이드</td><td>시약 세계</td><td>FZ0941</td><td></td></tr><tr><td>염산염</td><td>ACROS 유기</td><td>B0756767</td><td></td></tr><tr><td>인피니트 M200 PRO 플레이트 리더</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>철 (III) 염화물 육수화물, 99 %</td> <td>ACROS 유기</td><td>A0342179</td><td></td></tr><tr><td>실험실 흄 후드</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 인큐베이터</td><td>VWR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fiesher Scientific</td><td>27855</td><td></td></tr><tr><td>Niric Acid, (69-70)%</td><td>J.T.Baker</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>PIPES buffer, 98.5%</td><td>ACROS Organic</td><td>A0338723</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate, dibaisc, powder</td><td>J.T.Baker</td><td>J48594</td><td></td></tr><tr><td>Pyoverdine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>078M4094V</td><td></td></tr><tr><td>모래</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SI-600R Shaker</td><td>Lab Companion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, 과립</td><td>Fiesher Scientific</td><td>136539</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 펠릿</td><td>J.T.Baker</td><td>G48K53</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨, 이염기성 헵타하이드레이트, 99%</td><td>ACROS 유기</td><td>A0371705</td><td></td></tr></tbody></table>

환경 샘플에서 높은 처리량 siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 rhizosphere 토양

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (저 분자 무게 금속 화합물을 킬레이트 화) 병원 체 경쟁, 식물 성장 촉진, 그리고 크로스 왕국 신호를 토양에 철 (Fe) 생물 지구 화학적 순환에서 배열 하는 다양 한 생태 현상에 중요 하다. 또한, siderophores bioleaching 및 베어링 금속 광물 및 광 석의 bioweathering에 상업적인 관심 있습니다. 양적 평가에서 복잡 한 샘플 siderophore 생산의 급속 한, 비용 효과적이 고 강력한 수단 siderophore 활동을 포함 하 여, 소설 siderophore 생산 하는 미생물의 생태 파급 효과의 중요 한 측면을 식별 하는 키입니다. 여기에 제시 된 방법 siderophore 토양 또는 식물 조직 같은 환경 샘플에서 전술에 미생물 커뮤니티의 활동을 평가 하기 위해 개발 되었다. 샘플 했다 균질 하 고 (Fe), 없이 수정 된 M9 매체에 희석 농축 문화 3 일 동안 알을 품을 했다. Siderophore 생산에 24, 48, 및 72 시간 (h) 소설 96 잘 microplate CAS (크롬 azurol 성의)를 사용 하 여 샘플에 평가 되었다-Fe agar 분석 결과, siderophore 평가의 전통적으로 지루하고 시간이 많이 걸리는 색도계 방법의 적응 활동, 개별 재배 미생물 분리에 수행입니다. 우리 밀 (Triticum aestivum L.)의 4 가지 genotypes/라인, Lewjain, PI561725, 매드 슨, 그리고 내륙 평화로운 북 서에서 일반적으로 성장 하는 PI561727를 포함 하 여 우리의 방법을 적용. Siderophore 생산은 명확 하 게 밀, 및 식물 조직 관찰의 특정 종류는 유전자 형에 의해 영향을. 우리는 성공적으로 빠르게 siderophore 생산, 지상파와 수생 생태계에 핵심 기능 식물 유전자의 영향에 대 한 화면을 우리의 방법 사용. 우리는 매우 신뢰할 수 있는 통계적 차이가 토양 및 식물 조직 내의 저조한 많은 기술 복제, 제작. 중요 한 것은, 결과 보여 빠르게 taxa 및 기능성 유전자를 확인 후 작업 보존 사회를 허용 하는 방식으로 신뢰성의 높은 학위를 가진 복잡 한 샘플에서 siderophore 생산을 검토 하는 제안 된 메서드를 사용할 수 있습니다.

슈 도모 나 스 fluorescens 에 의해 pyoverdine 혼합물 biosynthesized 해석 하 고 흡 광도 측정 하는 표준으로 사용 되었다 (에서 420 nm) µ M. pyoverdine 해당 점에서 샘플의 그림 1 흡 광도 (420 사이 관계를 보여 줍니다. nm) 및 pyoverdine (µ M에서 로그10 몰)의 농도 시작. EDTA 샘플 전시 큰 흡 광도 측정 보다 R2 와 pyoverdine, 달성 했다 (그림 2) 낮은 때문에 적절 한 표준을 제공 하지 않았다. 630에서 siderophore 탐지 측정 된 흡 광도의 방법으로 CA Fe 분석 결과 사용 하 여 작업 초기 동안 매우 비슷한 방법을 사용 하 여 관련된 연구에서 nm (CAS-Fe-Agar 했다 혼합 1: 1는 미 판에서 ...

