Name: Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 배우세요 CRISPR 기술을 활용하여 긴 비암호화 RNA의 여러 스플라이스 변이체를 과발현하는 방법을. 내인성 스플라이싱 기계를 이용하여 세포에서 자연스러운 아이소폼을 발현시키는 이 기법은 유전자 기능 연구에 필수적입니다.

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C.P.는 RO1 DK60729 및 P30 DK 41301-26에 의해 지원 됩니다. D.P.는 크 론 & Colitis 재단 (CCFA) 경력 개발 상, 치료에 의해 지원 됩니다: 소화기 질환 연구 센터 (DDRC) DK41301, 그리고 UCLA 임상 및 변환 과학 연구소 (CTSI) UL1TR0001881. Ucla의 바이러스학 코어로는 센터의 에이즈 연구 (CFAR) 투자 되었다 5 P 30 AI028697를 부여. 핵심 치료/P30에 의해 지원 되었다 UCLA 통합 분자 기술 DK041301를 부여 합니다. 이 작품 또한 UCLA 에이즈 연구소에 의해 지원 되었다.

참고: 이 프로토콜에서는 복제 불충분 한 lentiviruses 중요 하다. 적절 한 실험실 안전 훈련 후에 바이러스 처리를 수행 합니다. 모든 항목 및 표면 처리 후 최소 10 분에 대 한 라이브 바이러스 접촉에 표 백제. 사용 일회용 랩 코트와 얼굴/눈 보호로 이중 장갑, 항상. Biosafety 수준 2 + 실험실 바이러스 인증 바이러스 작업을 수행 합니다. 바이러스 성 일 조직 문화 후드와 인큐베이터를 칩니다.
1. 벡터 디자인 및 생성
참고: GRNA 시퀀스를 식별 하는 가장 좋은 방법은 온라인 설계 도구 (예: http://crispr-era.stanford.edu)을 사용 하는 것입니다 (보충 그림 1: gRNA 디자인). 함께 대표적인 실험에 대 한 회사는 설계 및 대표 실험에 사용 된 gRNA 벡터를 만든. DCas9 플라스 미드 또한 온라인 구입 했다.
<ol><li>GRNA 순서는 뉴클레오티드 순서 "NGG", 여기서 "N"은 또한 transcriptional 시작 사이트의 100의 기본적인 쌍은 어떤 뉴클레오티드의 상류 위치 이다. GRNA 시퀀스 비슷한 시퀀스 게놈에 있는 다른 사이트 되도록 BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) 같은 유전자 데이터베이스 검색 (보충 그림 2: 공격기). 이렇게 하면 gRNA 시퀀스 (GOI)의 유전자에 고유 하다는 것.</li>
	<li>4 ° c.에 세균성 명세서로 서 gRNA와 dCas9 플라스 저장 국물 (파운드) 천 암 피 실린 (보충 표 1)와 함께 접시 하 고 37 ° c.에 하룻밤 박테리아 성장 Luria에 대장균 에 밖으로 행진</li>
	<li>식민지를 선택 하 고 37 ° C 배양 기에서 접시를 적극적으로 떨고 암 피 실린 (보충 표 1),와 파운드의 5 mL에 박테리아를 성장. 다음 날, 추가의 2 mL 암 피 실린과 파운드의 200 mL에 박테리아가 적극적으로 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 플라스 크를 흔들어 2 L 플라스 크에 성장.</li>
	<li>3,724 x g 20 분 제거 미디어에 박테리아와 장소 얼음에 박테리아를 포함 하는 튜브 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>
제조 업체의 프로토콜 당 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 세균성 DNA를 정화. 참고: 소유 물의 resuspension 버퍼, 세포의 용 해 버퍼, 워시 버퍼, 재래식 버퍼 및 차입 버퍼를 포함 하는 플라스 미드 정화 장비.<ol>
<li>물의 resuspension 버퍼의 10 mL 키트에서 박테리아를 피펫으로 박테리아에 추가 솔루션. 그런 다음, 키트에서 resuspended 박테리아 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 혼합. 5 분; 박테리아를 lyse 기다립니다 다음, lysed 박테리아 키트에서 차가운 중화 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 믹스.</li>
		<li>재래식 5 분 부 DNA 열에 샘플 필터 고 필터를 통과 하는 솔루션에 대 한 버퍼의 10 mL와 키트에서 DNA 열 equilibrate</li>
		<li>워시 샘플 2의 30 mL x 버퍼를 세척 하 고, 다음, 15 mL 원뿔 튜브에 차입 버퍼의 30 mL와 함께 DNA elute. 소 프로 파 놀 eluted DNA에 실 온에서의 10.5 mL를 천천히 레이어, 튜브, 반전 및 즉시 16200 x g 4 ° c.에 30 분에서 그것을 회전합니다</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 DNA 펠 릿을 70% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 튜브를 터치 하 여 펠 릿을 resuspend. 16200 x g 4 ° C에서 10 분에서 그것을 회전 하 고 200 μ 피펫으로 팁을 사용 하 여 에탄올의 대부분을 제거. 5 분 동안 펠 릿 건조 하 고 물, 200 μ에 resuspend-20 ° c.에 DNA를 저장 예상된 농도 됩니다 > 1 μ g/μ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 바이러스 생성 및 입자 수
<ol><li>때를 포함 하는 dCAS9 lentivirus를 만드는 준비, 100 m m 조직 문화 요리 0.01% 폴 리-L-리 신 (보충 표 1)의 5 mL와 코트. 철저 하 게 격판덮개에서 과잉 액체를 제거 하 고 그들이 biosafety 캐비닛에 몇 분 동안 공기가 건조.</li>
	<li>플레이트 5 x 106 HEK 293T 세포 완전 한 Dulbecco의 10 mL에 접시 당이 글의 중간 (DMEM) (보충 표 1)을 수정 하 고 하룻밤 5% CO2와 37 ° C에서 품 어. 다음 날, HEK 293T 요리에서 매체를 제거 하 고 완전 한 DMEM의 10 mL을 추가.</li>
	<li>플라스 미드 pMDLg/pRRE 개 그/폴 (바이러스의 구성 요소), 포함 된의 μ g 믹스 6.5 VSV G (바이러스의 구성 요소)를 포함 하는 플라스 미드 pMDG2.G의 3.5 μ g 2.5 µ g 포함 하는 플라스 미드 pRSV-레 브의 계 (바이러스의 구성 요소), 긴 단말기 반복 (10 μ g LTR)-벡터 gRNA 벡터 또는 LTR 포함 된 dCas9를 포함 하 고 450 μ의 전체 볼륨에 물을 추가. 0.2 µ m 필터 팁 주사기에 부착을 통해 혼합물을 필터링 합니다.</li>
