Name: 면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용하여 성인 제브라피시에서 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체를 식별하는 방법을. 이 프로토콜은 비만 관련 분자 변화 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 폰디 리체르카 디 아테네오 (FRA)에 의해 지원되었다 2015-2016, 산니오 대학.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

샘플 준비
시료 전형은 IHC의 첫 번째 중요한 단계입니다. 신뢰할 수 있는 프로토콜을 통해 세포 형태, 조직 구조 및 항원성을 유지보수할 수 있습니다. 이 단계는 올바른 조직 수집, 고정및 절편22,23이필요합니다. 고정의 목적은 조직을 보존하고 조직 효소 또는 미생물의 작용을 감소시키는 것입니다. 특히, 고정 단계는 세포 성분과 생체 분자를 보존하고, 세포 성분(예: 항원 및 효소)의 자가 분해 및 이동을 방지하고, 다음 절차의 비역적 효과에 대해 세포 물질을 안정화시키고, 4,7,24.
절편되기 전에, 조직은 파라...

면역조직화학(IHC)은 항원-항체 상호작용1,2에의해 세포 또는 조직 성분(antigens)을 식별하는 데 사용되는 잘 확립된 고전 기술이다. 조직 내의 표적 생체분자의 국소화 및 분포를 식별하는데 사용될 수 있다. IHC는 조직 섹션에서 항원을 검출하기 위해 면역 학적 및 화학 반응을 사용3. 항원-항체 상호작용의 가시화에 사용되는 주요 마커는 형광 염료(immuno형광) 및 효소 기질 색 반응(면역페록시다아제)을 포함하며,둘 다 항체에 공액화된다 4. 현미경 관찰을 사용하여 표지 된 조직의 국소화를 결정할 수 있으며, 이는 조직 내의 표적 항원의 국소화에 약 대응합니다.
단백질을 검출하기 위해 형광 또는 발색 반응을 위해 존재하는 두 가지 방법이 있습니다 : 특정 1 차 항체가 직접 표지되는 직접 검출 방법; 및 간접 검출 방법은, 1차 항체가 비공화되고 이차 항체가 라벨5,6,7을운반하는 동안. 간접 방법은 주로 신호 증폭이다 몇 가지 장점을 갖는다. 더욱이, 다른 분자 및 세포 기술과 달리, 면역형광과 함께, 세포 및 조직 내에서 분화되는 2개 이상의 단백질의 분포, 국소화 및 공동발현을 가시화할 수있다7. 사용되는 검출 방법의 선택은 실험 세부 사항에 따라 달라집니다.
현재까지 IHC는 인간에서 무척추 동물까지 생물학적 조직에서 다양한 단백질의 분포 및 국소화및 일반적인 프로파일링을 이해하는 강력하고 필수적인 도구로 서 기초 연구에 널리 사용되고있다 8, 9개 , 10개 , 11. 이 기술은 많은 수의 정상 및 변경 된 동물 장기 및 다른 조직 유형에서 단백질 발현지도를 표시하여 생리적 및 병리학적 변화에 의해 유도 된 발현의 하향 또는 업 조절을 보여줍니다. IHC는 최적의 결과를 얻기 위해 정확성과 올바른 방법을 필요로 하는 매우 민감한 기술입니다12. 우선, 고정, 교차 반응성, 항원 검색 및 항체의 민감도와 같은 많은 상이한 인자는 거짓양성 및 거짓 음성 신호(13)로 이어질 수 있다. 항체의 선택은 IHC에서 가장 중요한 단계 중 하나이며 조사 중인 단백질 및 종에 대한 항원특이성 및 그 친화성에 의존한다 7.
