Name: 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 학습하세요 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자를 식별하는 방법을 배우세요. 이 기술은 정확성과 민감도, 고처리량을 동시에 제공하여 전통적인 독성 유사체 기반 방법보다 우수합니다.

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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(보조금 제21676026호), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFD0201400), 중국 박사후 과학 재단(2017M620643)이 공동으로 지원했습니다. UCLA 진보 연구소 (소주)의 작품은 장쑤성과 쑤저우 산업 단지의 내부 보조금에 의해 지원되었다.

1. 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자를 발현하는 플라스미드의 구축
<ol><li>표적 아미노산에 대한 적절한 수의 공통 코돈이 포함된 마커 유전자를 선택한다. 참고: L-류신의 경우, 29개의 류신 코돈이 함유된 카나마이신 내성 유전자 kanR은 27개의 일반적인 코돈이며, 선택시스템(13)의시공에 사용된다. 19개의 류신 코돈 중 17개의 일반적인 코돈, 또는 보라색 단백질 인코딩 유전자 prancerpurple (ppg)를 포함하는 gfp 유전자는, 14 leucine 일반적인 코동을 항구하는, 검열 체계를 위해 이용됩니다 (보충표 1 ).</li>
	<li>마커 유전자의 일반적인 코돈들을 동의어인 희귀 코돈으로 대체합니다. L-류신의 경우, 칸 R, gfp,또는 ppg에서 코동을 희귀 코돈 CTA로 교체하고, kanR-RC, gfp-RC,또는 ppg-RC를생성하며, 각각13 보충 표1). 참고: 마커 유전자에 있는 희소한 코돈의 주파수는 선택 또는 검열 시스템의 엄격성에 영향을 미칠 것입니다. 일반적으로, 희귀 코돈의 수를 증가선택 또는 선별 시스템의 엄격성을 증가시킬 것이다. 적절한 선택 또는 선별 강도를 달성하기 위해, 희귀 코돈의 다른 번호를 항구 마커 유전자의 시리즈를 설계하고 그 효과를 비교.</li>
	<li>유전자 합성을 위해 GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/)와 같은 도구를 사용하여 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자의 빌딩 블록을 생성합니다. 대안적으로, 상업적 유전자 합성 서비스에서 마커 유전자를 주문한다.<ol>
<li>GeneDesign 페이지에서 빌딩 블록 디자인(일정한 길이 중복)을선택합니다.</li>
		<li>서열 상자에 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자의 서열을 붙여 넣습니다.</li>
		<li>어셈블리 올리고사이의 중첩 길이를 정의합니다. 기본 값 40bp는 대부분의 시퀀스에서 잘 작동합니다. 참고: 다른 매개 변수의 설정에 대한 자세한 지침은 온라인 설명서를 참조하십시오.</li>
		<li>디자인 빌딩 블록 버튼을 클릭하고 페이지에 나열된 올리고뉴클레오티드를 주문합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 희귀 코돈 변형 유전자를 합성하는 것은15.</li>
	<li>희귀 코돈이 풍부한 칸 R-RC를 벡터 pET-28a, gfp-RC에서 pSB1C3으로, 및 ppg-RC를 CPB-37-44116으로리게이트한다. 참고 : pET-28a 및 pSB1C3 플라스미드지도는 SnapGene 온라인 플라스미드 데이터베이스 (보충표1)에서 사용할 수 있습니다. CPB-37-441 플라스미드 맵은 ATUM 발색 단백질 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.<ol>
<li>얼음에, 어셈블리 믹스의 어금니 비 1:1 ~ 7.5 μL의 벡터와 마커 조각을 추가합니다(재료 표참조)를 총 부피 10 μL에 추가합니다. 샘플을 50°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>조립 제품의 5 μL을 30s용 42°C에서 50 μL의 유능한 셀(재료 표참조)으로 변환합니다.</li>
		<li>SOC (이화 질 억압을 가진 슈퍼 최적의 국물) 배지에서 세포를 회수하여 37 °C에서 1 시간 동안, LB (리소제니 국물) 한천 배지에 접시에 담고 밤새 37 °C에서 배양하십시오.</li>
		<li>콜로니를 LB 배지로 접종하고 8 시간 동안 37 °C에서 배양합니다.</li>
