Name: 반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 학습하세요 하이브리드 젤 큐브 장치를 이용한 3D 세포 클러스터 초기 형태 제어 방법으로 반복 가능한 패턴 형성을 달성하는 기술입니다. 특수 장비 없이 조직 공학 연구의 실험 재현성을 향상시킬 수 있습니다.

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이 작품은 JSP KAKENHI (18 H 04765) 및 임기 추적 시스템 보급, 문 부 과학성, 일본 프로그램에 의해 재정적으로 지원 되었다.

1입니다. 하이브리드 젤 큐브 장치 제조
<ol><li>폴 리카 보 네이트 (PC) 큐빅 프레임 가공 공정 또는 3D 프린터를 사용 하 여 준비 합니다. PC 프레임의 크기는 샘플의 크기에 따라 달라 집니다. 이 연구에서 우리가 사용 5mm의 프레임 양쪽에 분기 했다 경작 하는 동안 길게 하기에 충분 한 공간.</li>
	<li>사전 냉각된 유리 슬라이드 또는 얼음 상자에 다른 부드러운 표면에 PC 프레임을 배치 (< 0 ° C) (그림 1A).</li>
	<li>피 펫과 아래쪽 표면에 큐빅 프레임의 상단 면에서 미리가 열된 1.5 %agarose (w/v)의 12 µ L를 추가 합니다. 평평한 표면 (그림 1B)를 만드는 데는 agarose 확산을 피펫으로 뇌졸중.</li>
	<li>분 내는 agarose 완 치 될 것입니다. 핀셋을 사용 하 여 유리 슬라이드의 가장자리에 그것을 밀어서 PC 프레임을 선택 합니다. 참고는 수직 유리 슬라이드에서 프레임을 따기는 agarose 및 유리 슬라이드 (그림 1C) 사이의 접착 력 때문에 입방 프레임에서 agarose의 분리에 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>큐빅 프레임, 오픈 얼굴을 확인 하 고 다음 다시 (그림 1D) 유리 슬라이드에 장소를 회전 합니다.</li>
	<li>1.3-1.5 단계를 반복 하 여 3 개의 표면 agarose (그림 1E)으로 가득 차 있습니다.</li>
	<li>네 번째 및 다섯 번째 면에는 agarose 벽을 형성 하는 오픈 페이스 (그림 1 층)에서 사용는 agarose을 드롭. Agarose 벽은 다섯 번째 얼굴에 형성 하 고, 일단은 HGC 준비 완료 됩니다.</li>
</ol>2. 사진 평판 또는 가공 공정에 의해 micromolds의 제조
<ol><li>사진 평판으로 제조<ol>
<li>클린 아세톤, 이소프로필 알코올 (IPA)와 초음파 청소를 통해 실리콘 (Si) 웨이퍼 다음 증류수 (디) 각 5 분. 질소 질소로 Si 웨이퍼를 불고, 후 오븐에서 20 분 (그림 2A(i)) 동안 140 ° C에 탈수.</li>
		<li>스핀 코트 LOR Az 등 희생 층 Si 웨이퍼에 저항 (2000 rpm, 30 s) 노란 조명 아래에서 spin coater를 사용 하 여. 스핀 코팅 후 즉시 3 분 (그림 2A(ii)) 동안 90 ° C에 뜨거운 접시에 웨이퍼를 열. 희생 층의 원하는 두께 리프트 과정을 수행할 수 있습니다 쉽게, 하지만 정확한 두께 필요 이상의 1 µ m를.</li>
		<li>70 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓고 핸드 롤러 (그림 2A(iii))를 사용 하 여 희생 레이어에 원하는 두께가 두꺼운 부정적인 감광 시트를 라미네이트</li>
		<li>박판, 후 5 분 자외선 노출에 대 한 마스크 aligner에 웨이퍼를 놓습니다. 시트 저항에 원하는 패턴으로 포토 마스크를 설정 하 고 적절 한 시간 동안 자외선과 노출. 노출 시간 감광 제 두께 UV 빛의 강도 의해 결정 됩니다. 그 후, 10 분 (그림 2A(iv))에 대 한 90 ° C에서 굽기 다음 5 분 동안 60 ° C에서 사후 노출 빵에 대 한 뜨거운 접시에 웨이퍼를 배치</li>
		<li>노출 되지 않은 지역 (약 20 분)를 완전히 해산 될 때까지 프로필 렌 글리콜 monomethyl 에테르 아세테이트 (PGMEA)에 웨이퍼를 immersing 하 여 부정적인 감광 제를 개발 (그림 2A(v)).</li>
		<li>리프트 오프는 미세 초음파 청소를 위한 IPA를 사용 하 여 희생 층을 분해. 미세 웨이퍼에서 벗는, 일단 10 분 (그림 2A(vi))에 대 한 초음파 청소 하 여 디 물으로 씻어.</li>
		<li>완전히 밖으로 건조 상 온 (약 20 ℃)에서 30 분 동안 MPC 폴리머의 30 µ L에서 금형을 담가. 그림 2B 조작된 프리즘 형을 보여줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실린더 형의 제작<ol>
<li>원하는 크기와 강철 실린더 형 머시닝 프로세스에 의해 조작. 또는 사용 하는 상용 스테인리스. (본이 연구에서는 φ 600 µ m 실린더 사용 됩니다.)</li>
		<li>완전히 밖으로 건조 상 온 (약 20 ℃)에서 30 분 동안 MPC 폴리머의 30 µ L의 실린더 스틸을 담가.</li>
		<li>기본 수 지와 그것의 촉매를 혼합 하 여 액체입니다 (PDMS)를 준비 ( 재료의 표참조) 20 분 동안 시스템을 degassing 진공 기체 제거 다음 10:1 비율에서. 다음 12 잘 판에는 PDMS를 붓는 다.</li>
		<li>설정 강철 실린더 데이텀 표면에 수직 하 고 고정 선형 z 단계를 12-잘-접시 z 단계를 이동 하 여 동일한 데이텀 표면에 배치 uncured PDMS 표면에 수직으로 삽입 될 수 있다. 치료를 위한 90 ° C에서 20 분 동안 오븐에 실린더 강철 PDMS를 품 어. PDMS는 피펫으로 다음 과정 (그림 2C)에 삽입 될 수 있도록 측면 서피스를 잘라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 제어는 히드로에서 초기 셀 클러스터 모양을