	<li>DNA의 각 transfection 샘플을 2.5 M CaCl2 (보충 표 1)의 50 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 0.2 µ m 필터 팁 주사기에 연결 된 통해 칼슘/DNA 혼합물을 필터링 합니다. 피펫으로 500 µ L의 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 2 x HBS (보충 표 1). 추가 500 µ L DNA/CaCl2 믹스 dropwise 부드럽게 소용돌이. 3 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>천천히 각 접시를 DNA/CaCl2/HBS 서 스 펜 션의 1 mL를 추가 합니다. 즉시 요리를 균등 하 게 내용을 소용돌이 친다. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 하룻밤 각 접시를 품 어</li>
	<li>3 일에 천천히 제거 하 고 요리에서 미디어를 삭제. 신중 하 게 씻어 세포 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x. 완전 한 DMEM 20 mM HEPES와 10mm 나트륨 낙 산 염 보충의 6 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 5-6 h에 대 한 셀을 품 어</li>
	<li>1 세포를 씻어 PBS 가진 x HEK 293T 세포에 20 mm HEPES 완전 한 DMEM의 5 mL을 추가. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 하룻밤 12 h에 대 한 품 어</li>
	<li>하루에 4, HEK 293T 세포 supernatants 수집 하 고 필터링 하는 상쾌한. 1 mL aliquots-80 ° c.에 고정</li>
	<li>때 사용 하는 바이러스, 바이러스 성 입자를 포함 하는의 약 수를 녹여 준비 얼음에 (에서 설명한 단계 2.8로 저장 된) 미디어를 조절. 실내 온도에 모든 시 약을 가져다.</li>
	<li>
P24 Enzyme-Linked Immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트를 사용 하 여 계량 밀리 리터 당 바이러스 입자의 수 있습니다.
	<ol>
<li>이온을 제거 된 증류수의 19 부분을 추가 하 여 키트에서 세척 농축액을 희석. 키트에서 긍정적인 컨트롤 200 ng/mL을 희석, 희석제, 및 확인 RMPI 1640을 사용 하 여 1.5 mL에 표준 곡선에 대 한 희석 튜브는 p24 따라 ELISA 희석 표 (보충 표 2).</li>
		<li>추가 5%의 20 μ 빈 기판 제외 하 고 모든 우물에 트라이 톤 X-100. 부정적인 통제 우물에 RPMI 1640의 200 μ를 추가 합니다. 지정 된 웰 스를 (중복)에서 각 표준의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 표준 곡선을 사용 하 여 샘플 내의 바이러스의 농도 측정. 1:1,000에서 샘플 희석을 시작 하 고 표준 곡선의 범위 내에 있을 필요에 따라 볼륨을 수정 합니다. 0.5%의 최종 농도에 Triton X-100와 샘플을 희석 하 고 지정 된 웰 스 RPMI 1640에 각 샘플의 200 μ를 추가 합니다. 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에 2 h에 그것을 품 어</li>
		<li>6 접시를 씻고 잘 당 워시 버퍼 x 1의 300 μ x. 접시를 반전 하 고 종이 수건에 그것을 활용 하 여 모든 초과 액체를 제거 합니다. 키트에서 빈 기판 제외 하 고 모든 우물 검출기 항 체의 100 μ를 추가 합니다. 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에 1 시간을 위해 그것을 품 어 접시를 세척 하 고, 다음, 접시를 반전 하 고 종이 수건에 그것을 활용 하 여 어떤 과잉 액체를 제거.</li>
		<li>검출기 항 체를 측정 하기 위하여 사용의 15 분 이내 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP SA)를 준비 합니다. SA-HRP 희석제와 1: 100에 SA HRP를 희석. 희석된 SA HRP를 철저 하 게 혼합 하 고 추가 100 μ 빈 제외 하 고 모든 우물. 밀봉 하 고 상 온에서 30 분 동안 접시를 품 어.</li>
		<li>워시 버퍼 x 1 접시를 세척 하 고 멀리 단계 2.10.4에서 어떤 초과 액체를 누릅니다. 직교 phenylenediamine (OPD) 기판 솔루션 제공는 과산화 효소 화학 준비 15 분 이내를 생산 하기 위해 필요한 기질을 사용 합니다. 한 OPD 타블렛 기판 희석제의 11 mL를 사용 하 여 각 접시.</li>
		<li>완전히 녹이 고 빛 으로부터 보호를 적극적으로 OPD 솔루션 소용돌이. 공백을 포함 하 여 모든 우물에 OPD 기판 솔루션의 100 μ를 추가 합니다. 사용 하는 분 광 광도 계, 450에서 흡 광도 읽고 nm는 즉시 1 s 간격이 10 배를 반복 하 고 평균 측량을가지고 가십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dCas9-부사장64 변환
<ol><li>완전 한 DMEM 미디어의 15 mL에 2 x 106 세포의 밀도와 T75 플라스 크에 있는 문화 Jurkat T 세포. 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 세포 문화.</li>
	<li>233 x g 에 5 분에 대 한 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고, 다음, 감소 된 혈 청 미디어의 10 ml에서 그들을 resuspend. hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>Resuspend 및 polybrene (보충 표 1) T75 플라스 크에 감소 된 혈 청 미디어의 5 mL에 1 x 106 Jurkat 세포 접시. 1 x 106 바이러스 성 입자를 포함 하는 dCas9 포함 된 HEK 293T 조절 미디어를 추가 합니다. 바이러스 성 입자의 수는 p24에서 대략 계산할 수 있다 ELISA 1 μ g/mL p24 같음 1 x 107 바이러스 성 입자 때문에. 5% CO2배양 기 37 ° C에에서는 플라스 크를 넣어.</li>
</ol>4. 선택 하 고 복제 생성
<ol><li>3 일 후 감염, 233 x g 5 분에 셀 아래로 회전 하 고 완전 한 DMEM puromycin (보충 표 1)와 10 mL에 그들을 resuspend. T75 플라스 크에 세포 격판덮개 그리고 5% CO2와 37 ° C에서 문화. 9 일 동안 3 매일 5 분 233 x g 에서 셀 아래로 회전 하 고 puromycin와 완전 한 DMEM 미디어 바꿉니다.</li>