우리는 지구 시스템에서 미 량 영양소 bioavailability 및 매출에 기여 하는 siderophore 잠재적인 환경 샘플의 신속한 심사에 대 한 프로토콜을 제시.

환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

사이드로포어는 저분자, 금속 킬레팅 생체 분자로, 환경에서철 사이클링에 관여합니다. 이 프로토콜을 사용하면 토양 및 식물 샘플에서 측측 활성에 대한 신속한 높은 처리량 평가를 수행할 수 있습니다. 측측 검출을 위한 이전 방법은 미생물 지역 사회의 중요한 환경을 제거했습니다.우리의 기술은 상대적으로 손상되지 않은 미생물 커뮤니티와 관련된 서식지 내에서 검출할 수 있게 합니다. 철 가용성은 농업 생산성에 매우 중요 하기 때문에, 그래서이 프로토콜에서 식물에 철의 가용성을 변조에 미생물의 역할을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 토양 건강과 사이드 로포어 생산 지역 사회에 농장 관리 관행의 영향뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 이러한 지역 사회의 개발을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.시작하려면, 산성 세척 모든 유리 제품을 100 밀리머 염산 100 밀리머 질산은 CAS 분석에서 활용하기 전에 최소 2 시간 동안. 실험실급 모래로 채워진 알루미늄 베이킹 팬을 준비하고 알루미늄 호일로 덮습니다. 섭씨 121도에서 30분 간 오토클레이브를 따로 둡니다.0365 그램을 이중 증분 수의 20 밀리리터에 추가하여 HDTMA를 준비하고 용해화를 촉진하기 위해 섭씨 37도의 수조에 용액을 배치하십시오. 0302 그램의 CAS를 이중 탈이온 수의 25 밀리리터에 넣고 멸균 마그네틱 스터디 바로 부드럽게 저어줍니다. 그런 다음 1개의 어금기 철 염화물 육수형 5밀리리터를 CAS 용액의 25밀리리터에 넣고 부드럽게 저어줍니다.이제 20밀리리터의 HDTMA 용액을 철 CAS 복합 용액에 천천히 추가하면서 부드럽게 저어줍니다. 15.12 그램의 PIPES를 부드럽게 교반하여 이중 디온화 된 물의 375 밀리리터로 용해하여 완충액을 준비하십시오. 5개의 어금니 나트륨수산화물로 pH를 6.8로 조정합니다.그런 다음 물을 추가하여 450 밀리리터에 볼륨을 가져옵니다. 이제 5 그램의 아가로즈를 솔루션에 추가합니다. PIPES 버퍼 용액과 철 CAS 복합 용액을 섭씨 121도에서 30분 동안 오토클레이브합니다.각 철 CAS 복합 솔루션 전체를 생체 안전 캐비닛의 전체에 신중하게 추가하여 각 용광을 자동화한 후. 혼합 용액을 수조에 50°C로 놓습니다. 이제 멸균 시약 보트를 생물 안전 캐비닛 내에 멸균 모래에 놓고 섭씨 50도까지 가열하십시오.철 CAS 복합 식기를 보트로 옮은 다음 100 마이크로 리터를 투명한 평평한 바닥 멸균 96 웰 마이크로 플레이트의 각 우물에 신속하게 알리쿼트합니다. 이전에 준비된 수정된 M9 배지에서 800 마이크로몰러 피버딘 표준을 준비한다. 용액을 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 마이크로몰라 솔루션으로 희석합니다.EDTA를 이전에 준비한 수정 된 M9 배지의 500 밀리리터에 추가하여 3.2 밀리머 EDTA 표준을 준비하십시오. 이 솔루션을 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 마이크로몰러 솔루션으로 희석합니다. 표준 곡선을 생성하려면 각 피오버딘 및 EDTA 농도의 100 마이크로리터를 추가하여 철 CAS 복합 식기 100마이크로리터를 포함하는 96웰 마이크로플레이트의 웰을 분리합니다.각 농도의 중복 기술 복제를 만듭니다. 또한 M9만으로 빈 우물을 추가합니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 섭씨 22도에서 1, 6 및 24 시간 배양 후 흡광도를 측정하고 흡수성 측정을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 샘플링 장비를 22마이크론 필터 더블 디온화 물로 씻은 다음 70%에탄올을 만들고 종이 타월로 닦습니다.샘플링 전과 시료 사이에 세척을 수행하여 멸균 기술을 유지하고 교차 오염을 줄입니다. 식물 조직을 절제하고 현장의 식물에서 작은 루트 볼을 발굴 한 후 실험실 환경에서 샘플 분리를위해 별도의 라벨이 붙은 비닐 봉지에 루트 볼을 놓습니다. 모든 샘플을 얼음에 직접 놓고 사이드로포어 생산 분석용 시료가 처리될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.뿌리 관련 토양 샘플을 대량으로 분리하고, 느슨하게 결합된 뿌리 권토양과 단단히 결합된 뿌리권 토양으로 분리한다. 이렇게하려면, 가방에서 루트 볼을 가지고 부드럽게 루트 볼에서 토양을 흔들어. 토양을 흔들어 가방에 남아있는 토양과 함께 벌크 토양을 구성합니다.