		<li>바람직한 상용 키트를 사용하여 플라스미드를 분리한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 선택 조건 최적화
<ol><li>유능한 세포로 돌연변이 발생에 사용되는 부모 변형을확인 17.</li>
	<li>야생형 칸R을운반하는 1 μL의 플라스미드로 관할 세포의 50 μL을 변형시키고, 칸 R-RC29를 함유하는 플라스미드를 모든 류신 코돈이 희귀로 대체된 플라스미드로 다른 세트를 변형시킨다. 코돈 CTA.</li>
	<li>SOC 배지 950 μL을 첨가하고 37°C에서 250 rpm에서 1시간 동안 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.</li>
	<li>플레이트 100 μL을 LB 한천 배지 상에 50 μg/mL-1 카나마이신을 함유하고, 콜로니가 나타날 때까지 약 8시간 동안 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>야생형 칸R과 류신희귀코돈이 풍부한 칸R-RC29를 포숙하는 콜로니를 선택하고 각각 50 μg/mL-1 카나마이신을 함유한 5배 희석LB 배지(0.2x LB)의 5mL을 접종한다. 샘플을 37°C에서 250 rpm에서 셰이커로 인큐베이션합니다. 참고: 매체는 선택 시스템에 매우 중요합니다. 희귀 코돈 변형 유도체가 아닌 야생 형 유전자로부터 항생제 내성 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 탄소 및 질소를 함유해야 한다. 이 때, 1x LB 배지에서의 L-류신 농도가 너무 높아서 희귀 코돈이 풍부한 칸R로부터의 단백질 발현을 완전히 억제한다. 따라서, 희석된 LB 배지와 같은 희석 인자를 가진 5는 야생형 및 희귀코돈이 풍부한 유전자로부터 단백질 발현에 명확한 차이를 생성하는데 사용된다.</li>
	<li>각 세포 배양물의 200 μL을 정의된 시점(예를 들어, 8시간, 16시간 및 24시간)에서 삼중항으로 96웰 플레이트로 이송한다. 플레이트 리더를 사용하여 OD 600(600 nm에서 광학 밀도)을 측정합니다. 참고: 야생형 마커 유전자를 포숙하는 균주의 OD600과 비교하여 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자를 품고 있는 균주에 대해 세포 OD600의 감소를 검출할 수 없는 경우, 마커 유전자를 사용하거나 더 희석 된 매체를 사용합니다.</li>
	<li>희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자(예를 들어, kan R-RC29)의발현이 표적 아미노산의 농도를 증가시킴으로써 복원될 수 있는지 시험하기 위해 아미노산 공급 분석실험을 수행한다. 참고 : L-류신 과잉 생산자의 선택을 위해, L-류신은 먹이에 사용됩니다.<ol>
<li>칸 R-RC29 마커 유전자를 0.2x LB의 5 mL로 수용하는 균주를 접종 (50 μg·mL-1 카나마이신 함유)의 공급 유무에 관계없이 1 g·에 L-1 L-류신. 야생형 칸R을 대조군으로 하는 균주와 0.2x LB의 또 다른 5mL를 접종한다. 샘플을 37°C에서 250 rpm에서 셰이커로 인큐베이션합니다.</li>
		<li>정의된 시점(예: 15h, 17h, 19h 및 22h)에서 각 배양권에 대해 OD600을 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 선별 조건 최적화
<ol><li>야생형 gfp 또는 야생형 ppg를운반하는 플라스미드 1 μL(~50 ngμl-1)으로 돌연변이 발생에 사용되는 모균의 50 μL을 변형시킨다. 또한, 마커 유전자의 희귀 코돈이 풍부한 유도체로 부모 균주를 변형시킨다.</li>
	<li>SOC 배지 950 μL을 첨가하고 37°C에서 250 rpm에서 1시간 동안 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.</li>
	<li>적절한 항생제를 함유하는 LB 한천 배지상에 세포 배양된 플레이트 100 μL(cm R 마커를 운반하는 gfp 플라스미드에 대한 25 μg·mL-1 클로람페니콜, 또는 ppg에 대한 50 μg·mL-1 카나마이신 칸 R 마커를 운반하는 플라스미드)를 37°C에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>야생형 gfp 또는 ppg를 품고 있는 하나의 식민지와 해당 희귀 코돈이 풍부한 유도체를 품고 있는 하나의 식민지를 선택하고, 이를 적절히 희석된 LB 배지의 5 mL로 개별적으로 옮긴다. 샘플을 37°C에서 250 rpm에서 셰이커로 인큐베이션합니다. 참고: 류신 희귀 코돈이 풍부한 gfp-RC 또는 ppg-RC를품고 있는 대장균 균주의 경우, 희석되지 않은 LB 배지(1x LB)를 사용하여 야생형 및 희귀 코돈이 풍부한 마커의 발현에 상당한 차이를 만들 수 있습니다. 유전자. 또한, 유도성 프로모터는 스크리닝 마커 유전자의 발현을 유도하는 데 사용된다. 세포가 지수 단계에 진입할 때 유도를 시작하여 더 나은 차별을 달성합니다.</li>