	<li>hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 조직 문화 치료 96 잘 접시에 처음에 puromycin와 완전 한 DMEM의 100 μ 접시 10000 셀 잘하고 직렬 희석 1:1 완벽 한 DMEM puromycin와 함께 다음 우물의 내용을. 수행 24 희석 하 고 잘 당 세포의 충분 한 숫자 인지 확인 하기 위해 접시 당 4 x이를 반복 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>2 개의 24-잘 접시로 6 잘 플레이트에 그리고 결국 T75 플라스 크에 클론 세포를 확장 합니다. 위해 클론, 클론의 3 6 잘 플레이트의 잘 당 플레이트 2 x 106 세포의 3에 초점. 컨트롤로 nontransduced Jurkat 세포와 다른 3 개의 우물을 접시. 넣어 셀 셀 문화 인큐베이터에서 하룻밤.</li>
	<li>RNA 추출, 상용 RNA 격리 키트를 사용 하 여. 실 온에서 5 분 동안 233 x g 에서 셀 아래로 회전 시키십시오 하 고 미디어를 제거 합니다. 1 mL 피펫으로 팁을 사용 하 여 세포 세포의 용 해 버퍼의 350 μ에 resuspend. Lysed 세포에 70% 에탄올의 350 μ를 추가 하 고 1 mL 피펫으로 철저 하 게 혼합 한 RNA 열 샘플을 전송.</li>
	<li>1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 추가 낮은 엄중 워시 버퍼의 700 μ 키트에서 열. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 DNase의 80 µ L을 추가 내가 열; 키트에서 솔루션 실 온에서 15 분 동안 품 어 샘플을 보자.</li>
	<li>1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 열에는 키트에서 높은 엄중 워시 버퍼의 700 µ L를 추가. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 열을 낮은 엄중 워시 버퍼의 700 µ L를 추가.</li>
	<li>컬렉션 튜브에서 열을 제거 하 고 새로운 컬렉션 튜브에 그것을 전송. 10000 x g 1 분 동안에 lysates 회전 하 고, 다음, 1.5 mL 튜브에 RNA 열을 전송. 1 분 동안 10000 x g 에서 스핀을 물 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>RNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 100-500 ng / µ L, 1.9-2.1 사이 260/280 흡 광도와 사이 농도 기대 합니다. -80 ° c.에 RNA를 저장</li>
	<li>250 µ L에서 튜브, RNA, DNA (cDNA) 합성 버퍼 보완의 4 µ L, 역전사의 1 µ L의 1 µ g를 추가 하 고 20 µ L의 최종 볼륨을 물 아무 역전사 컨트롤을 포함 합니다. 열 cycler에서 cDNA는 역전사 비활성화를 5 분 동안 95 ° C와 30 분 동안 42 ° C에 음성 합성. 합성 후 물 60 µ L로 cDNA를 희석.</li>
	<li>중 합 효소 연쇄 반응 (PCRs) SYBR 녹색의 5 µ L, cDNA의 4 µ L, 0.5 µ L의 앞으로 뇌관 (10 µ M), 그리고 반전 뇌관 (10 µ M)의 0.5 µ L을 포함 준비. PCR를 다음과 같이 실행: 1 = 95 ℃ 3 분에 대 한 단계, 단계 2 = 95 ° C 10 s, 단계 3 = 60 ° C에 대 한 10, 고 후, 반복 2 단계와 3 단계 30 x에 대 한. 참고: dCas9 앞으로 뇌관을 위한 순서는 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 그리고 dCas9 반전 뇌관을 위한 순서는 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 앞으로 뇌관 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT 이며 역 뇌관은 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.</li>
</ol>5. gRNA 변환, 선택, 복제 생성, 및 심사
<ol><li>섹션 3에에서 명시 된 포함 하는 gRNA 바이러스 검증된 Jurkat dCas9 셀을 retransduce. 10 일 동안 DMEM hygromycin (보충 표 1)과 셀 선택 합니다. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 미디어 3 일 마다 변경.</li>
	<li>셀의 직렬 희석 (4.2 단계에서 설명)를 수행 하 고 (단계 4.3에서에서와 같이) 개별 식민지를 확장 합니다. 4.5 단계에서 설명한 대로 식민지에서 RNA를 정화 하 고 cDNA 합성 단계 4.9에에서 설명 된 대로 수행 합니다. GOI에 대 한 실시간 PCR을 수행 하 고 HPRT1 또는 유사 하 게 PCR 적절 한 내부 관리 유전자 단계 4.10에서 설명한 제외 하 고이 경우에, 웰 스 각 3 단계 후에 순환 하는 이미지.</li>
	<li>GOI8배 변화를 확인 하기 위해 비교 주기 임계값 (Ct) 메서드를 사용 합니다. 간단히, 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 상대 성적 수준 (RTLs) 계산: 2-(Ct의 GOI 평균-평균 내부 관리 유전자의 Ct). 그런 다음, 컨트롤의 평균 RTL을 계산 하 고 평균 제어 컨트롤 샘플에 비해 배 변화를 생성 하는 RTL 모든 RTL 값을 나누어.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 원고는 생체 외에서 lncRNAs overexpress를 CRISPR를 활성화 사용 하 여 프로토콜을 선물 한다. 이 긴 noncoding RNAs transcriptomic 제품 기능 단위는 공부를 할 때 특히 중요 한 기술입니다. Overexpression, 후 연구원 수, 다음, 사용 하 여 이러한 셀 바인딩 파트너를 공부를 할 때 신호 대 잡음 비율을 증가 하 여도 세포 lncRNAs의 증가 수준 결과 측정. 또한, lncRNAs 자주 독립-유전자, 행동으로이 생 overexpression 기술을 공부11,12되도록 이러한 이벤트 가능 합니다.
이 원고 gRNA 창조 및 lentivirus 생성, 변환, 및 선택, 일반화 된 프로토콜을 강조 하 고 말 초 혈액 T 세포 라인에에서 lncRNA overexpression의 대표적인 예를 들어 설명 했다. 또한,이 기술...