최근, 우리는 성인 얼룩말 조직에서 오렌신 / 저크레틴 과 엔도 칸 나비 노이드 시스템의 구성원을 검출하기 위해 IHC 기술을 최적화했습니다. 우리는 주로 고정, 두 가지 접근법을 사용하여 조직 포함, 단면화 및 장착 (현미경 분석 중 해상도 및 세부 사항에 영향을 미칠 수 있음), 및 차단 (거짓 긍정을 방지하고 배경을 줄이기 위해)14. 다른 중요한 특성은 개별 IHC 프로토콜의 항체 특이성 및 선택성 및 재현성이다. 항체 특이성을 제공하는 열쇠는 음성 대조군(표적 단백질을 발현하지 않는 것으로 알려진 1차 항체 또는 조직을 포함하지 않음)뿐만 아니라 양성 대조군(표적 단백질을 발현하는 것으로 알려진 조직 포함)의 사용이다15 . IHC에 대한 항체의 선택은 그들의 종 특이성 (관심있는 항원과 반응할 가능성) 및 4,5,6에 사용되는 항원 항체 결합 검출 시스템에 기초하여 이루어집니다. ,7. 면역페록시다아제의 경우, 반응의 색은 침전 염색체, 보통 디아미노벤지딘(brown)16의선택에 의해 결정된다. 한편, immunofluorescence는 형광체와 공액된 항체를 활용하여 동결 조직 섹션에서 단백질 발현을 시각화하고 염색체 검출 시스템에 대하여 여러 단백질을 쉽게 분석할 수 있습니다. 5개 , 7.
면역페록시다아제 기술에서, 이차 항체는 염색체 리포터 분자[아비딘-비오틴 복합체(ABC)]를 모집할 수 있는 링커 분자인 비오틴에 공액화되어 염색 신호의 증폭을 유도한다. ABC 리포터 방법을 사용하면 효소 과산화 효소가 3,3'-다미노 벤지딘 (DAB)과 반응하여 효소가 이차 항체에 결합하는 강렬한 갈색 염색을 생성하여 일반 광 현미경으로 분석 할 수 있습니다. ABC 염색은 비오틴에 대한 아비딘의 높은 친화도 때문에 1 차 항체 반응성의 부위에 부착된 이차 항체가 거의 없는 신속하고 최적의 반응을 생성합니다. 이러한 발색 검출 방법은 신호의 밀도 분석을 허용하고, 단백질 발현 수준18과갈색 신호 수준의 상관관계에 기초하여 반정량적 데이터를 제공한다.
면역형광 기술을 사용하면 독특한 파장에서 빛을 방출하는 다양한 형광화의 능력으로 인해 여러 단백질을 동시에 검출할 수 있지만 스펙트럼 중복을 최소화하기 위해 형광화를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 5.또한, 상이한 숙주 종에서 1차 항체의 사용은 교차 반응성에 관한 어려움을 최소화한다. 이 경우, 각 종 특이적 이차 항체는 1차 항체의 한 가지 유형만을 인식한다. 형광 리포터는 알렉사 플루오르 염료와 같은 상업적 유도체를 포함하는 작은 유기 분자이다.
많은 동물 모델은 특정 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는 데 사용됩니다. 현재까지, 많은 신진 대사 경로 진화의 과정을 통해 보존 설립. 따라서, 제브라피시와 같은 모델 유기체에 대한 IHC 연구는 병리학적 및 비병리학적 조건의 기원 및 유지에 대한 통찰력을 제공할 수 있다17. 이 보고서의 목적은 성인 제브라피시 조직에서 수행될 수 있는 IHC 프로토콜을 설명하고 주변 및 중앙 수준에서 OXA, OX-2R 및 CB1R의 분포 및 국소화에 대한 상세한 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 또한 성인 제브라피시의 말초 및 중앙 조직에서 두 가지 주요 IHC 간접 방법의 적용을 위한 프로토콜이 보고되었다. 설명된 간접 방법은 이차 항체가 형광 염료(면역형광 법) 또는 효소 리포터(면역페록시다아제 방법)에 공액화되는 경우에 신호 증폭을 허용하는 방법이다. 발색성 및 형광 검출 방법 모두 장점과 단점을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에 보고된 것은 IHC의 사용, 주로 면역형광, 성인 제브라피시, 상이한 생리학적 및 병리학적 조건에 걸쳐 진화적으로 보존되는 시스템을 연구하는 데 널리 사용되는 동물 모델이다.