	<li>형광 마커의 경우, 각 세포 배양물의 200 μL을 정의된 시점(예: 2h, 4h 및 6시간)에서 삼중으로 96웰 의 투명한 바닥 블랙 플레이트로 옮긴다. OD600 및 형광을 측정하고 형광 강도를 계산합니다(OD600에대한 형광의 비율). 염색체 마커의 경우 세포 배양의 색상 개발을 측정합니다. 참고: 야생형 gfp를 품고 있는 균주와 비교하여 gfp-RC를 수용하는 균주에 대해 낮은 형광 강도를 검출할 수 없거나 보라색 단백질을 발현하는 세포에 대해 더 밝은 색을 검출할 수 없는 경우 ppg-RC로부터 야생형 유전자보다, 마커 유전자상에 희귀 코돈의 수를 증가시키려고 하거나 보다 희석된 배지를 사용한다.</li>
	<li>수유 분석(단계 2.7.1 및 2.7.2 참조)을 수행합니다. 정의된 시점(예: 12h, 18h 및 24시간)에서 형광 강도 또는 색 개발을 측정합니다.</li>
</ol>4. 아미노산 과잉 생산자의 식별
<ol><li>돌연변이체의 배양물의 100 μL을 LB 배지(2% v/v)의 5 mL로 접종하고 OD 600의 값이 0.4에 도달할 때까지 37°C에서 250 rpm에서 250 rpm에서 쉐이커에 배양한다.</li>
	<li>돌연변이를 유능한 세포로 만드십시오17.</li>
	<li>플라스미드의 1 μL(~50 ng·μL-1)을 가진 돌연변이세포의 50 μL을 변형시켜 칸 R-RC29 또는 스크리닝 마커gfp-RC 또는 ppg-RC를운반하는 선택 마커를 운반한다. SOC 배지 950 μL을 넣고 37°C 셰이커에서 1시간 동안 시료를 회전시다.</li>
	<li>아미노산 과잉 생산자를 선택합니다.<ol>
<li>세포 배양을 4,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상판액을 버리고 50 μg·mL-1 카나마이신을 함유하는 0.2x LB 배지의 5 mL를 첨가한다. 샘플을 밤새 37°C 셰이커로 인큐베이션합니다.</li>
		<li>플레이트 하룻밤 배양 (예를 들어, 100 μL, 배양된 세포 밀도에 따라 다름)을 50 μg·mL-1 카나마이신을 함유하는 0.2x LB 한천 배지 상에 12시간 동안 37°C에서 배양한다. 참고: 개발된 콜로니는 표적 아미노산 과잉 생산자의 후보이며, 이 경우 L-류신 과잉 생산자.</li>
	</ol></li>
	<li>아미노산 과잉 생산자를 스크리마.<ol>
<li>적절한 항생제(gfp-RC 및 50 μg/mL로 스크리닝를 위한 25 μg·mL-1 클로람페니콜)를 함유하는 LB 한천 배지상에 스크리닝 마커(예를 들어, 100 μL)를 포르팅하는 적절한 수의 세포(예를 들어, 100 μL)를 플레이트 -1 가나마이신을 ppg-RC로스크리닝하고 8시간 동안 37°C에서 배양한다.</li>
		<li>적절한 항생제를 함유하는 LB 배지를 접종(단계 4.5.1 참조)을 플레이트로부터 각 단일 콜로니와 함께 접종한다. 샘플을 37°C에서 250 rpm에서 셰이커로 인큐베이션합니다.</li>
		<li>gfp-RC가 사용되는 경우 OD600 및 형광을 측정하고 형광 강도를 계산합니다. ppg-RC가 사용되는 경우 세포 배양의 색 개발을 측정합니다. 부모 균주의 그것보다 더 높은 형광 강도 또는 더 깊은 색상을 나타내는 균주는 후보 아미노산 과잉 생산자이며, 이 경우, L-류신 과잉 생산자. 참고: 형광 활성화 세포 선별은 희귀 코돈이 풍부한 형광 단백질 유전자가 스크리닝에 사용될 때 단일 세포 고생산자를 식별하는 데도 적합합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>후보 균주의 아미노산 생성성을 확인합니다.<ol>
<li>각각의 후보 균주와 LB 배지의 5 mL을 접종하고 세포가 37°C에서 250 rpm에서 셰이커에서 밤새 성장하게 하였다.</li>
		<li>세포 배양 1 mL에서 세포를 4,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리하여 수확하십시오.</li>
		<li>세포 현탁액의 200 μL로 4% 포도당을 함유하는 M9 배지의 20 mL을 접종하고 250 rpm에서 250 mL 쉐이커에서 24 시간 동안 배양한다.</li>
		<li>배양 배지의 원심분리기 는 4,000 x g에서 5 분 동안. 깨끗한 1.5 mL 튜브로 상판의 200 μL을 옮긴다. 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1 g·1g~의 L-류신 용액(HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 등급 준비 L-1을 표준으로.</li>
