반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어
March 21st, 2019
우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.
이 프로토콜은 특수 장비를 사용하지 않고 3D 세포 배양 모델의 신뢰성을 향상시키는 간단한 방법을 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 입방 장치 내의 초기 배양 상태를 제어하여 반복 가능한 3D 배양 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. 5 mm 5 mm 폴리 카보네이트 입방 프레임을 준비 한 후, 미리 냉각 된 슬라이드와 얼음 상자에 프레임을 배치하고 피펫을 사용하여 입방 프레임의 상단 면에서 1.5 % 아가로즈의 12 마이크로 리터를 하단 표면에 추가합니다.
아가로즈를 확산하여 평평한 표면을 얻고 중합체가 치료할 수 있도록 한다. 핀셋을 사용하여 프레임을 유리 가장자리로 밀어 넣고 프레임을 회전하여 프레임을 슬라이드에 다시 배치하기 전에 열린 쪽을 아래로 향하도록 합니다. 프레임의 다음 두 표면을 더 많은 아가로즈로 채운 후, 방금 설명했듯이, 아가로즈를 열린 얼굴에서 용기에 떨어뜨려 네 번째와 다섯 번째 면에 아가로즈 벽을 형성합니다.
초기 세포 클러스터 형상을 설정하려면 하이브리드 젤 큐브 배양 공간에 관심 있는 세포 배양에 적합한 세포외 매트릭스를 주입하고 조각된 마이크로 몰드를 큐브에 설정한다. 그런 다음 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 25분 동안 배치합니다. 세포 외 매트릭스가 경화되면 매트릭스가 악화되지 않도록 마이크로 몰드를 조심스럽게 들어 올립니다.
원하는 금형 모양의 포켓은 세포 외 매트릭스에서 제작됩니다. 세포를 로드하기 위해 적절한 실험 세포 배양 배지에서 원심분리 후 실험 세포 현탁액을 농축하고 세포 외 매트릭스 내의 포켓에 세포를 주입한다. 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 큐브를 배치하여 세포가 세포외 매트릭스 주머니에 빠질 수 있도록 하여 마이크로 몰드에 의해 생성된 공간을 채웁니다.
인큐베이션의 끝에, 큐브를 24웰 플레이트의 1웰에 넣고 적절한 세포 배양 배지의 100 마이크로리터를 우물에 첨가한다. 추가 세포 외 매트릭스를 주입하여 주머니를 닫고 큐브를 인큐베이터로 25 분 동안 반환합니다. 세포외 매트릭스가 경화되면 섭씨 20도의 약 10 마이크로리터가 큐브에 상부 표면에 떨어뜨려 표면을 닫고 섭씨 37도에서 10~20분 동안 낙하를 치료한다.
그런 다음 큐브 내의 세포에 영양전달을 용이하게 하기 위한 삼투압을 촉진하기 위해 신선한 배지로 큐브 전체를 덮습니다. 다방향 관찰에 의한 비침습적 3D 형상 인식의 경우, 플레이트를 현미경 단계에 배치하고 핀셋을 사용하여 큐브 서비스를 회전시켜 캡처 사이에 이미지화하여 밝은 필드 또는 위상 대비 현미경으로 큐브의 각 측면의 이미지를 얻습니다. 다방향 관찰에 의한 면역형성 이미징의 경우, 먼저 큐브를 함유하는 우물에서 상류체를 흡습하고 실온에서 20분 동안 4%파라포름알데히드로 큐브를 고정시한다.
고정이 끝나면 PBS로 큐브를 두 번 세척한 후 10분간 세척합니다. 큐브를 0.5% 트리톤 x-100, PBS는 섭씨 4도에서 10분 동안 접종합니다. 다음으로, PBS에서 세척당 10분 동안 큐브를 세 번 세척한 후, 상온에서 염소 혈청 및 면역 형광 완충제와의 비특이적 결합을 차단합니다.
그런 다음 표준 항체 염색 프로토콜에 따라 관심있는 적절한 1 차 항체로 세포를 얼룩지게한다. 그런 다음 레이저 또는 형광 현미경으로 큐브의 모든 6 면을 이미지화합니다. 이러한 대표적인 실험에서 정상적인 인간 기관지 상피 세포로 배양된 하이브리드 젤 큐브의 다방향 이미징은 배양물의 위상 대비 및 면역형이미징에 의한 초기 원통형 또는 프리즘 형 세포 배양의 생성을 보여준다.