<table><tbody><tr><td>안티 CB1</td><td>Abcam</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>안티 OX-2R</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>안티 OXA</td><td>산타 크루즈</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>아쿠아 텍스</td><td>머크</td><td>1,085,620,050</td><td></td></tr><tr><td>바이오 티닐화 토끼 안티 염소</td><td>Vector Lab</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>니콘 이클립스 Ti2</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>라이카 바이오 시스템</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마 알드리치</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>라이카 바이오 시스템</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 현미경 용 디지털 카메라</td><td>니콘</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 알렉사 플루or 488 활용 2 차 항체와 관련상품</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary 항체</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 절대</td><td>VWR</td><td>20,821,330</td><td></td></tr><tr><td>냉동 단면 화합물</td><td>Leica Biosystem</td><td>FSC 22 냉동 단면 매체</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20,252,290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>Vector lab</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica Biosystem</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>라이카 바이오시스템</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마 알드리치</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 세럼</td><td>시그마 알드리치</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>노멀 래빗 세럼</td><td>Vector lab</td><td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>Carlo Erba</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>Paraphormaldeyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>sodium citrate dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Analytical</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain Elite ABC Kit</td><td>Vector lab</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 퓨어</td><td>Carlo Erba</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

면역 조직 화학 (IHC)는 표지된 항체를 가진 조직 단면도에 있는 표적 항원의 검출에서 관련시키는 높게 과민하고 특정 기술입니다. 최적의 특정 신호를 얻기 위해 각 단계의 최적화가 중요한 다단계 프로세스입니다. IHC를 통해 특정 바이오마커의 분포와 국소화를 감지하여 진화적 보존에 대한 정보를 공개할 수 있습니다. 더욱이, IHC는 비만과 같은 병리학적인 조건에서 바이오마커의 발현 및 분포 변화의 이해를 가능하게 한다. IHC, 주로 면역 형광 기술, 계통 유전학적으로 보존 된 분자의 조직 및 분포를 검출하기 위해 성인 얼룩말에서 사용할 수 있지만, 표준 IHC 프로토콜은 estasbled되지 않습니다. 오렉스신과 엔도칸나비노이드는 음식 섭취와 비만 병리의 통제에 관여하는 두 개의 고도로 보존된 시스템입니다. 여기에 보고된 프로토콜은 오덱신 펩티드(OXA), 오렉스신 수용체(OX-2R), 카나비노이드 수용체(CB1R) 국소화 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장및 뇌분포에 대한 정보를 얻기 위해 사용된다. 또한 면역페록시다아제 및 이중 면역형광에 대한 방법뿐만 아니라 시약의 제제, 고정, 파라핀-임베딩, 제브라피시 조직의 극저온 보호 및 내인성 활성 차단 단계 및 배경을 위한 제제 역염색. 매개 변수의 전체 세트는 우리가 면역 형광이 OXs, OX-2R 및 CB1R 분포, 현지화 및 성인 얼룩말에서 표현의 보존의 이해에 도움이 될 수있는 방법을 보여 준 이전 IHC 실험에서 얻은 조직. 고도로 구체적인 신호 강도를 가진 결과 이미지는 제브라피쉬가 특정 바이오마커의 분포, 국소화 및 진화적 보존에 적합한 동물 모델이라는 것을 확인했습니다. 생리적 및 병리학적 조건. 여기에 제시된 프로토콜은 성인 얼룩말어의 IHC 실험에 권장됩니다.

면역페록시다아제 염색에 대한 대표적인 데이터는 도 1 및 도 2에도시되어 있다. 성인 제브라피시의 장에서 OX-A 및 OX-2R 분포의 면역조직화학적 분석은 DIO 제브라피시의 장세포에서의 OX-A 및 OX-2R의 상이한 국소화 부위 및 이들의 발현 증가를 보여주었다. OX-A에 대한 강렬한 갈색 염색은 내측 및 전방 장의 세포에서 관찰되었다 (도1A,A 1). OX-A의 면역 발현은 다른 창자 구성에서 명확한 신호를 주었고, 내측 장으로 전방에서 감소하였다 (그림1B,B 1). 음극 대조군을 배경에 대한 참조로서 사용하였고 OX-A신호의 특이성을 확인하였다(도 1E). 염색체 DAB에 장기간 노출되면 배경 강도의 증가가 발생...

여기에 제시된 면역성 화학적 특성화 및 오렉스신 펩티드, 오렉스신 수용체, 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장내 엔도칸나비노이드 수용체의 국소화를 위한 프로토콜이 제시되어 있다. 면역 페릭시다아제 및 이중 면역 형광 방법.

