Name: 극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 극저온 스캐닝 전자 현미경을 활용한 우디 식물 자일렘 물 분포 관찰 기법을. 이 방법은 샘플링 과정에서 인공물질을 제거하여 고해상도 이미지를 제공하고 식물 수분 역학 연구에 필수적인 기술입니다.

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이 작품은 JSPS KAKENHI (아니. 2012009, 20120010, 19780129, 2529210, 23780190, 237848022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H2025)

참고: 이 프로토콜의 회로도 차트는 그림1에 나와 있습니다.
1. 샘플링 : 자일렘 도관의 물 기둥 내에서 긴장 완화
참고: 다음 장력 이완 처리는 LN2 적용 전에 실렘 물 분포에서 동결 및 장력 유도 아티팩트를 모두 피하기 위해 권장됩니다.
<ol><li>분기를 동봉하고 자일렘과 샘플링 하기 전에 2 시간 이상 잎 사이의 물 잠재력을 평형 검은 비닐 봉지와 샘플링 을 위해 잎.</li>
	<li>압력 챔버 또는 사이크롬터를 사용하여 샘플로부터 적어도 2개의 잎의 물 전위를 결정한다. 물 전위가 ca. -0.5 MPa(즉, 없음 또는 매우 낮은 장력이 존재함)보다 높을 때, 시료는 동결 후 수확될 수 있다(섹션 2: 동결 고정참조). 물 전위가 -0.5 MPa보다 낮으면 아래에 설명된 대로 이완을 위한 치료가 필요합니다.</li>
	<li>물로 채워지려면 줄기 주위에 방수 칼라를 고정하십시오. 바닥이없는 플라스틱 컵은 방수 칼라역할을 할 수 있습니다. 이후에 사용되는 액체 매체의 누출을 방지하기 위해 끈적끈적한 테이프를 사용하여 스템과 칼라 사이의 공간을 단단히 밀봉하는 데 주의를 기울여야 합니다. 얇은 가지 나뭇 가지 또는 나뭇 가지와 같은 유연한 줄기를 수확하기 위해 줄기를 구부려 물이 채워진 양동이에 절단 부분을 싱크하십시오. 전정 가위 또는 톱을 사용하여 물 표면 에서 잘라. 절단 된 끝이 공기에 노출되는 것을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 다른 물 용기에 샘플을 옮김.</li>
	<li>샘플의 절단 된 끝을 물 아래에 보관하십시오. 광엽 종의 경우, SEM용 저온 샘플이 수확된 줄기의 절단 가장자리까지 얻어질 스팟의 길이가 극저온 시료 내의 장력 유발 아티팩트를 방지하기 위해 시료의 최대 용기 길이보다 길어야 합니다.</li>
	<li>잎이 들어있는 샘플을 검은 색 비닐 봉지로 덮어 증발을 줄입니다. 시료의 절단 단부는 물에 보관하고 자일렘 장력을 완화하기 위해 약 30 분 동안이 상태를 유지하십시오. 캐비테이션 도관12의인공 리필 가능성으로 인해 더 긴 휴식 시간 (>1 h)을 피하십시오.</li>
	<li>자일렘 장력의 이완을 확인하기 위해 다시 물 전위를 측정합니다 (거의 0 MPa). 참고: 샘플링전에 는 공기 주입 방법에 따라 유사한 시료로 대상 종의 최대 용기 길이를 조사하거나 결정해야 합니다. 큰 나무, 또는 큰 가지를 샘플링 할 때, 위에서 설명한 장력 완화 절차를 수행하기가 어렵습니다. 따라서, 큰 나무에서 샘플은 자일렘 물 전위가 높은 새벽 기간 동안 수집해야합니다.</li>
</ol>2. LN 2로 고정 고정
<ol><li>가위 또는 유틸리티 나이프로 방수 칼라의 한쪽면을 자르고 엽니다. 조리개를 수평으로 유지하면서 스템 주위의 칼라를 접착 테이프로 단단히 부착하십시오.</li>
	<li>절연 장갑 /장갑을 착용하지만 LN 2의 병을 안전하게 잡고 LN2를 칼라에 실행하여 LN2로채웁니다. LN 2를 꾸준히 추가하여 자일렘의 물을 완전히 얼린 상태로 유지하십시오. 동결에 필요한 시간은 샘플 크기에 따라 다릅니다. LN 2를 부은 후 1분은 작은 나뭇가지 또는 묘목을 위해 충분하며, 20분 이상은 더 큰나무(20)의줄기에 필요하다. LN2와 주변 온도 사이의 큰 온도 차이로 인해 빠르게 증발하기 때문에 냉동 중에 LN2를 지속적으로 추가하십시오.</li>