가장 생물 의학 연구는 단백질 코딩 성적표를 중점적으로, 베낀된 유전자의 대다수는 실제로 noncoding RNAs (합 자료 93)의 구성 됩니다. 현재 연구는 2007 년과 20171사이 기 하 급수적으로 상승 하는 질병 과정에서 lncRNAs에 간행물의 수와 함께이 필드를 탐험 시작 됩니다. 이 간행물은 많은 lncRNAs 질병와 관련 된 보여 줍니다. 그러나,이 lncRNAs의 분자 메커니즘은 mRNAs에 비해 그들의 다양 한 기능으로 인해 공부 하기가 어렵습니다. LncRNAs 질병에서의 역할 이해의 문제를 다중, lncRNAs 주로 코딩 RNAs2보다 하위 수준에 표시 됩니다. 또한, lncRNAs는 가난 하 게 보존, 인간의 세포 라인 기반 기술3기능 연구를 제한 하. 이 비 발한 유전자의 메커니즘을 연구 한 방법은 endogenously 경작된 한 세포에 overexpress 것입니다. Overexpression 학문 특정 한 유전자의 기능으로 중요 한 정보를 제공 하 고 연구원은 주요 분자 경로 해 부를 수 있도록 수 있습니다.
LncRNA 유전자의 전사를 활성화 하는 새로운 방법은 게르 바흐 연구소4에 의해 처음 개발 하는 CRISPR 기술을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 lncRNA 생물학에서 사용 하 고 다른 모델 시스템에서이 유전자의 표현에 대 한 적응 되었습니다. 기술 overexpressing CRISPR에서 CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 이라고 불리는 단백질 Cas9에 의해 인식 되는 센스 gRNA 통해 DNA 시퀀스를 향해 이동 수 있습니다. 일반적으로, Cas9 DNA 분열;을 유발 한다 그러나, Cas9, 이전 overexpression 기술에 대 한 개발에 변이이 단계5를 비활성화 합니다. "죽은" Cas9에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 때 (dCas9) 셀 라인으로 불리고, lncRNAs의 생 overexpression 수 달성된4,6. DCas9 유전자 활성화 시스템의 효능을 증가 하는 gRNA, gRNA에 바인딩할 추가 transcriptional 요소 사용에 대 한 추가 수정 추가 사진7. 중요 한 것은, 그것 transcriptional 활성화 근접에서는 시연 했다 (< 200 bp)는 transcriptional 시작 사이트 유전자, 유전자 풍부한 지역7에 특정 upregulation를 사용. CRISPR 녹아웃 기술, 달리 dCas9 및 gRNA 카세트는 여러 세대에 걸쳐 overexpression를 유지 하기 위해 셀 수 있도록 게놈으로 통합 될 필요가 있다. 이를 위해 한 가지 방법은 dCas9 및 gRNA 포함 된 카세트를 통합 lentiviruses를 사용 하는 것입니다. 통합 후 lncRNA 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.
이 문서에서는, lncRNA overexpression Jurkat T 세포 모델에 대 한 프로토콜 시연 됩니다. 단계별 절차는 표시 되 고 또한 부착 셀에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 합성 키트 (iScript)</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>dCas9 포워드 프라이머</td><td>통합 DNA 기술</td><td>n/a</td><td>5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&nbsp;</td></tr><tr><td>dCas9 리버스 프라이머</td><td>통합 DNA 기술</td><td>n/a</td><td>5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td></tr><tr><td>dCas9 벡터</td><td>Addgene</td><td>50918</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CM</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>아크로스 유기물</td><td>61509-0010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>gRNA 플라스미드</td><td>VectorBuilder</td><td>VB180119-1195QXV</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 셀</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPRT1 포워드 프라이머</td><td>통합 DNA 기술</td><td>n/a</td><td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&nbsp;</td></tr><tr><td>HPRT1 리버스 프라이머</td><td>통합 DNA 기술</td><td>n/a</td><td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Corning</td><td>MT3024CR</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-500</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 세포</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; TIB-152</td><td>클론 E6-1</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>코닝</td><td>25005Cl</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>NIST2186II</tr><tr><td>Optimem I 감소 혈청 미디어&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>p24 elisa</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CMR</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>pMDG2.G</td><td>Addgene &nbsp;</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>애드진&nbsp;</td><td>#60488</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P-4832</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레인</td><td>EMD 밀리포어</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV</td><td>애드진</td><td>#12253</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNA 정제 키트(Aurum RNA mini)</td><td>BioRad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>부티르산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 그린(iTaq 유니버설)</td><td>BioRad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