<ol><li>문화 공간 (그림 3A)을 채우기 위해 HGC에 콜라겐 등 인공 지하실 막, 원하는 세포 배양에 대 한 적절 한 ECM를 삽입할.</li>
	<li>설정 조작된 micromold는 HGC에 직접 또는 간접적으로 적절 한 홀더를 가진 그림 3B와 같이. 그 후, 그것을 치료에 대 한 37 ° C에서 25 분 CO2 배양 기에는 HGC를 놓습니다.</li>
	<li>ECM (그림 3C)을 악화 하지 않는다 그래야는 micromold 밖으로 조심 스럽게 들어올립니다. 주머니, 원하는 형 모양으로 것 이다 날조 될 ECM에.</li>
	<li>트립 신-EDTA 또는 세포 유형에 따라 그에 상응 하 여 배양된 접시에서 세포를 수확. 그 후, 원심 농축된 세포를 세포 (NHBE 문화, 0.25 %trypsin-EDTA 적용 및 셀 3 분 동안 품 어 다음 매체 FBS를 포함 하 고 4 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuging와 중화).</li>
	<li>Centrifuging, 후 셀, 압축 하는 표면에 뜨는 매체를 제거 하 고 ECM (그림 3D)에 있는 주머니에 매우 집중된 셀 (3.0 × 104 셀 / µ L NHBE 세포에 대 한)를 주입 합니다.</li>
	<li>세포는 micromolds에 의해 만들어진 공간을 채우기 위해 ECM 주머니에 대비한 37 ° C에서 20 분 CO2 배양 기에 셀 HGC를 품 어. 과도 한 매체 또는 셀 위쪽 표면에 존재 하는 경우 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>24 잘 판에는 HGC를 놓고 적절 한 매체 (그림 3E)의 100 µ L를 추가 합니다. NHBE 세포에 대 한 상용 전문된 매체의 1:1 혼합물을 사용 하 여 NHBE 및 내 피 세포 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>주사는 ECM에 주머니를 닫고 다음 25 분 동안 37 ° C에서 품 어 추가 ECM.</li>
	<li>실내 온도 (대략 20 ° C)에 preheated 1.5 %agarose 식혀. 약 10 µ L 표면을 경작 하 고 (그림 3 층) 이미징 동안에 HGC 떨어지는에서 ECM을 방지 HGC의 위쪽 표면에 agarose의 드롭. 그런 다음 치료는 agarose를 37 ° C에서 또 다른 20 분 HGC를 품 어.</li>
	<li>삼투성 압력에 HGC 내부 세포에 영양을 제공 하 수 있도록 전체 HGC 커버를 추가 합니다.</li>
</ol>4. 다 방향 영상
<ol><li>다 방향 관측에 의해 비-침략 적 3 차원 형상 인식<ol>
<li>문화 접시 또는 잘 접시 포함 하는 현미경에 HGC 놓고 카메라 프레임에 HGC 방향을 지정 합니다. 그런 다음, 밝은 분야 또는 단계 대비 하 여 샘플 이미지를 얻을.</li>
		<li>선택 하 고 아래로 다른 서피스를 HGC 회전.</li>
		<li>4.1.1와 4.1.2 단계를 반복 하 여 모든 6 개 사이드 로부터 이미지를 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다 방향 관측 하 여 면역 형광 이미징<ol>
<li>고정, 적용 4 %paraformaldehyde 샘플에 실내 온도 (대략 20 ° C)에 HGC 이상 20 분, 10 분에 대 한 PBS의 두 린스 다음.</li>
		<li>PBS 가진 HGC permeabilize 4 ° C에서 10 분에 대 한 Triton X-100 다음 PBS 가진 10 분 동안 3 배 세척 0.5% 포함 된.</li>
		<li>만약 버퍼에 10% 염소 혈 청으로 HGC를 품 어 (0.2% 트라이 톤 X-100, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.05 %PBS 트윈-20) 기본 차단 단계에 대 한 실 온에서 60 분에 대 한.</li>
		<li>특정 분자의 얼룩에 대 한 적절 한 항 체를 사용 합니다. 관찰 하기 위해 집단 셀 형상, 알 렉 사 Fluor 488 Phalloidin 말라 얼룩을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>레이저 또는 형광 현미경 유리 하단 접시에는 HGC를 놓고 전체 샘플 이미지를 얻기 위해 6 측면에서 검색을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li>
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<li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
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<li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li>
<li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+in+Cube%3A+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li>
<li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li>
<li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li>
<li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li>
<li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
</ol>