	<li>충분한 동결 시간 후에 LN 2를 제거하기 위해 샘플 스템의 냉동 부분에서 칼라를 분리합니다. 칼라를 분리하여 발생할 수 있는 LN2 유출과의 접촉을 피하기 위해 절연 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>즉시 미세 한 손으로 샘플을 수확.</li>
	<li>냉동 된 샘플을 알루미늄 호일로 덮거나 샘플 ID 번호가 기록된 샘플 튜브에 넣습니다. 수확한 시료를 LN 2로 채워진 용기에 빠르게 넣거나 드라이 아이스로 채워진 절연 상자에 포장하십시오.</li>
	<li>관찰될 때까지 샘플을 깊은 냉동실에 보관합니다. 바람직한 저장 온도는 저장하는 동안 얼음 승화 및 재결정화를 방지하기 위해 -80 °C입니다.</li>
</ol>3. 표본 준비
참고: 관찰을 위해 시료를 다듬어야 하며, 물 분포를 현장에서 자일렘에 보관하려면 관찰을 위해 표면을 영하의 온도로 계획해야 합니다. 저온 유지 시스템(cryostat)을 가진 생물학적 마이크로토임은 저온-SEM에 의한 이러한 유형의 관찰에서 시편의 표면을 트리밍하고 노출하는 데 이상적입니다.
<ol><li>냉동 상태의 시편 챔버의 온도를 -30 °C로 설정하며, 이는 일반적으로 대부분의 식물의 실렘 수액을 동결 상태로 유지할 만큼 충분히 차가운 것입니다.</li>
	<li>샘플을 극저온-SEM의 시편 홀더에 맞게 조정할 수 있는 작은 조각(높이 2cm 및 폭 또는 직경 1cm)으로 다듬어 시편의 얼음이 깨지는 것을 방지하기 위해 날카로운 칼이나 미세 톱을 사용하여 트리밍합니다. 칼로 절단 할 수없는 큰 샘플의 경우, 신속하게 냉동고 상자에 냉각 톱으로 미리 잘라.</li>
	<li>트리밍된 조각을 극저온 절편을 위해 조직 동결 포함 매체(예: OCT 화합물)에 장착하여 저온 극저온을 위한 홀더인 척에 부착합니다. 그런 다음 척을 저온 유지의 마이크로토메의 시편 홀더에 부착합니다.</li>
	<li>두께가 5-7 μm 섹션으로 반복적으로 면도하여 표면을 다듬습니다. 샘플 수집시 초기 표면으로부터 1,000 μm 이상에서 2,000 μm 이상을 절단하여 트리밍하는 것은 3.2단계에서 설명한 바와 같이 칼로 사전 절단또는 톱으로 인한 시료의 손상된 부분을 제거하는 데 유용하다.</li>
	<li>시료의 표면을 대략 다듬은 후, 시편 표면 위의 마이크로톤 블레이드의 사용되지 않는 부분을 조정합니다. 블레이드가 두께 설정을 초과하는 샘플에 닿지 않도록 하십시오.</li>
	<li>사용하지 않은 블레이드 부분에 의해 첫 번째 절단하기 전에, 시편과 블레이드의 표면 사이의 거리를 약간 넓어.</li>
	<li>시료 표면을 한두 번만 자른다. 또한 블레이드를 다시 밀어 시편 표면에 사용하지 않은 블레이드 부분을 조정합니다.</li>
	<li>3.6단계와 3.7번 3.7번 을 반복합니다. 이것은 "칼 자국"없이 명확한 표면을 얻기위해 중요합니다 (그림 4).</li>
	<li>최종 절단 후, 샘플에서 멀리 떨어진 블레이드의 위치를 설정하여 먼지가 시료에 달라붙지 않도록 합니다.</li>
	<li>시편 홀더에서 척을 분리하고 날카로운 칼로 냉동 임베딩 매체를 제거하여 척에서 시편을 분리합니다. 서리 먼지에서 계획 된 표면을 방지하기 위해 시편이 저온 챔버에 배치되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>저온 막힘 챔버에 조직 동결 매질을 가진 저온 SEM 견본 홀더에 견본을 붙입니다.</li>
</ol>4. 저온-SEM 표본 챔버로 전송
참고: 표면 제조 시편은 저온 극저온 챔버에서 극저온-SEM 시편 챔버의 관찰 단계로 이송되는 동안 온도 또는 서리축적의 증가로부터 보호되어야 합니다.