이것은 느슨하게 결합 된 뿌리 권 토양입니다. 단단히 결합 된 샘플로 뿌리를 가져 와서 원심 분리 튜브에 넣어 단단히 바운드 된 rhizopshere 토양을 생성합니다. 2~3분 동안 30밀리리터의 이중 분해물과 소용돌이를 추가합니다.뿌리를 제거하여 단단히 결합된 뿌리권 토양 슬러리 희석을 가져옵니다. 봉투를 열지 않고 토양을 가능한 한 많이 혼합하고 돌리면 샘플 백 내의 각 토양 샘플을 균질화합니다. 각 시료가 철저히 혼합된 후, 알리쿼트 및 멸균 50 밀리리터 원심분리기 관 내의 수정된 M9 배지 20밀리리터에서 각 토양 샘플의 2그램을 일시 중단한다.샘플을 희석한 다음 멸균 폼 플러그로 튜브를 밀봉하여 식기를 허용합니다. 단단히 결합된 뿌리근체 스피어 샘플을 위해, 멸균 50 밀리리터 원심분리기 관 내에 변형된 M9 배지의 20 밀리리터에 뿌리근스피어 토양 슬러리의 2밀리리터를 추가한다. 샘플을 희석한 다음 멸균 폼 플러그로 튜브를 밀봉하여 식기를 허용합니다.조직 샘플을 준비하려면 표면을 70%에탄올로 뿌리, 싹 및 곡물을 살균합니다. 30초 동안 블렌더를 사용하여 수정된 M9 배지의 20 밀리리터에서 2그램의 신선한 티슈를 마세이트합니다. 이어서, 시료를 멸균 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 희석하고, 멸균 폼 플러그로 튜브를 밀봉한다.철 제한을 통해 사이드로포어 생산을 농축하려면 실온에서 50 밀리리터 원심분리기 튜브를 배양하고 160 RPM에서 흔들어줍니다. 농축 배양을 개시한 후 24, 48 및 72시간 후에 멸균 기술을 사용하여 농축 관으로부터 1밀리리터 서브샘플을 제거합니다. 10, 000회 G에서 1분간 2밀리리터 원심분리기 튜브에서 1분간 서브샘플을 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.멸균 기술을 사용하여, 마이크로 플레이트 내에서 중복 또는 삼중판에 철 CAS 복잡한 창고의 100 마이크로 리터 용액에 상체100 마이크로 리터를 추가합니다. 또한 멸균 M9 배지 100마이크로리터를 공백으로 추가합니다. 그런 다음 섭씨 28도에서 접시를 배양합니다.각 플레이트는 인큐베이터에 배치되기 전에 호일로 밀봉되고 덮어야합니다. 각 샘플에 대한 나머지 상체및 펠릿을 자체 멸균 2 밀리리터 원심분리기 튜브로 중단합니다. 각 샘플 상피 튜브에 멸균 글리세롤 400 마이크로리터를 추가하고 글리세롤 주식을 만들기 위해 펠릿을 다시 중단합니다.나중에 분석을 위해 주식을 영하 80도에서 동결하십시오. 420 나노미터의 파장에서 6, 24, 48 및 72 시간에서 흡광도를 측정합니다. 슈도모나스 형광에 의해 생체합성된 피오버딘 혼합물은 마이크로몰라의 피오버딘 동등성 샘플에서 시료의 흡수력을 해석하고 정량화하는 표준으로 사용되었다.420 나노미터에서의 흡광도와 피버딘의 시작 농도 사이의 관계가 여기에 나와 있다. 72시간 농축의 사이드로포어 활성은 48시간 배양시 측측분리에 대한 유전자형 및 시료 유형의 영향을 결정하였다. 벌크 토양 샘플에서의 사이드로포어 활성은 상대적으로 낮았으며 벌크 토양이 샘플링된 밀 유전자형 간의 차이를 나타내지 않았다.그러나 725개의 유전자형으로부터 분리된 느슨하게 결합된 토양의 농축은 Madsen과 727의 느슨한 경계 토양과 비교하여 더 큰 사이드로포어 생산을 보였지만 Lewjain에서 는 그렇지 않았습니다. 반대로, 단단히 묶인 토양으로부터 농축된 사이드로포어 생산은 유전자형에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 곡물 조직의 농축 배양은 유전자형에 관계없이 상대적으로 낮은 사이드로포어 생산을 산출했다.Lewjain 촬영 조직의 농축은 다른 유전자형보다 현저히 낮은 측측측생산이 있었고, 725회 는 조직 배양으로 인해 더 가변적인 사이드로포어 생산이 초래되었다. 사이드로포아르 활동의 가장 큰 차이는 725가 다른 모든 유전자형보다 200% 이상 더 큰 사이드로포어 활성을 가진 루트 조직 농축 배양에서 관찰되었다. 프로토콜을 실행하는 가장 과세측면 중 하나는 CAS 철 천 마이크로 플레이트를 생성하고 사이드로포어 활성을 위한 샘플을 테스트하는 많은 단계를 완료하는 동안 무균 상태를 유지하는 것입니다.크로마토그래피 배양 기반 또는 DNA 기반 기술의 넓은 배열은 실제 마이크로티터 웰 또는 글리세롤 보존 문화에 적용하여 추가 생화확적인 검사 또는 유전적 특성화 및 대사 모델링을 위한 것입니다. 이 프로토콜 측로포어 활성을 사용 하 여 나중에 그 활동에 대 한 책임 특정 유기 체와 연결 될 수 있습니다 또는 이후 더 큰 생태 적 영향에 대 한 메커니즘으로 대상으로. 이 프로토콜은 공기, 물 및 퇴적물을 포함한 다른 환경 구획에서 수집된 샘플에서 생성된 농축 배양에서 사이드로포어 생산을 평가하기 위해 쉽게 수정될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