저자와 오사카 부립 대학 규슈 공업 대학교 하이브리드 젤 큐브 장치, 그리고 일본 의료 및 화학 기기 (주)에 대 한 특허 출원을 신청한, 일본 최근 큐브를 상용화 했다. 회사는 디자인, 프로세스 및 기술 된 방법의 영향을 주지 않았다.

이 문서에 소개 된 방법은 간단 하 고 높은-기술 장비 없이 수행할 수 있습니다. 동시에, 히드로의 3D 공간에서 정확한 셀 클러스터 모양을 제어 결과 얻을 수 있습니다. 초기 제어 후 셀 만큼 그들은 접시에 교양으로 HGC에서 성장할 수 있다. 다 방향 영상 HGC 어떤 현미경 시스템을 사용 하 여 함께 샘플을 회전 하 여 수행 되 고 크게 이미징 품질을 향상 시킵니다. HGC 프레임 및 micromold에 대 한 자료의 선택은 그들은 생체로 서 유연한입니다. 3D 프린터의 정확도 그들의 응용 프로그램에 대 한 충분 한 경우 HGC 프레임 또는 micromold를 생산 하는 3 차원 프린터를 사용할 수 있습니다. 제안된 된 방법 투명도 약20,21 및 빛 시트 현미경 시스템 등의 기술을 강화 하는 많은 이미지와 호환 됩니다. 이러한 기술을 채용 하 여 이미지 품질을 개선할 수 있습니다.
<p class="jove_c...