overexpressing 긴 noncoding rnas 유전자 활성화 crispr를 사용 하 여

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

긴 noncoding RNA (lncRNA) 생물학 연구, 2007 년 이후 기 하 급수적으로 성장 하는이 분야에서 간행물의 수의 새롭고 흥미로운 분야 이다. 이러한 연구는 lncRNAs 거의 모든 질병에 변경 되는 것 확인 했습니다. 그러나, 질병의 맥락에서 lncRNAs에 대 한 기능적 역할을 공부 하 고 단백질 제품, 조직의 특정 식, 낮은 식 레벨, 결합 한 형태로, 복잡 한의 부족 종 가운데 보존의 부족으로 어려운 남아 있다. 감안할 때 종의 식, lncRNA 연구는 종종 인간의 연구 컨텍스트 제한 질병 과정 공부를 할 때. LncRNAs는 분자 수준에서 작동, 이므로 lncRNA 생물 해 부 방법 중 하나는 lncRNA를 제거 하거나 overexpress lncRNA 및 측정 세포 효과. 이 문서에서는, 생체 외에서 lncRNAs overexpress을 작성 하 고 시각화 된 프로토콜 제공 됩니다. 대표적인 실험으로는 lncRNA 선 동적인 장 질병, 인터페론 감마 Antisense 1 (IFNG-AS1)와 관련 된 Jurkat T 세포 모델에 overexpressed에 표시 됩니다. 이 위해 활성화 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술은 overexpression 생 게놈 loci에서 사용할 수 있도록 사용 됩니다. 활성화 CRISPR 기술 대상 transcriptional 시작 사이트 여러 lncRNA 결합 형태의 강력한 overexpression를 활성화 한 유전자의 녹음 방송 요인의 집합. 이 절차 3 단계, 즉 (i) 가이드 RNA (gRNA) 디자인 및 벡터 건설, (ii) 바이러스 생성 및 변환, 및 (iii) 식민지 심사 overexpression에 대 한으로 세분화 될 것 이다. 이 대표적인 실험에 대 한 20-fold 향상 IFNG-AS1 Jurkat T 세포에서에서 관찰 되었다 보다는.

Overexpress lncRNA IFNG-AS1 듀얼 벡터 시스템 이 원고에 예제 실험 lncRNA IFNG AS19표현 Jurkat T 세포 모델 시스템의 overexpression입니다. IFNG-AS1 인터페론 감마10규제를 본 선 동적인 장 질병과 관련 된 하는 lncRNA입니다. IFNG-AS1 유전자는 모두 동일한 transcriptional 시작 사이트 (그림 1A)를 사용 하는 3 개의 결합 이체를 포함 합니다. 따라서, transcriptional 시작 사이트에서 10와 100 bp와 상류 "NGG" 시퀀스를 했다 gRNA 시퀀스 감독 Cas9 활성화 복잡 한 transcriptional 로커 스의 IFNG-AS1 (그림 1A)...