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이 프로토콜에 제시된 공동 문화 상호 작용 분석은 저렴하고 높은 처리량이며 간단합니다. 이 계산은 공동 배양에 있는 미생물 상호 작용을 관찰하고, 상호 작용 패턴을 확인하고, 인간과 환경 병원체에 대하여 관심있는 미생물 긴장의 억제 잠재력을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

이 프로토콜은 대량 분광화상 이미징과 결합된 박막(DGT)의 확산 그라데이션을 사용하여 다중 음순 무기 영양소 및 오염 물질 용성 종의 하위 mm 2D 시각화를 위한 워크플로우를 제공합니다. 솔루트 샘플링 및 고해상도 화학 분석은 지상 식물의 뿌리 부피에서 솔틸테의 정량적 매핑을 위해 자세히 설명된다.

토양의 2차원 시각화 및 래빌, 무기 식물 영양소 및 오염 물질의 정량화

여기에서, 우리는 재석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이 균주를 찾기 위해 토양 생물 다양성을 스크리닝하기위한 프로토콜을 제시합니다. 첫째, 휴믹산 또는 리그노셀룰로오스 상에서 성장할 수 있는 곰팡이 균주가 분리된다. 그들의 활성은 효소 분석과 탄화수소 및 플라스틱과 같은 오염 물질에 대해 테스트됩니다.

석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이에 대한 토양 생물 다양성으로부터의 분리 및 스크리닝

지열 온천에서 중금속 내성 미생물을 분리하는 것은 생물 정화 및 환경 모니터링 바이오 시스템 개발을위한 뜨거운 주제입니다. 이 연구는 온천에서 중금속 내성 박테리아를 분리하고 식별하기위한 방법 론적 접근법을 제공합니다.

환경 오염을 해결하기위한 Extremophilic 미생물의 생물 탐사

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 siderophores, pyoverdine 및 pyochelin에 대한 정성적 및 정량적 분석을 모두 제공합니다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석

이 프로토콜은 동일 시료 내에서 식물 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 평가하는 고처리량 접근법을 설명합니다.

고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 환경 샘플에서 높은 처리량 siderophore 심사 방법을 이용하여 토양과 식물 조직의 철 이용성을 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 미생물 군집 내에서 siderophore 활성을 신속하게 측정하여 농업 생산성과 토양 건강을 개선하는 데 활용됩니다.

환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양

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