여기서 는 하이브리드 겔 큐브에서 원통형 형상으로 처음 조절된 정상 인간 상피 세포의 면역 염색이, 기관지 나무의 생성 후 나타난다. 가지는 다차원 이미징에 의해 드러난 원통형 축에 수직을 보여줍니다. 세포의 낮은 밀도가 인큐베이션 후 세포 품질의 저하를 초래할 수 있기 때문에 세포 외 매트릭스 포켓에 세포의 고밀도를 주입하는 것이 중요합니다.
이러한 방법 패턴은 다방향 이미징에 의한 정량적 측정을 통해 3D 세포 패턴의 반복 형성으로 식기 개발 메커니즘을 연구한다.
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개요
이 프로토콜은 3D 세포외 기질에서 세포 클러스터의 초기 모양을 조절하여 반복 가능한 패턴 형성을 촉진하는 방법을 제시합니다. 두 가지 다른 하이드로겔이 있는 입방체 장치를 사용하여, 이 기술은 조직 패턴 형성에 대한 다방향 이미징을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 조직 공학
배경
- 3D 세포 배양 모델은 조직 발달을 연구하는 데 필수적입니다.
- 초기 배양 조건을 조절하면 실험의 신뢰성을 향상시킬 수 있습니다.
- 하이드로겔은 생체 적합성으로 인해 조직 공학에서 일반적으로 사용됩니다.
- 다방향 이미징은 조직 형성에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다.
연구 목적
- 특수 장비 없이 3D 세포 배양을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 세포 클러스터에서 일관된 패턴 형성을 달성합니다.
- 향상된 이미징 기능을 위해 입방체 장치를 활용합니다.
사용된 방법
- 세포 배양을 위한 폴리카보네이트 입방체 프레임 준비.
- 평평한 표면을 만들기 위해 예열된 아가로스 도포.
- 벽을 형성하기 위해 입방체 프레임을 아가로스로 순차적으로 채우기.
- 프레임의 정밀한 조작을 위해 핀셋 사용.
주요 결과
- 안정적인 3D 세포 배양 환경의 성공적인 창출.
- 세포 클러스터에서 반복 가능한 패턴 형성 관찰.
- 다방향 이미징을 위한 하이드로겔의 효과적인 사용.
- 조직 연구에서 실험 결과의 신뢰성 향상.
결론
- 이 방법은 3D 세포 배양에 대한 간단한 접근 방식을 제공합니다.
- 초기 조건을 조절하는 것이 재현성을 위해 중요합니다.
- 이 기술은 다양한 조직 공학 응용에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Reliable 3D cell culture models are critical for early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D, yet reproducibility remains a major barrier. This hybrid gel cube device enables precise control of initial cell cluster shape and density, directly addressing variability in pattern formation and supporting robust hypothesis testing. Enhanced repeatability in 3D cultures strengthens predictive confidence and informs portfolio triage at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of self-organization mechanisms by minimizing initial condition variability.
- Supports functional target validation through repeatable 3D pattern formation.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing controlled manipulation of cell cluster geometry.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized 3D biological systems for downstream screening workflows.
- Improves assay reproducibility by controlling cell density and spatial distribution in ECM.
- Enables quantitative imaging outputs for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant tissue architecture for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing robust, repeatable preclinical data.
- Facilitates biomarker discovery through high-resolution, multi-directional imaging.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and assay development, providing a foundation for lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Reduces experimental noise in hypothesis testing and pathway analysis by standardizing initial 3D culture conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for high-content analysis.
- Analytics: Enables multi-directional imaging and quantitative measurement of 3D pattern formation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by replicating tissue-like structures.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable platform for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D culture studies.
- Operational Value: Standardizes workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and ECM handling.
- Needs access to basic cell culture and imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of cell density and mold fabrication protocols.
- Adaptable to various cell types and ECM compositions with protocol optimization.
- Dependent on high cell density for optimal pattern fidelity and viability.