2D 문화 보다 더 나은 생물 환경 모방, 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화1,2,3에 상당히 강조 했다. 세포와 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용 morphogenesis4,5에 관한 중요 한 단서를 제공합니다. 많은 조직 형성 접는 과정6,7, invagination8, 관 형성9,10등 3D 환경 아래 에서만 나타날 수 있습니다. 그러나, 수많은 어려움 2D 실험에서 3D 실험 접시에 이동에서 연구원을 방지 합니다. 3D 실험에 큰 어려움 중 하나는 이미징 3D 샘플 문제입니다. 평면 실험에 비해, 적절 한 3D 이미지의 수집 아직도 많은 경우에 도전 이다. 특히, 적절 한 3D 이미지를 얻는 때 어려운 작업 샘플 크기 때문에 낮은 확대 렌즈의 큰 초점 깊이 밀리미터 범위에 도달. 단일 셀의 크기는 일반적으로 10 µ m 10 배 확대 렌즈를 사용할 때 예를 들어 초점 깊이 50 µ m에 도달 합니다. 이미지 품질을 향상 시키기 위해, 높은-기술 현미경 시스템 개발 되 고 있다 (예를 들어, 두 광자 현미경11 및 빛 시트 현미경 시스템12), 하지만 그들의 가용성 때문에 그들의 비싼 가격 제한 됩니다. 대신, 우리는 이전 하이브리드 젤 큐브 (HGC) 장치13를 개발 했습니다. 장치 hydrogels 두 가지 유형의 구성: 지원 젤과 콜라겐 등 ECM 또는 문화 젤으로 Matrigel agarose. HGC는 경작 하는 동안 샘플을 수집 하 고14의 초점 깊이 문제 해결 하는 다 방향 영상을 달성 하기 위해 큐브를 회전 수 있습니다.
3D 실험에서 또 다른 어려움은 그들의 낮은 반복성 3D 환경의 가난한 제어력 때문 이다. 플라스틱 접시에 평면 문화와 달리 초기 문화 조건에 변화는 쉽게 부드러운 소재에 의해 포위 하는 3D 공간에서 발생 합니다. 실험 결과에 중요 한 변화 악화 다음 분석 하 고 근본적인 메커니즘을 마스크. 많은 공학 기술 공간 bioprinting15,16,17과 비 계18, 섬유와 같은 단일 셀에 맞게 개발 되었습니다 하지만 그들은 복잡 한 전처리 필요 하거나 특별히 설계 된 장비입니다. 반면, 우리 HGC19에서 3D 셀 맞춤을 달성 하기 위한 방법론을 개발 했습니다.
이 프로토콜에서 우리는 HGC에 3D 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 일반적으로 사용된 하는 장비와 간단한 절차 설명. 첫째, HGC는의 제작 과정을 시연 했다. 다음, 사진 평판 또는 가공 공정에 의해 조작 하는 micromolds는 ECM에서 임의의 모양 가진 주머니 생산 HGC에 배치 했다. 그 후, 원심 분리 후 고집적 세포는 HGC에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하는 주머니에 주입 했다. 정확 하 게 제어 셀 클러스터는 HGC 때문에 여러 방향에서 몇 군데 될 수 있습니다. 정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 세포 이미징 품질 향상을 위한 여러 방향에서 초기 셀 클러스터 모양 제어 및 이미징의 보여 주기 위해 사용 되었다.

<table><tbody><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Corning&nbsp; Inc.</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-메톡시-1-메틸에틸 아세테이</td>트 <td>후지필름 Wako Pure Chemical Co.</td><td>130-10505</td><td>PGMEA, CAS: 108-65-6&nbsp;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 4%</td><td>후지필름: Wako Pure Chemical Co.</td><td>161-20141</td><td>CAS: 30525-89-4</td></tr><tr><td>아가로스, 저겔화 온도&nbsp; 생물 시약</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 488 팔로이딘</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>AZ1512</td><td>머크</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BEGM 총알 키트</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>NHBE 세포 용 특수 배지</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 용액 (10 %)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 총알 키트</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>내피 세포 전문 배지</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF co.</td><td></td><td>MPC 폴리머</td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소 기저막 매트릭스</td><td>Corning&nbsp; Inc.</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (10%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>Normal human bronchial epithelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2541</td><td></td></tr><tr><td>SILPOT 184 W/C</td><td>Dow Corning Co.</td><td></td><td>3255981 PDMS용 염기 수지 및 촉매</td></tr><tr><td>SUEX D300</td><td></td><td>DJ MicroLaminates, Inc</td><td>두꺼운 네거티브 포토레지스트(두께: 300mm)</td></tr><tr><td>Triton X-100(1%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA(0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3d 셀 클러스터 제어