<ol><li>장비의 사용 설명서에 따라 LN 2를 사용하여 -120 °C 보다 낮은 저온-SEM 시편 챔버의 냉기 온도를 유지합니다.</li>
	<li>준비된 시편이 있는 시편 홀더를 저온 유지 챔버에 LN 2로 채워진 절연 용기에 넣습니다.</li>
	<li>LN2아래에 시편 교환 막대가 있는 시편 홀더를 잡습니다. 가능하면 시편 홀더를 공기에 노출하지 마십시오.</li>
	<li>시편 홀더를 극저온-SEM 시편 챔버의 사전 피난 챔버로 신속하게 설정하여 사전 피난 챔버의 피난을 시작하자마자. 그런 다음 공기가 완전히 배출된 후 시편 홀더를 차가운 단계에 놓습니다. 약간의 서리 축적이 불가피하지만 "동결 에칭"절차 (6 단계)는 이를 제거 할 수 있습니다.</li>
</ol>5. SEM에서 설정
참고: 관찰에 대한 일반적인 설정은 아래에 설명되어 있습니다. 진공 상태 또는 전자 빔에 따라 일부 수정이 필요합니다.
<ol><li>관찰을 위한 SEM 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. 가속 전압: 3-5 kV 시편 단계의 온도: < -120 °C 검출기: 이차 방출</li>
</ol>6. 동결 에칭
참고 : 동결 에칭은 약간의 얼음 결정 승화에 의해 샘플의 세포벽의 가장자리를 강조하는 절차입니다. 동결 에칭은 또한 표면 서리 먼지를 제거하는 것을 포함한다.
<ol><li>동결 식각 중에 전기 건의 가속 전압을 켭니다. 시편을 관찰하는 동안 동결 식각을 수행하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>시편 단계의 온도를 -100 °C로 올립니다.</li>
	<li>서리 먼지가 제거되고 자일렘 세포의 얼음 표면 수준이 세포벽에 비해 약간 감소 할 때까지 몇 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>시편 단계의 온도를 -120 °C로 낮춥시됩니다. 참고 : 시편 단계에 설치된 온도 컨트롤러가없는 경우 교환 막대를 사용하여 시편을 잡고 몇 분 동안 시편 단계에서 분리하십시오. 이 동결 식각 공정 중에 시편을 여러 번 관찰하여 시편의 승화 상태를 확인합니다.</li>
</ol>7. 금속 코팅 (선택 사항)
참고: SEM 계측기 및 이미지 처리의 최근 개선은 금속 코팅없이 전기 절연 시편의 고품질 이미지를 제공 할 수 있습니다. 그러나 생물학적 물질과 같은 비전도성 표본은 때때로 전하의 대상이 됩니다. 전자의 축적으로 인해 시편의 특정 위치에서 더 높은 밝기 ("충전"). 시편을 전자 빔에 더 오랜 시간 동안 또는 높은 배율을 위해 노출하면 충전 효과가 증가합니다. 전도성 금속 재료로 시편의 표면을 코팅하면 충전이 발생하지 않습니다. 코팅 중에 시편의 온도가 상승하지 않도록 하기 위해 저온-SEM 장치에 설치된 진공 코팅 시스템을 사용합니다.
<ol><li>코팅 재료가 코팅 시스템의 지정된 증발기 헤드에 설치되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>-170 °C 이하의 코팅 시스템에서 냉기의 온도를 유지합니다.</li>
	<li>충분한 동결 식각 후 도료 시스템의 차가운 단계에 시편 홀더를 놓습니다.</li>
	<li>차가운 스테이지와 증발기 헤드 사이의 파티션을 엽니다.</li>
	<li>증발기 헤드의 전류 값과 전압 값을 각각 30mA 및 ca. 5V로 설정합니다.</li>
	<li>시편의 표면을 코팅하기 위해 30s의 용 코팅 물질을 증발시.</li>
	<li>증발기 헤드의 전류 및 전압 값을 모두 0으로 설정하고 파티션을 닫습니다.</li>
	<li>관찰을 위해 시편 홀더를 시편 챔버의 차가운 단계에 놓습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 백서에 소개된 극저온-SEM 관찰 방법은 세포 규모의 물 분포를 명확하게 시각화하는 데 실용적입니다. 이 방법을 통해 자일렘 내의 물 분포의 변화를 탐구하는 것은 잠재적으로 비생물적 스트레스 (물 부족 또는 동결) 또는 생물학적 스트레스 (나무 질병)에 대한 수종 내성의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 방법의 가장 중요한 단계는 샘플 수집 및 후속 샘플 준비 중에 기본 물 상태의 물 분포 특성을 보존하는 것입니다. 긴 도관 (특히 고리 다공성 나무의 초기 목재 용기)가있는 종의 자일렘 조직은 수확 및 동결 중에 물을 쉽게 잃을 수 있습니다. Cochard et al. (2000)는 자일렘 도관38,41을따라 물 기둥의 높은 장력으로 인해 동결 유물을 논의하였다. 우메바야시 외(2016)는 비파괴 MRI 관측값39와</s...

