Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

독성 검사 절차는 박사에 의해 입증될 것입니다.Ashok Aspatwar, 내 실험실에서 수석 연구원. 우리의 프로토콜은 오프 타겟 효과를 식별하고 세포 배양 또는 기타 동물 모델에서 놓칠 수있는 발견의 초기 단계에서 화학 물질의 미묘한 독성 효과를 감지합니다. 우리의 기술의 주요 장점은 : 그것은 신속하고 효율적이며, 매우 적은 양의 화학 물질이 필요하며 실험실의 기본 시설이 필요합니다.

독성 검사는 결핵을 일으키는 원인이 되는 진균에 대하여 그것의 효율성을 공부하고 추가 전임상 계산을 위한 그것의 효율성을 결정하기위한 집중을 결정하는 저희를 도울 것입니다. 이 방법은 화학 물질의 오프 타겟 효과에 대한 통찰력을 사용하므로이 방법은 화학 물질의 독성이 주요 중요한 연구의 모든 영역에서 사용될 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하고 사전 경험없이 누구에 의해 수행 될 수있다.

경험이없는 개인은 실험을 신중하게 계획하고 하나의 화합물을 사용해야합니다. 이 방법은 개발 제브라피시 배아의 현상 적 변화의 형태로 화학 물질의 독성 효과를 제공하고 따라서 테스트 화합물의 안전. 우선, 성인 남성 얼룩말 물고기 2~5개와 성인 암컷 제브라피쉬 3~5개를 하룻밤 동안 짝짓기 탱크에 넣습니다.

아침에는 자동 어둡고 후속 광사이클에 의해 사육이 유도됨에 따라 빛을 켭니다. 동물에 대한 스트레스를 처리하지 않으려면 사육을 위해 동일한 개인을 사용하기 전에 동물이 2 주 동안 휴식을 취하도록하십시오. 다음날 정오에 미세 메쉬 스트레이너를 사용하여 배아를 수집하고 E3 배아 배지가 들어있는 페트리 접시에 옮기습니다.

페트리 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓고 각 배아 배치를 검사합니다. 불투명한 외관을 확인하고 수정되지 않은 또는 죽은 배아로 제거합니다. 배아는 하룻밤 동안 인큐베이터에서 섭씨 28.5도에서 유지하십시오.

다음 날 아침, 스테레오 현미경의 밑에 태아를 검토하고 어떤 건강에 해로운 또는 죽은 태아든지 제거합니다. 정중하의 파스퇴 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 우물로 하나의 배아를 옮기는 다. 각 우물이 배아를 덮을 충분한 E3 배지를 포함하고 있는지 확인하십시오.

냉장고에 섭씨 4도에 저장된 억제제 화합물을 함유한 바이알을 꺼내라. 분석 균형을 사용하여 적절한 양의 화합물을 계량하고 E3 배지 또는 다른 적절한 용매의 각 화합물에 대해 100 밀리머 스톡 솔루션의 250 마이크로리터를 준비합니다. 그런 다음 E3 배지를 사용하여 15 밀리리터 원심 분리기 튜브의 독성 수준에 따라 재고 용액의 직렬 희석을 합니다.

각각 하나의 DPF 배아를 포함하는 우물에서, 파스퇴르 파이펫과 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 한 번에 하나의 행E3 물을 제거합니다. 즉시 낮은 에서 더 높은 농도로 이동 24 웰 플레이트의 우물에 재고 솔루션의 각 희석제의 1 밀리리터를 배포합니다. 대조군의 경우 E3 물 또는 다른 관련 용매를 추가합니다.

화합물의 이름과 농도가 있는 24개의 잘 플레이트를 라벨로 표시하고 배양기에서 섭씨 28.5도에서 플레이트를 유지합니다. 우물내 의 화학 물질의 희석제는 24 웰 플레이트의 측면을 밀봉하여 인큐베이터에서 증발되지 않도록주의하십시오. 화학 화합물의 노출 후 24 시간, 3 %의 높은 분자량 메틸 셀룰로오스를 포함하는 작은 페트리 접시에 화합물의 각 농도에 노출 된 애벌레를 전송하기 위해 파스퇴르 파이펫을 사용합니다.

금속 프로브를 사용하면 옆으로 놓습니다. 카메라에 부착된 스테레오 현미경 아래에 페트리 접시를 놓습니다. 이미지를 가져 와서 실험이 끝날 때까지 매일 별도의 폴더에 이미지를 저장합니다.

온라인 테이블이나 인쇄된 시트에 매일 테이블에 있는 모든 관측을 입력합니다. 신경 독성 화합물 노출의 경우, 4~5개의 DPF 애벌레는 비정상적인 수영 패턴을 나타낼 수 있다. 이 경우 유충의 짧은 30초에서 1분 분량의 비디오를 캡처하여 이러한 변경 사항을 기록합니다.

화학 화합물에 노출된 5일 후에, 배아의 절반이 각 화학 물질의 절반 최대 치명적인 농도로 죽는 농도를 주의하십시오. 적합한 프로그램을 사용하여 모든 농도에 대한 배아의 사망률에 대한 곡선을 구성한다. 이 프로토콜에서, 독성 의 평가의 중요한 부분은 단일 실험에서 하나 또는 다중 화학 화합물의 상이한 농도를 테스트한다.

유충에서 어떤 현상 불량 결함을 유도하는 화합물의 경우, 결함은 화학 물질에 대한 노출 후 1~5일 동안 24시간마다 기록되었다. 250 마이크로몰러 및 125 마이크로몰러의 농도에서 베타 CA 억제제로 치료된 배아는 대조군과 비교하여 다양한 현상 적 결함을 나타낸다. 예를 들어, 3일째에도 해치되지 않은 배아, 구부러진 신체 구조, 활용되지 않은 노른자 낭 및 심근 부종, 치료 후 5일 후에 애벌레에 이스톨리스 주머니가 없다.

또 다른 연구에서는 CA 억제제로 치료된 배아는 이토리스 주머니와 수영 방광의 부재를 보여주었습니다. 실험은 500 마이크로몰러에서 배아 발달 중에 최소한의 또는 현상이 없는 변화를 유도한 대표적인 화합물 탄산 anhydrase 9를 확인했습니다. 화합물은 높은 LC50 농도를 보였다.

그러나, 대조군과 비교하여, 300 마이크로몰러에서 동일한 화합물은 5일간의 노출 후 애벌레에서 신경독성및 유도된 운동실조인 것으로 밝혀졌다. 배아의 좋은 품질은 화학 물질의 독성 검사에 중요합니다. 양질의 배아를 얻기 위해, 번식성인 제브라피쉬의 젊은 쌍을 사용합니다.

안전한 것으로 나타나는 화합물은 시험관 내 및 생체 내 실험에서 관련성을 발휘함으로써 더욱 특징지을 수 있다. 항결핵 약물 개발 분야에서, 이 기술은 제브라피시 배아에서 진균 마리넘의 생체 내 억제를 위한 추가 실험을 설정하는 것을 도왔습니다. 프로토콜은 인간에게 유독할 지도 모르다 화학제품의 사용을 관련시킵니다.

실험에 관여하는 사람은 화학 물질을 취급할 때 적절한 주의를 기울여야 합니다.