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

현재, 면역조직화학은 특정 분자 마커의 존재와 병리학의 경우의 변화를 식별하기 위해 빈도를 증가시키는 데 사용되어 정량적 분석을 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 면역화학, 주로 면역형화 기법은 애벌레와 성인 제브라피쉬 동물 모델에서 사용되지만, 제브라피시를 위한 좋은 표준 면역작용 프로토콜에 대해서는 거의 알려져 있다. 여기서, 우리는 성인 얼룩말물고기에 있는 중요한 단백질의 진화적인 보존을 연구하기 위하여 이용될 수 있는 프로토콜을 설명하고 기술합니다.성인 얼룩말 피시의 면역 조직 화학에 대한 좋은 프로토콜은 매우 보존 된 생체 분자의 형태적 표현과 분포를 연구하기 위해이 동물 모델의 유용성을 강조하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 또한 인간 생리병리학과 상관되는 병리학 적 조건으로 인해 이러한 생체 분자의 가능한 변화를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 Lea Tunisi 박사가 될 것입니다.이 절차를 시작하려면 준비된 냉동 조직 블록을 영하 20도의 냉동 조직 블록으로 전송합니다. 10 마이크로미터의 관상 또는 처진 섹션에서 블록을 잘라냅니다. 그런 다음, 면역 작용화학에 적합한 접착제 유리 슬라이드에 대체 직렬 섹션에서 조직을 수집하고 진행 준비가 될 때까지 영하 20도에서 저장합니다.먼저 용매 방지 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 영역을 해명합니다. 0.1-대구형 인산염 버퍼를 사용하여 5분 동안 각각 섹션을 세 번 헹구는 다. 다음으로, 트리톤 X-100000000000000000000000000000에 0.3밀리리터를 용해하여 트리톤 X-100 0.3%를 준비하여 0.3%트리톤 X-100을 함유한 인산염 완충액에 0.1%의 일반 당나귀 혈청을 용용하여 차단용액을 준비한다.투과화 버퍼 PB-Triton X-100 0.3%에서 용해된 일반 당나귀 혈청의 용액으로 섹션을 배양하여 실온에서 30분 동안 세포막을 침투시키고 비특이적 결합 부위를 차단한다. 먼저, 0.1-대구형 완충제로 5분간 각각 3회 헹구는 다. PB-T에서 희석된 1차 항체의 혼합을 추가하고 실온에서 습한 상자에 밤새 섹션을 배양합니다.다음 날, 0.1-대구물산염 버퍼로 5분 동안 섹션을 세 번 헹구는 다. PB-T에서 희석된 이차 항체의 적절한 혼합에서 실온에서 2시간 동안 섹션을 배양한다. 시작하려면 0.1-대구형 인산염 버퍼로 5분 동안 섹션을 세 번 헹구는 다.핵 염료 DAPI를 준비하기 위해 인산염 버퍼의 3 밀리리터에 DAPI의 1.5 마이크로리터를 용해. 염료의 섹션을 카운터스테인합니다. 그런 다음, 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 덮어 장기간 사용하기 위해 조직과 얼룩을 안정화시하십시오.형광 시료는 섭씨 4도에서 어둠 속에서 보관할 수 있습니다. 면역형성 프로토콜을 반복하고, 1차 또는 이차 항체를 생략하거나, 인산염 완충제로 1차 또는 이차 항혈을 대체하여 음의 대조를 준비한다. 다음으로, 면역형광 프로토콜을 반복하고, 상대펩티드를 초과하여 각 1차 항체를 미리 흡수한다.양적 제어를 준비하기 위해 마우스 뇌 의 조각에 면역 형광 프로토콜을 반복합니다. X-Y-Z 전동 단계, 디지털 카메라 및 획득 및 분석 소프트웨어가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 면역 스테인드 섹션을 관찰하고 분석합니다. 5배, 20배, 40배의 목표로 디지털 이미지를 획득합니다.사용 가능한 각 채널의 낮은 배율에서 각 섹션의 이미지를 가져 와 낮은 배율 몽타주를 구성합니다. 형광 이미지를 최대 대비 및 오버레이로 정규화합니다. 관심 영역 전반에 걸쳐 1~1.8 마이크로미터의 초점 단계를 갖춘 6개의 초점 평면을 통해 일련의 Z 스택의 이미지를 수집합니다.각 채널에 대해 이 컬렉션을 개별적으로 수행합니다. 그런 다음 이미징 데온볼루션 소프트웨어를 사용하여 10회 반복을 적용하여 이미지를 데큐볼레이션하고 직렬 Z-평면 이미지를 단일 최대 프로젝션 이미지로 축소합니다. 적절한 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 빛과 대비를 위해 현미경 그래프를 조정합니다.성인 제브라피시의 장에서 OX-A 및 OX-2R 분포의 면역 조직화학 적 분석은 OX-A 및 OX-2R의 다른 국소화 사이트와 DIO 제브라피시의 장 세포에서의 발현 증가를 보여줍니다. OX-A에 대한 강렬한 갈색 염색은 내측 및 전방 장의 세포에서 관찰된다. OX-A의 면역발현은 전방에서 내장으로 감소하는 다양한 장구획에서 명확한 신호를 제공합니다.DIO 및 대조식이 제브라피쉬의 장에서 OX-2R 면역발현에 대해 유사한 결과가 관찰된다. DIO 성인 제브라피시의 증가된 OX-A 신호에는 다른 장 구획에서 OX-2R의 과발현이 동반됩니다. 면역형 이미지의 정확한 분석은 제어 다이어트 제브라피시에 비해 DIO 성인 제브라피시의 장에서 OX-2R/CB1R 공동국화의 증가를 나타낸다.등지 텔렌스팔론, 시상하부, 광학 텍텀, 투러스 측삭증 및 열등한 엽의 확산 핵과 같은 다른 뇌 영역에서도 유사한 상황이 관찰된다. 오렉신-A 및 CB1R 의 공동 국산화를 통해 이중 면역염색에 의해, 오렉신-A 형광 신호의 증가와 함께 시상하부의 오렉시너기크 뉴런에서 코현지화의 증가가 있었다는 것을 관찰된다. 이러한 결과는 이중 면역 형광이 생리적으로 보존 된 단백질 발현, 표적 단백질의 공동 지역화 및 다른 병리학 적 조건에서의 분포 및 / 또는 발현 변화를 식별하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 보여줍니다.면역 형광을 사용하여 생체 분자의 공동 분포 및 공동 발현, 가능한 상호 작용을 더 잘 이해할 수 있으며, 다른 병리학의 경우 변화에 대한 가시적 이미지를 가질 수 있습니다. 더욱이, 대사 효소 발현 또는 수용체의 신경 해부학 적 분포는 조직 내단백질 신호의 역할을 더욱 드러낼 수 있다. 현재기술적인 연구는 성인 얼룩말피 모델을 사용하여 두 개의 고도로 보존된 시스템인 오레신 및 엔도칸나비노이드를 연구하기 위한 면역형광 접근법을 도입했다.여기에 설명된 이 프로토콜을 사용하여 성인 얼룩말피의 뇌에서 처음으로, 오렉스신-2 수용체및 엔도칸나비노이드-CB1 수용체의 해부학적 분포 및 공동발현이 결정되지 않았다. 우리는 면역 조직 화학 실험을 위해 여기에 설명된 프로토콜을 추천하고 그들의 기능을 더 잘 이해하기 위하여 성인 제브라피시에 있는 펩티드에 있는 수용체의 공간 분포 그리고 조직을 검출하는 것이 좋습니다.