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

생체 외에서 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화에 상당히 강조 했다. 그러나, 실험적인 반복성의 부족의 제한 중 하나입니다. 패턴 형성의 몇 반복 결과 악화 자기 조직 기본 메커니즘의 분석. 셀 밀도 등은 세포 외 기질 (ECM)에 배포 초기 문화 조건에 변화를 줄이는 것은 3D 문화의 반복성을 향상 시키기 위해 중요 한. 이 문서에서는 높은 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 간단 하지만 강력한 절차를 설명 합니다. 원하는 모양으로 micromold 사진 평판 또는 머시닝 프로세스를 사용 하 여 조립 되었다 그리고 그것은 하이브리드 젤 큐브 (HGC)에 포함 된 ECM에서 3D 포켓을 형성. 셀 클러스터 모양이 조작된 형 모양으로 일치 되도록 농축된 셀 했다 다음 주머니에 주입 됩니다. 고용된 HGC 허용 다 방향 회전, 저 배율 렌즈를 사용 하더라도 고해상도 이미징 및 전체 조직 구조의 캡처를 사용 하도록 설정 하 여 검색. 정상적인 인간의 기관지 상피 세포는 방법론을 설명 하기 위해 사용 되었다.

정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 셀 그림된 방법론을 설명 하 고 실린더 모양 및 ECM 환경에서 각각 프리즘 모양 초기 집단 셀 형상을 제어 하 사용 되었다. 단계 대조로 phalloidin 실린더 모양 (그림 4AB)와 (그림 4CD) 프리즘 모양의 얼룩 다 방향 이미징 결과 표시 됩니다. 셀은 ECM 환경에서 원하는 3D 형태를 적절 하 게 정렬 됩니다. 그 후, 세포는 4 일 특정 모양에 대 한 교양 되었고 다 방향 영상에 의해 분석 되었다. 큰 샘플 크기 어려운 꽤 한 방향;에서 전체 조직 이미지 그러나, HGC는 전체 조직 모양을 드러내는 영상 최대 6 개의 측면에서 허용. 그림 5 는 NHBE 세포에서 개발 기관지 나무의 immuno...