수자원의 가용성 (즉, 강수량, 토양 수분 함량)은 토양에서 물을 흡수하고 광합성 생산을 위해 잎으로 운반해야하기 때문에 식물 종의 사망률과 지리적 분포를 엄격하게 결정합니다. 플랜트는 변동하는 물 공급 하에서 물 수송 시스템을 유지해야 합니다. 특히, 우디 식물은 증발 스트림을 따라 자신의 도관에 높은 장력을 생성, 어떤 경우에는, 그들은 지상 ~ 100m 이상 자신의 크라운을 개최해야합니다. 이러한 높은 음압 하에서 물 기둥을 유지하기 위해 자일렘 도관은 단단하고 소수성 결찰 된 세포벽1을가진 관형 세포의 연속체로 구성됩니다. 각 종에서 자일렘 도관의 자일렘 기능 장애에 대한 취약성은 변동하는 물 공급 하에서종 생존의 좋은 결정자이다 2. 또한, 자일렘 도관의 물 상태를 연구하는 것은 비생물성 또는 생체 학적 응력을 받는 개별 나무의 건강 상태를 평가하는 데 중요합니다. 수액 유량 또는 물 전위를 측정하면 자일렘 도관의 통합 유압 기능으로 인해 우디 플랜트의 물 상태를 추정할 수 있습니다. 또한, 자일렘 셀에서 물의 분포를 시각화하면 자일렘 유압 시스템의 개별 구성 요소의 상태를 명확히 할 수 있습니다.
자일렘 도관의 물 상태를 시각화하기위한 몇 가지 기술이 존재3. 우디 조직에서 물 통로를 관찰하기위한 고전적이고 유용한 방법은 염색에 절단 가지의 끝을 침지하거나 서있는 나무 줄기에 염료를 주입하여 물 기둥을 염색하는 것을 포함한다4. 소프트 엑스레이 사진은 또한 xylem5,6의수분의 차동 X 선 흡수 강도로 인해 슬라이스 된 나무 디스크의 물 분포를 시각화 할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 물의 움직임만을 제공하거나 물의 거시적 분포를 보여줍니다. 최근에는 마이크로 포커스 X선 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 7,8,9,10및 자기 공명 영상(MRI)11과 같은 비파괴 관찰 기술 도12는, 그대로 의 묘목 내에서 자일렘 도관에서 물의 관찰을 허용하도록 크게 개선되었다. 이러한 비파괴적 방법은 인공 절단 효과 없이 자일렘의 수상태를 관찰할 수 있고, 순차적 이미징 또는 조영제(10)를 도입하여 물 흐름 역학을 추적할 수 있다는 점에서 큰 장점이 있다. 그러나, 우리는 세포 수준 수분 함량을 확인할 수 있는 심상을 얻기 위하여 식물 화상 진찰을 위한 주문을 받아서 만들어진 MRI 또는 싱크로트론 기지를 둔 μCT를 위한 전문화한 시설을 사용할 필요가 있습니다. 또한, 싱크로트론 기반 μCT 시스템은 광 현미경 7,8,9에필적하는 높은 공간 해상도로 미세한 이미지를 얻을 수 있지만, 살아있는 세포는 고에너지 X 선13,14의방사선 . 저온 단위가 설치되는 주사 전자 현미경 (cryo-SEM)을 사용하는 것은 관찰을 위해 샘플을 파괴적으로 수확해야하지만 세포 수준에서 자일렘에서 물을 정확하게 찾는 데 매우 유용한 방법입니다. 자일렘 도관에 물을 고정하기 위해, 줄기의 일부 (즉, 나뭇 가지, 가지 또는 줄기)는 액체 질소 (LN 2)에 의해 그 자체로 동결된다. 저온-SEM에 의해 트리밍, 냉동 표본의 표면의 관측은 우리가 얼음으로 자일렘 도관에서 물을 식별 할 수있는 자일렘 구조의 고도로 확대 된 이미지를 제공합니다. 이 방법의 현저한 한계는 동일한 샘플 내에서 물 이동성의 순차적 관찰이 불가능하다는 것입니다. 그러나, 이러한 기기는 휴대용이 아니기 때문에 필드에 살고있는 나무의 순차적 관찰을위한 μCT 또는 MRI의 적용은 매우 도전적이다. 대조적으로, cryo-SEM은 세포 수준뿐만 아니라 더 미세한 구조 수준(예: 혈관 간 구덩이15,물)에서 수분 함량을 명확하게 시각화하기 위해 현장 실험에서 큰 나무에 이 기술을 사용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포간 공간16,또는 물 열(17)의거품.