전통적인 cDNA 기반 overexpression 기법 때문에 잠재적인 기능을 가진 그들의 여러 결합 형태 긴 noncoding RNAs의 overexpression에 대 한 제한 적용을 했습니다. 이 리뷰 긴 noncoding RNA의 여러 스플라이스 변종 overexpress CRISPR 기술을 사용 하 여 프로토콜을 보고 합니다.

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

비코딩 RNA에는 여러 동위 형태가 있는 경우가 많습니다. 시험관 내 과발현 연구에서는 이러한 표현된 모든 등소 형태를 연구하기가 종종 어렵습니다. 이 기술은 사용자가 게놈으로부터 직접 발현을 도출하고 세포가 특정 비코딩 RNA에 대한 내인성 동소형을 발현할 수 있게 한다.이 강력한 기술은 사용자가 충실도와 정확도로 게놈내의 모든 유전자의 발현을 구체적으로 지시할 수 있게 합니다. 특정 유전자에 대한 가이드 RNA를 설계함으로써 내인성 유전자 접합 기계를 사용하여 주어진 세포에서 천연 동소형을 발현할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 로버트 랭킨이 될 것입니다.전사 시작 부위의 100개의 기본 쌍 내에 위치한 가이드 RNA 서열을 설계하려면 BLAT와 같은 유전자 데이터베이스를 사용하여 가이드 RNA가 관심 유전자에 고유한지 확인합니다. 가이드 RNA와 비활성화된 Cas9 플라스미드를 섭씨 4도에 저장합니다. 암피실린을 곁들인 루리아 국물 한마접시에 E.coli를 줄이며 하룻밤 사이에 37도에서 박테리아를 재배합니다.다음 날, 식민지를 선택하고 하룻밤 암피실린과 LB의 5 밀리리터에서 박테리아를 성장, 적극적으로 37도 섭씨 인큐베이터에서 튜브를 흔들어. 다음 날, 2 리터 플라스크에 암피실린과 LB의 200 밀리리터에 박테리아의 두 밀리리터를 추가, 적극적으로 37도 섭씨 인큐베이터에서 하룻밤 플라스크를 흔들어. 박테리아를 3, 724시간 g에서 20분 동안 스핀다운하고 DNA 정화로 진행합니다.dCas9 함유 렌즈바이러스를 만들기 위해, 첫 번째 코트 100 밀리리터 조직 배양 접시 와 5 밀리리터 0.01% 폴리-L-리신 및 플레이트 당 5 백만 HEK293T 세포 10 밀리리터의 완전한 덜벡코의 수정 된 독수리 매체, 그런 다음 LTR 함유 가이드 RNA 벡터 의 10 마이크로그램 또는 LTR 함유 비활성화된 Cas9 벡터를 바이러스 성분을 함유한 플라스미드와 혼합하여 DNA 전환 샘플을 준비한다. 총 450마이크로리터에 물을 추가하고 주사기에 부착된 0.2미크론 필터 팁을 통해 혼합물을 필터링합니다. 다음으로, DNA의 각 트랜스펙트 샘플에 2.5-어금니 칼슘 이산화제 50마이크로리터를 추가하고 부드럽게 섞는다.주사기에 부착된 0.2미크론 필터 팁을 통해 칼슘-DNA 혼합물을 걸이합니다. 파이펫 500 마이크로리터 2X HBS를 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 넣습니다. 칼슘-DNA 혼합물 500마이크로리터를 드롭와이즈와 부드럽게 소용돌이에 넣습니다.실온에서 3분간 배양하세요. 각 HEK293T 함유 조직 배양 접시에 DNA 칼슘 HBS 현탁액 1밀리리터를 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 배양합니다. 셋째 날에는 천천히 제거하고 접시에서 미디어를 폐기하십시오.조심스럽게 한 번 PBS로 세포를 씻어. 20 밀리머 HEPES와 10 밀리머 나트륨 부티레이트로 보충 된 완전한 DMEM의 6 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 5~6시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 세포를 배양합니다.인큐베이션 후, PBS로 세포를 한 번 세척하고 HEK293T 세포에 20 밀리머 헤페스와 함께 완전한 DMEM의 5 밀리리터를 추가합니다. 12시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 4일째에는 HEK293T 세포 수퍼나티를 수집하고 바이러스를 함유하는 수퍼나티를 필터링한다.바이러스 성 입자 수를 시작하려면 먼저 증류수의 19 부분을 추가하여 P24 ELISA 키트에서 세척 농축물을 희석시하십시오. 그런 다음, 이 키트로부터 밀리리터당 200 나노그램으로 희석제로 희석제로 희석제로서 희석제로서 희석제로 희석제를 희석시키고 P24 ELISA 희석 표에 따라 1.5밀리리터 튜브의 표준 곡선에 대한 희석제를 만듭니다. 시료 내의 바이러스의 농도를 측정하기 위해 1:1000 희석부터 시작하여 96웰 플레이트의 지정된 우물에 샘플 희석을 추가하고 표준 곡선의 범위 내에 있기 위해 필요에 따라 부피를 수정한다.그런 다음 트리톤 X-100으로 샘플을 0.5%의 최종 농도로 희석하고 각 샘플의 200 마이크로리터와 RPMI 1640을 지정된 우물에 추가합니다. 접시를 밀봉하고 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 1X 세척 버퍼의 웰 당 300 마이크로 리터로 접시를 6 번 세척하십시오.접시를 반전하고 종이 타월에 눌러 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 기판 공백을 제외한 모든 우물에 키트에서 검출기 항체 100 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.접시를 씻은 다음 접시를 반전시키고 종이 타월에 두드려 여분의 액체를 제거하십시오. 검출기 항체를 측정하기 위하여는, SA-HRP 희석으로 1:100 희석에서 스트렙타비딘 고추냉이 과옥시다아제를 희석시 희석한다. 희석된 SA-HRP를 완전히 혼합하고 빈 을 제외한 모든 우물에 100 마이크로리터를 추가합니다.플레이트를 실온에서 30분 동안 밀봉하고 배양합니다. 