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

이 프로토콜은 특수 장비를 사용하지 않고 3D 세포 배양 모델의 신뢰성을 향상시키는 간단한 방법을 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 입방 장치 내의 초기 배양 상태를 제어하여 반복 가능한 3D 배양 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. 5 mm 5 mm 폴리 카보네이트 입방 프레임을 준비 한 후, 미리 냉각 된 슬라이드와 얼음 상자에 프레임을 배치하고 피펫을 사용하여 입방 프레임의 상단 면에서 1.5 % 아가로즈의 12 마이크로 리터를 하단 표면에 추가합니다.아가로즈를 확산하여 평평한 표면을 얻고 중합체가 치료할 수 있도록 한다. 핀셋을 사용하여 프레임을 유리 가장자리로 밀어 넣고 프레임을 회전하여 프레임을 슬라이드에 다시 배치하기 전에 열린 쪽을 아래로 향하도록 합니다. 프레임의 다음 두 표면을 더 많은 아가로즈로 채운 후, 방금 설명했듯이, 아가로즈를 열린 얼굴에서 용기에 떨어뜨려 네 번째와 다섯 번째 면에 아가로즈 벽을 형성합니다.초기 세포 클러스터 형상을 설정하려면 하이브리드 젤 큐브 배양 공간에 관심 있는 세포 배양에 적합한 세포외 매트릭스를 주입하고 조각된 마이크로 몰드를 큐브에 설정한다. 그런 다음 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 25분 동안 배치합니다. 세포 외 매트릭스가 경화되면 매트릭스가 악화되지 않도록 마이크로 몰드를 조심스럽게 들어 올립니다.원하는 금형 모양의 포켓은 세포 외 매트릭스에서 제작됩니다. 세포를 로드하기 위해 적절한 실험 세포 배양 배지에서 원심분리 후 실험 세포 현탁액을 농축하고 세포 외 매트릭스 내의 포켓에 세포를 주입한다. 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 큐브를 배치하여 세포가 세포외 매트릭스 주머니에 빠질 수 있도록 하여 마이크로 몰드에 의해 생성된 공간을 채웁니다.인큐베이션의 끝에, 큐브를 24웰 플레이트의 1웰에 넣고 적절한 세포 배양 배지의 100 마이크로리터를 우물에 첨가한다. 추가 세포 외 매트릭스를 주입하여 주머니를 닫고 큐브를 인큐베이터로 25 분 동안 반환합니다. 세포외 매트릭스가 경화되면 섭씨 20도의 약 10 마이크로리터가 큐브에 상부 표면에 떨어뜨려 표면을 닫고 섭씨 37도에서 10~20분 동안 낙하를 치료한다.그런 다음 큐브 내의 세포에 영양전달을 용이하게 하기 위한 삼투압을 촉진하기 위해 신선한 배지로 큐브 전체를 덮습니다. 다방향 관찰에 의한 비침습적 3D 형상 인식의 경우, 플레이트를 현미경 단계에 배치하고 핀셋을 사용하여 큐브 서비스를 회전시켜 캡처 사이에 이미지화하여 밝은 필드 또는 위상 대비 현미경으로 큐브의 각 측면의 이미지를 얻습니다. 다방향 관찰에 의한 면역형성 이미징의 경우, 먼저 큐브를 함유하는 우물에서 상류체를 흡습하고 실온에서 20분 동안 4%파라포름알데히드로 큐브를 고정시한다.고정이 끝나면 PBS로 큐브를 두 번 세척한 후 10분간 세척합니다. 큐브를 0.5% 트리톤 x-100, PBS는 섭씨 4도에서 10분 동안 접종합니다. 다음으로, PBS에서 세척당 10분 동안 큐브를 세 번 세척한 후, 상온에서 염소 혈청 및 면역 형광 완충제와의 비특이적 결합을 차단합니다.그런 다음 표준 항체 염색 프로토콜에 따라 관심있는 적절한 1 차 항체로 세포를 얼룩지게한다. 그런 다음 레이저 또는 형광 현미경으로 큐브의 모든 6 면을 이미지화합니다. 이러한 대표적인 실험에서 정상적인 인간 기관지 상피 세포로 배양된 하이브리드 젤 큐브의 다방향 이미징은 배양물의 위상 대비 및 면역형이미징에 의한 초기 원통형 또는 프리즘 형 세포 배양의 생성을 보여준다.여기서 는 하이브리드 겔 큐브에서 원통형 형상으로 처음 조절된 정상 인간 상피 세포의 면역 염색이, 기관지 나무의 생성 후 나타난다. 가지는 다차원 이미징에 의해 드러난 원통형 축에 수직을 보여줍니다. 세포의 낮은 밀도가 인큐베이션 후 세포 품질의 저하를 초래할 수 있기 때문에 세포 외 매트릭스 포켓에 세포의 고밀도를 주입하는 것이 중요합니다.이러한 방법 패턴은 다방향 이미징에 의한 정량적 측정을 통해 3D 세포 패턴의 반복 형성으로 식기 개발 메커니즘을 연구한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

이 문서는 조직 공학에 대 한 셀 정렬을 조절 하는 동심 셀-라덴 히드로에 연속 되지 않은 그라데이션 정적 긴장을 제공 하는 간단한 방법을 소개 합니다.

그라데이션 변형 칩 셀 라덴 히드로에 자극 세포 행동에 대 한

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

여기서 우리는 DNA 프로그래밍 된 접착력을 사용하여 단일 세포 해상도에서 마이크로 패턴 세포에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 벤치탑 포토리소그래피 플랫폼을 사용하여 유리 슬라이드에 DNA 올리고뉴클레오티드 패턴을 만든 다음 상업적으로 사용할 수 있는 보완적인 올리고뉴클레오티드로 세포막을 라벨로 표시합니다. 올리고스의 혼성화는 프로그램된 세포 접착을초래한다.

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

세포 스페로이드는 생물학적 응용 분야에서 하나의 잠재적 모델로 간주되어 왔습니다. 이 기사에서는 균일한 세포 스페로이드를 견고하고 신속하게 제조할 수 있는 효율적인 방법을 제공하는 3D 음향 조립 장치를 사용하여 세포 스페로이드를 확장 가능하게 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

세포 스페로이드의 대량 생산을 위한 3차원 음향 조립 장치

과립 하이드로겔 내부 및 계면으로의 3D 세포 이동에 대한 정량적 평가를 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

학습하세요 하이브리드 젤 큐브 장치를 이용한 3D 세포 클러스터 초기 형태 제어 방법으로 반복 가능한 패턴 형성을 달성하는 기술입니다. 특수 장비 없이 조직 공학 연구의 실험 재현성을 향상시킬 수 있습니다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

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