저온-SEM에 의한 자일렘물을 관찰하는 많은 연구가 5,12,18,19,20,21,23으로보고되었다. Utsumi et al. (1996)은 처음에 LN 2를 스템(21)에 설정된 용기에 채우는 것을 통해 살아있는 트렁크의 동결 고정에 의해 소자렘의 관찰을 위한 프로토콜을 확립하였다. 시료의 온도는 자일렘 도관 내에서 얼음이 녹는 것을 피하기 위해 시료 수집 및 냉동-SEM 준비 동안 -20°C 이하로 유지되었다. 이 방법은 변화하는 물 정권11,12,24,25,26,변화 하의 물 분포를 명확히하기 위해 실렘에서 물을 관찰하는 데사용되었습니다. 27,28,물 분포의 계절 변화21,29,30,동결 해동 주기의 효과17,31, 32,젖은 나무5에있는 물의 분포, 수액에서 하트우드(20)로의 전환 시 물 분포의 변화, 암비 활동및 선박의 분화의 계절적 시간과정(33) 및 특정 생체 스트레스에 의해 유도 된 캐비테이션23,34. 캐비테이션에 대한 유압 전도도 및 도관 취약성도 저온-SEM35,36을사용하여 검증되었습니다. 에너지 분산X선분광법(EDX 또는 EDS)을 구비한 극저온-SEM은 물(37)을 함유하는 시편의표면에 대한 원소 분포를 연구하는데 사용되어 왔다.
높은 유압 장력 하에서 도관을 포함하는 살아있는 트렁크의 동결 고정은 때때로 도관38,39의내강에서 골절 된 얼음 결정으로 극저온 -SEM에 의해 관찰되는 인공 캐비테이션을 유발합니다. 특히, 더 길고 넓은 도관을 가진 광엽종은 수중에서실시하더라도 시료 절단에 의한 캐비테이션과 같은 장력 유발 아티팩트에 취약하다. 캐비테이션 아티팩트는 발생하는 나무 (즉, 낮 동안 샘플링) 또는 심한 가뭄 조건에서 샘플링 한 후 눈에 띄게되며 캐비테이션 발생 3,38의과대 평가로 이어질 수 있습니다. 39. 따라서, 도관에서 작동하는 장력은 예술적 캐비테이션3,12,39를피하기 위해 방출되어야한다.
시편 챔버에 설치된 칼을 사용하는 동결 파괴 기술은 종종 저온 -SEM 관찰을위해 시편 표면을 노출하는 데 사용됩니다. 그러나, 우디 식물 조직의 동결 골절 평면, 특히 보조 자일렘의 횡절편은 조직 내의 해부학적 특징과물을 명확하게 관찰하기에는 너무 거칠다 6. 시편을 다듬기위한 저온 극저온의 응용 프로그램은 샘플 표면(20,23)의신속하고 고품질의 준비를 할 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 샘플링 아티팩트의 발생없이 현장에서 다양한 종류의 자일렘 세포에서 물 분포의 전자 현미경 해상도를 제공하는 것입니다. 우리는 자일렘의 고품질 전자 현미경 을 얻기 위한 표본 표면의 샘플링, 트리밍 및 세척과 관련하여 처음 채택된 이래로 꾸준히 개선된 업데이트된 절차를 소개합니다.