다음으로, 1X 세척 버퍼로 접시를 씻고 여분의 액체를 두드리고. 1개의 직교-페닐렌디아민 정제를 1플레이트에 충분한 기질 용액을 만들기 위해 기질 희석제의 11밀리리터에 떨어뜨립니다.완전히 용해하고 빛으로부터 보호하기 위해 적극적으로 OPD 솔루션을 소용돌이. 빈 공간을 포함한 모든 웰에 OPD 기판 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 분광계를 사용하여 450 나노미터에서 즉시 흡광도를 읽습니다.1초 간격으로 10회 반복하고 평균 측정을 수행합니다. 폴리브레네를 가진 감소된 혈청 매체의 5밀리리터에 있는 백만 세포의 밀도를 가진 T75 플라스크에 있는 Jurkat T 세포를 재중단하고 배양합니다. 그런 다음 백만 dCas9 함유 바이러스 입자를 포함하는 HEK293T 조건부 미디어를 추가합니다.이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 3 일 감염 후, 5 분 동안 233 시간 g에서 세포를 회전하고 puromycin으로 보충 된 완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 다시 중단하십시오. T75 플라스크의 세포를 배양하고 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 배양합니다.9 일 동안 매 셋째 날마다, 5 분 동안 233 배 g에서 세포를 회전하고 puromycin로 보충 된 완전한 DMEM으로 미디어를 대체합니다. 혈전계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 이어서, 조직 배양 조직으로 96웰 플레이트에, 첫 번째 우물에서 푸오마이신으로 보충된 완전한 DMEM의 100 마이크로리터에 10, 000세포를 첨가한다.푸오마이신으로 보충된 완전한 DMEM으로 다음 우물의 내용물을 1:1 연속 희석합니다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 클론 의 세 에 대한 6 웰 플레이트의 웰 당 2 백만 개의 세포를 판두 24 웰 플레이트로 복제 세포를 확장합니다.비 변형 된 Jurkat 세포와 다른 세 개의 우물을 컨트롤로 플레이트. 마지막으로, 세포를 T75 플라스크로 플레이트하고 세포를 세포 배양 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다. 유전자 발현을 측정하기 위해 먼저 RNA 1마이크로그램, cDNA 합성 완충제 4마이크로리터, 250마이크로리터 튜브에 역전사 1마이크로리터를 추가하여 보완 DNA를 합성한 다음, 20마이크로리터의 최종 부피에 물을 추가합니다.그런 다음, 42섭씨에서 30분 동안, 95도에서 5분간 열 순환기를 사용하여 역방향 전사를 비활성화합니다. 합성 후 60 마이크로리터의 물로 cDNA를 희석시보시다. 10 마이크로몰라의 최종 농도에서 각 전방 및 역 프라이머의 0.5 마이크로리터를 포함하는 튜브에 대한 폴리머라제 연쇄 반응을 실행, SYBR 녹색의 5 마이크로리터, 및 cDNA의 4 마이크로 리터.마지막으로 10 일 동안 Hygromycin B로 보충 DMEM에서 Jurkat-dCas9 세포를 선택합니다. 세포를 회전하고 3 일마다 미디어를 변경합니다. RNA를 정화하고 RT-qPCR로 진행합니다.본 연구에서는, 전사 시작 부위로부터 10~100개의 염기 쌍 내에 있던 gRNA 서열은 염증성 장 질환과 관련된 긴 비코딩 RNA인 IFNG-AS1의 전사 궤적에 Cas9 활성화 복합체를 지시하는 데 사용되었다. 이중 변환 된 세포의 선택을 가능하게 하기 위해, 2-plasmid 시스템은 세포로 dCas9 또는 gRNAse 증강을 변환하는 데 사용되었다. 여기서 MS2 단백질은 IFNG-AS1의 과발현을 향상시킵니다.Cas9 발현은 두 클론모두에 대해 확인되었다. HPRT1에 대한 프라이머는 비트랜스유도 된 세포에서 RNA의 존재를 확인하는 데 사용되었다. mRNA 발현은 cDNA 반응으로부터 역실체를 생략하여 확인되었다.IFNG-AS1의 3개의 스플라이스 변이체는 알려진 모든 IFNG-AS1 성적증명서에 대해 전사체별 프라이머 세트 또는 프라이머 세트로 검출될 수 있다. 모든 형광 곡선은 제어 와 IFNG-AS1 gRNA 표현 세포 사이의 반 주기 내에서 지수 단계에 도달 하는 하우스키핑 유전자 HPRT1기만하급수적 이었다. 알려진 모든 IFNG-AS1 성적증명서에 대한 프라이머는 IFNG-AS1 발현에서 20배 증가의 측정과 함께 실험 간에 가장 검출가능한 것으로 나타났다.그러나 IFNG-AS1의 세 번째 성적증명서는 IFNG-AS1 수준에서 5-10배 의 유의한 증가를 보였다. 원하는 유전자를 적극적으로 과장하기 위해 2.1 단계에서 가이드 RNA의 설계는 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 또한 고품질 바이러스 입자를 생산하면 프로토콜 구성 요소를 강력하게 표현할 수 있습니다.일단 원하는 유전자가 과발현되면, 기능성 연구는 유전자 기계장치를 조사하기 위하여 수행될 수 있습니다. 우리의 예에서, 우리는 관심의 유전자의 과발현에 따라 사이토카인 생산을 보기로 결정했습니다. 이 기술은 처음에 2013년에 Griesbach Group에 의해 개발되었으며 다른 그룹에서 광범위하게 적용되고 정교해졌습니다.우리는 그들의 특정 기능을 탐구하기 위해 긴 비코딩 된 RNA에이 기술을 적용하는 것을 기쁘게 했다. 복제 결함이 있는 렌즈바이러스는 바이러스 성 작업에 대해 승인된 실험실에서 처리되어야 합니다. 추가적으로, 인간 적인 세포주 및 E.coli 박테리아는 생물적인 유해한 여겨집니다.마지막으로, 재조합 DNA 플라스미드는 훈련된 직원에 의해 처리되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