identification-orexin-endocannabinoid-receptors-adult-zebrafish-using

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 면역형광을 사용하여 정상 및 식이 유도 비만(DIO) 성인 제브라피시 뇌 조직에서 오렉신과 카나비노이드 수용체의 공동 국소화를 조사하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

Detection of Orexin and Cannabinoid Receptor Co-localization in Diet-Induced Obese Zebrafish(다이어트 유도 비만 제브라피시에서 Orexin and Cannabinoid Receptor Co-localization in Diet-Induced Obese Zebrafish)

제브라 피쉬의 성인 신장은 신장 재생과 질병 연구를위한 훌륭한 시스템입니다. 이러한 연구의 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 네프론의 세뇨관 조성물을 평가하기 위해 신장 재 흡수를 평가하도록 구현 될 수있는 몇 가지 방법론을 설명한다.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

번식 및 생체 내 연구에 적합한 제브라피시 시설이 쉽고 저렴한 방식으로 지어졌습니다. 유지 보수가 최소화됩니다. 이 시설은 학생 참여 및 독립적인 연구에 이상적입니다.

저렴하고 간편한 구축 Zebrafish의 시설의 건설

제브라피시 배아에 존재하는 저농도 내인성 수용체를 검출하기 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 우리는 이를 AFLIP이라고 명명했는데, 이는 면역침전과 연결된 리간드에 의한 수용체의 친화성 표지로 구성되어 있기 때문입니다.

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속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

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현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

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RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

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면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

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