<table><tbody><tr><td>코팅 재료</td><td>JOEL Ltd., 일본</td><td>골드 와이어, 0.50 &times; 1000 mm, 99.99 %, 부품 번호 125000499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MP-Z09085T / MP-51020ALS 저온 유지 장치가 설치된 JSM-6510 JSM-6510</td><td></td> Thermo Scientific CryoStar NX70 마이크로톰 블레이드 Thermo Scientific HP35 ULTRA 일회용 마이크로톰 블레이드, 3153735 조직 동결 매립 매체 Thermo Scientific Shandon Cryomatrix 임베딩 수지,<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> </td><td></td>6769006</tr></tbody></table>

극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

스캐닝 전자 현미경 설치 저온 장치(cryo-SEM)는 영하의 온도에서 시편 관찰을 가능하게 하며 액체 질소(LN)를 이용한 동결 고정 기술과 함께 식물 조직의 물 분포를 탐색하는 데 사용되어 왔습니다. 2). 우디 종의 경우, xylem 가로 절단 표면을 관찰하기위한 준비는 나무 섬유의 배향으로 인해 몇 가지 어려움을 수반한다. 또한, 자일렘 도관의 물 기둥의 높은 장력은 특히 샘플 고정 및 수집 중에 물 분포에 예술적 변화를 일으킬 수 있습니다. 본 연구에서, 우리는 저온 극저온 및 저온 -SEM을 사용하여 현장에서 우디 식물의 자일렘 내에서 물 분포를 관찰하는 효율적인 절차를 입증한다. 처음에, 샘플 수집 하는 동안, 자일렘 물 전위를 측정 하는 높은 장력이 자일렘 도관에 존재 여부를 결정 한다. 자일렘 물 전위가 낮을 때(ca. -0.5 MPa), 시료 동결 고정 중에 자일렘 도관에서 물 상태를 더 잘 보존하기 위해 장력 완화 절차가 필요합니다. 다음으로, 나무 줄기 주위에 방수 칼라가 부착되고 자일렘의 물 상태의 동결 고정을 위해 LN 2로 채워져 있습니다. 수확 후, 관찰을위한 샘플 준비 절차를 완료하는 동안 샘플이 동결 보존되도록주의를 기울여야합니다. 실렘 가로 절단 표면을 명확하게 노출시키기 위해 저온 극저온이 사용됩니다. 저온-SEM 관측에서, 동결 에칭을 위한 시간 조정은 서리 먼지를 제거하고 보기 표면에 세포벽의 가장자리를 강조하기 위하여 요구됩니다. 우리의 결과는 세포 및 세포 이하 수준에서 자일렘 내의 물 분포의 관찰을 위한 저온-SEM 기술의 적용성을 보여줍니다. 극저온-SEM과 비파괴적 관측 기법의 조합은 우디 식물의 물 흐름 역학의 탐사를 심오하게 향상시킬 것입니다.

극저온-SEM에 의해 관찰된 응비및 활엽수 자일렘의 가로 절단 표면의 대표적인 이미지는 그림2에 나와 있다. 낮은 배율에서 이미지의 검은 영역은 물이 완전히 또는 부분적으로 사라지는 구멍을 나타내고 회색 영역은 자일렘 세포벽, 세포질 및 물을 나타냅니다(그림2A). 높은 배율에서, 물은 3개의 기관지의 루미나로부터 완전히 손실되지 않는 것이 명백하며, 이는 현장에서 자일렘 수액에서 매크로 기포의 발생을 나타낸다(그림2B). 광엽 종에 대하여, 캐비테이션 발생은 혈관 내에서 쉽게 검출되는 반면, 물의 존재는 섬유 내에서 구별하기 어려운 반면, 특히 낮은 배율에서 (그림2C).</stron...

xylem 내의 물 분포를 관찰하면 우디 식물의 물 흐름 역학에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 이 연구에서는 시료 준비 중 물 상태의 실제 적 변화를 제거하는 저온 유지 및 저온 SEM을 사용하여 현장에서 자일렘 물 분포를 관찰하는 실용적인 접근 법을 보여줍니다.