Chromatin 반복; 유전자 규칙에 있는 중요 한 역 그러나, chromatin 루프의 선택적이 고 가역 수정 허용 하는 아무 기술 발전 되었습니다. 여기 우리가 chromatin 루프 개편에 대 한 강력한 시스템 설명 loci를 대상으로 선택적으로 고 역에서 유전자 발현 조절에 CRISPR-dCas9 (CLOuD9)을 사용 하 여.

CRISPR 중재 Chromatin 루프 구조 개편

이 프로토콜 설계 및 다중화 비활성화 융해 단백질 SID4X-dCas9-리아로 알려진 또한 증강 간섭 (증강 인자-i)와 강화의 대상으로 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 유전자 발현을 조절 하는 강화의 식별을 가능 하 게 일반적인 대상 유전자 규제 강화 간의 관계의 해 부를 촉진 한다.

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

여기서, 우리는 소분자, Shield-1 하에서 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (Cas9)의 시간적 및 조건부 안정화에 기초하여 게놈 편집 도구를 기술합니다. 이 방법은 배양 된 세포 및 동물 모델에 사용될 수있다.

조건부 Cas9 안정화를 사용하여 유전자 기능을 평가하기 위한 새로운 툴킷

여기에서는 높고, 장기적이며, 안정적이며, 표적 침묵 효율이 높고 게놈 전체, 표적 외 활성이 낮은 조작된 전사 억제제(ETR)의 시험관 내 선택을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우를 통해 후보 ETR의 초기 복잡한 레퍼토리를 짧은 목록으로 줄일 수 있으며, 이는 치료적으로 관련된 환경에서 추가 평가에 적합합니다.

In Vitro (시험관 ) 표적 후성유전학적 침묵을 위한 엔지니어링된 전사 억제제 선택

CRISPR-Cas 시스템과 anti-CRISPR 단백질은 Saccharomyces cerevisiae의 부울 게이트 체계에 통합되었습니다. 새로운 소형 논리 회로는 우수한 성능을 보였으며 dCas9/dCas12a 기반 전사 인자와 항-CRISPR 단백질의 특성에 대한 이해를 심화시켰습니다.

CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로

이 연구는 흑색종 세포에서 긴 non-coding RNA를 표적으로 하는 이중 CRISPRi 시스템을 제시합니다. 이를 통해 조합 유전자 녹다운(combinatorial gene knockdown) 및 합성 치사 스크리닝(synthetic lethal screening)을 가능하게 하여 잠재적인 치료 전략을 위한 암 특이적 lncRNA 상호 작용을 식별할 수 있습니다.

암세포에서 비암호화 RNA 간의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하기 위한 이중 CRISPR-간섭 전략

게놈 차원의 CRISPR/Cas9 스크리닝 방법을 적용하여 방사선의 저항성 및 민감성 유전자를 선택하기 위한 세심하고 구조화된 접근 방식이 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 임상적으로 투여되는 화학 약물에 대한 내성 메커니즘을 조사하는 다른 연구 노력을 위한 다재다능한 프레임워크 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

배우세요 CRISPR 기술을 활용하여 긴 비암호화 RNA의 여러 스플라이스 변이체를 과발현하는 방법을. 내인성 스플라이싱 기계를 이용하여 세포에서 자연스러운 아이소폼을 발현시키는 이 기법은 유전자 기능 연구에 필수적입니다.

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

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