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 우리에 게 전자 현미경 해상도 는 situ에서 자일렘 세포의 다양 한 종류에 물 분포의 해상도. 이 방법은 물 분포와 변화하는 물 정권, 물 분포의 계절적 변화, 동결/해동 주기의 효과, 습식 목재의 물 분포 및 특정 생물학적 스트레스에 의해 유도된 캐비테이션을 명확히 하기 위해 자일렘으로 물을 관찰하는 데 사용되어 왔다. 높은 유압 장력 하에서 살아있는 트렁크의 고정은 때때로 인공 캐비테이션을 발생, 이는 도관의 루멘에서 파열 된 얼음 결정으로 냉동 SEM에 의해 관찰된다.이 업데이트 된 절차는 샘플링 절차에서 아티팩트없이 자일렘의 고품질 의 항공 우주 현미경 그래프를 얻는 데 중점을 둡니다. 쉽게 설명 할 수없는 중요한 세부 사항이 많기 때문에 실행 가능한 데모는 매우 중요합니다. 동시에, 훈련을 얻는 것은 전 세계의 몇몇 실험실만이이 방법을 연습하기 때문에 쉽지 않습니다.이 절차를 시작하려면 검은 색 비닐 봉지로 샘플링을 위해 가지와 잎을 둘러싸서 자일렘과 샘플링 2 시간 이상 남깁니다. 압력 챔버를 사용하여 샘플에서 적어도 두 잎의 물 전위를 결정합니다. 물 전위가 약 0.5 메가파스칼보다 높을 때, 샘플을 동결 후 수확할 수 있다.물 전위가 마이너스 0.5 메가파스칼보다 낮을 때, 이완치료를 진행한다. 물로 채워질 줄기 주위에 방수 칼라를 고정합니다. 가지 치기 가위 또는 톱을 사용하여 수면 아래에서 줄기를 자르고 샘플의 절단 끝을 수중으로 유지하십시오.샘플을 가능한 한 빨리 다른 물 용기로 옮기면 절단 끝이 공기에 노출되는 것을 최소화합니다. 활엽종의 경우, 극저온 내에 장력 유도된 유물을 방지하기 위해 수확된 줄기의 절단 가장자리까지 SEM에 대한 냉동고 샘플이 수득되는 지점에서 길이가 샘플의 최대 용기 길이보다 길다는 것을 확인하십시오. 다음으로 샘플을 검은 색 비닐 봉지로 덮어 발생을 줄입니다.자일렘 장력을 이완시키기 위해 시료의 절단 끝을 물에 유지하고 약 30 분 동안이 상태를 유지하십시오. 그 후, 자일렘 장력의 이완을 확인하기 위해 다시 물 전위를 측정한다. 먼저 가위나 유틸리티 나이프를 사용하여 물가밀칼라의 한쪽을 자르고 엽니다.조리개를 수평으로 유지하면서 접착제 테이프로 줄기 주위에 칼라를 단단히 부착하십시오. 절연 장갑을 착용하고 액체 질소의 용기를 안전하게 보관하십시오. 액체 질소가 가득 차때까지 칼라에 넣고 자일렘의 물을 완전히 동결하기 위해 액체 질소를 꾸준히 추가하여 채우십시오.충분한 동결 시간 후, 액체 질소를 제거하기 위해 샘플 줄기의 냉동 부분에서 칼라를 분리한다. 즉시 미세 한 손 톱을 사용하여 샘플을 수확하십시오. 그런 다음 냉동 샘플을 알루미늄 호일로 덮거나 샘플 튜브에 다시 넣습니다.수확한 샘플을 액체 질소로 채워진 용기에 빠르게 넣습니다. 관찰을 수행할 준비가 될 때까지 샘플을 영하 80도에서 저장합니다. 시작하려면, 냉동 상태에서 대부분의 식물의 자일렘 수액을 유지하기에 충분히 추운 영하 30도 극저온의 표본 챔버의 온도를 설정합니다.날카로운 칼이나 미세톱을 사용하여 샘플을 극저온-SEM의 시편 홀더에 맞게 조정할 수 있는 작은 조각으로 다듬어보도록 한다. 다듬어진 조각을 극저온 홀더인 척에 장착하고, 극저온 단면에 티슈 동결 포함 배지를 장착합니다. 척을 극저온의 미세절의 표본 홀더에 부착합니다.5~7마이크로미터 두께의 단면을 반복적으로 면도하여 표면을 다듬습니다. 초기 표면에 대한 총 깊이1, 000 내지 2, 000 마이크로미터 이상 절단하는 것은 사전 절단으로 인한 시료의 손상된 부분을 용인시키는 데 유용하다. 시료의 표면을 대략 트리밍한 후, 시편 표면 위에 마이크로톤 블레이드의 사용하지 않은 부분을 조정합니다.시편표면과 블레이드 사이의 거리를 약간 넓어진다. 그리고 표면을 한두 번만 자른다. 그런 다음 블레이드를 다시 밀어 서 칼날의 사용하지 않은 부분을 시편 표면에 배치합니다.이 절단 처리를 3~4회 반복하여 칼 자국이 없는 맑은 표면을 얻습니다. 마지막 절단 후, 먼지가 샘플에 달라붙지 않도록 샘플에서 멀리 떨어진 블레이드의 위치를 설정합니다. 그리고 마이크로 토메에서 척을 분리합니다.다음으로, 저온-SEM 표본 홀더에 저온-SEM 표본 홀더에 저온-SEM 표본 홀더에 저온체 챔버에 조직 동결 포함 배지를 부착한다. 첫째, 장비 사용자의 매뉴얼에 따라 냉동-SEM 표본 챔버에서 영하 120°C 이하의 온도를 유지하기 위해 액체 질소를 사용합니다. 다음으로, 준비된 표본을 가진 표본 홀더를 저온챔버에 액체 질소로 채워진 절연 용기에 넣습니다.막대를 교환하는 표본을 사용하여 액체 질소 아래에 시편 홀더를 잡습니다. 시편 홀더를 냉동-SEM 표본챔버의 사전 피난실로 신속하게 이송하여 피난 전 챔버의 대피를 시작한다. 먼저 전기건의 가속 전압을 켭니다.다음으로, 표본 단계의 온도를 영하 100도까지 올립니다. 서리 먼지가 제거되고 자일렘 세포의 얼음 표면 수준이 세포벽에 비해 약간 감소할 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 그런 다음 스페우미엔 스테이지의 온도를 섭씨 영하 120도로 낮춥습니다.이 연구에서는 극저온-SEM 관측 방법이 세포 척도에서 물 분포를 명확하게 시각화하는 데 사용됩니다. 낮은 배율에서 이미지의 검은 색 영역은 물이 완전히 또는 부분적으로 사라지는 구멍을 나타내고 회색 영역은 자일렘 세포벽, 세포질 및 물을 나타냅니다. 높은 배율에서, 물이 완전히 세 기관의 루미나에서 손실되지 않는 것이 명백해진다, 현장에서 자일렘 수액에 매크로 거품의 발생을 나타내는.넓은 잎 종에 관해서는, 캐비테이션 발생은 선박 내에서 쉽게 감지되며, 물 존재는 섬유 내에서 구별하기 어렵고, 특히 낮은 배율에서 구별하기 가 어렵습니다. 세포질과 빈혈세포는 얼음 비행기 질감을 통해 기관이나 혈관 내의 물과 구별될 수 있습니다. 동결 에칭 공정에 대한 온도의 효과를 분석한 결과, 서리 먼지가 점차 승화되고, 내세피 구덩이 막은 온도가 증가함에 따라 승화의 진행을 통해 더 명확해진다.남은 큰 서리 먼지 입자는 추가 동결 에칭에 의해 제거 될 수있다. 그러나 자일렘 도관의 얼음 표면 수준을 불필요하게 감소시킬 때 문제가 될 수 있습니다. 높은 수준의 관찰은 대체로 정확한 시편 준비를 통해 달성됩니다.마이크로톤의 날카로운 블레이드로 표면의 스무딩은 특히 중요합니다. 사용된 블레이드에 의한 스무딩이 부족하면 때로는 칼 자국과 유사한 거친 표면을 만들거나 상처에서 수많은 먼지가 발생할 수 있습니다. 음의 물 기둥 압력의 이완없이 샘플 동결은 자일렘 도관에서 캐비테이션의 관절 유도를 일으킬 것이다.클러스터된 얼음 결정은 시료가 완화되지 않은 시편 용기에서 관찰됩니다. 대조적으로, 유사한 물 잠재력을 가진 편안한 견본에서 클러스터된 얼음 결정은 관찰되지 않습니다. 가뭄을 겪고있는 살아있는 식물을 발생에 동결 고정의 응용 프로그램은 클러스터 된 얼음 결정과 같은 결과 기반 유물을 유도 할 수 있습니다.이러한 유물은 자일렘 도관의 물 상태를 오해합니다. 따라서 동결 고정 전에 먼저 시료의 물 전위를 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차는 자일렘 도관의 상태를 이미지로 제공하지만 관찰을 위해 살아있는 나무를 파괴해야합니다.MRI 또는 micro-CT와 같은 다른 비침습적 관찰 방법과 자회사 수준의 이미지 관찰을 결합하면 물 운송과 사용 사이의 특성에 대한 이해가 깊어질 것입니다. 이 논문에 의해 도입된 수분 상태의 관찰은 또한 세포및 생물학적 또는 생물학적 스트레스에 대한 다른 해부학적 반응에서 혼합되는 물의 관계의 명확화를 위한 방법을 제공할 것이다. 에너지 분산 X선 분광법 또는 상단 시뮬레이션을 탑재한 Cryo-SEM은 물을 함유한 시편의 표면을 통해 원소 분포를 연구하는 데 사용되었습니다.원소 분석과 이 절차를 유사한 프레임에 결합하면 물 상태와 관련된 자일렘 세포 행동에 대한 심오한 지식을 제공할 수 있습니다. 실내에서 시료를 동결 고정하기 위해 액체 질소를 사용하는 경우 산소 결핍을 피하기 위해 방을 환기시키는 것을 잊지 마십시오.

xylem-water-distribution-woody-plants-visualized-with-cryo-scanning

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극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

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