		<li>100 μL의 트리에틸아민과 1M 페닐 이소티오차네이트의 100 μL을 상급자 및 표준에 추가하고, 부드럽게 혼합하고, 1 시간18에대한 실온에서 배양한다. 주의: 트리에틸아민과 페닐 이소티오시오야네이트는 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있으며 흡입시 유해합니다. 장갑과 마스크를 착용하고 가능하면 연기 후드에서이 단계를 수행하십시오.</li>
		<li>동일한 튜브에 400 μL의 n-헥산을 추가하고 10 s. 0.2 μm 폴리테트라플루오로에틸렌 막을 통해 아미노산 유도체를 포함하는 하부 상을 필터링합니다. 주의: n-헥산은 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 장갑과 보호복을 착용하십시오. 피부에 닿으면 충분한 물로 피부를 헹구어 주세요.</li>
		<li>99.3:0.7 부피비에서 0.1M 나트륨 아세테이트(pH 6.5)와 아세토니트릴을 혼합하여 이상 A를 준비한다. 아세토니트릴(80% v/v)을 이머지 B. 0.2 μm 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인을 통해 모든 이동 상을 걸러내도록 준비합니다. 주의: 아세트니트릴은 흡입시 유해하며 피부와 눈의 자극을 유발할 수 있습니다. 장갑과 보호복을 착용하고 연기 후드에서 이 단계를 수행합니다.</li>
		<li>표 1의 용출 프로그램에 따라 C18 컬럼이 장착된 초HPLC에서 시료의 1 μL을 0.42 mL,min-1의 유속및 40°C의 컬럼 온도를 가진 실행한다. 다이오드 어레이 검출기로 254 nm에서 표적 아미노산을 검출하고 피크 영역을 표준 곡선에 매핑하여 농도를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시간(최소)</td>
			<td>단계 A(%)</td>
			<td>이면 단계 B (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>98세</td>
			<td>2개</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.5</td>
			<td>70세</td>
			<td>30개</td>
		</tr>
<tr>
<td>7명</td>
			<td>43세</td>
			<td>57세</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.1</td>
			<td>0</td>
			<td>100개</td>
		</tr>
<tr>
<td>11세</td>
			<td>98세</td>
			<td>2개</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 아미노산의 정량화를 위한 용출 프로그램.

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저자는 공개 할 것이 없다.

마커 유전자및 선택 또는 스크리닝 배지에서 희귀 코돈의 수는 희귀 코돈 변형 마커 유전자로부터단백질 발현을 억제하는 데 중요하다. 야생형 마커 유전자와 이들의 유도체로부터의 단백질 발현 사이에 유의한 차이가 검출되지 않으면, 희귀 코돈의 수를 증가시키거나 영양분 제한 배지를 사용하여 차이를 증폭시킬 수 있다. 그러나, 억제 효과가 너무 강한 경우, 단백질 발현은 해당 아미노산의 추가 공급에 의해서도 회복되지 않을 수 있다. 이 경우, 마커 유전자의 희귀 코돈의 수는 스트레스의 일부를 완화하기 위해 감소되어야한다. 선택 또는 스크리닝 엄격성을 미세 조정하는 또 다른 방법은 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자의 카피 수 및 발현 수준을 조정하는 것입니다. 마커 유전자의 카피 수 및 발현 수준을 감소시키는 것은 일반적으로 아미노산 과잉 생산자와 초기 긴장 사이 더 강한 분화로 이끌어 냅니다. 따라서, p15A 또는 pSC101과 같은 낮은 카피 수 복제 기원뿐만 아니라 약한 프로모터를 포함하는 벡터를 사용해야 한다. 마커 유전자가 유도성...

아미노산의 현재 생산 발효에 크게 의존. 그러나, 대부분의 아미노산 생산 균주에 대한 적시및 수율은 수십억 달러의 가치가 있는 글로벌 아미노산 시장의 수요 증가에 미치지못하고1,2. 고성능 아미노산 과잉 생산자를 얻는 것은 아미노산 산업의 업그레이드에 매우 중요합니다.
아미노산 과잉 생산자를 식별하는 전통적인 전략은 단백질 합성에서 아미노산과 그유사체 사이의 경쟁을 악용 3,4. 이들 유사체는 상응하는 아미노산을 인식하고 펩티드 사슬의 연신을 억제하는 tRNAs를 충전할 수 있으며, 이는 체포된 성장 또는 세포 사멸을 초래한다5. 아날로그 응력에 저항하는 한 가지 방법은 세포 내 아미노산의 농도를 증가시키는 것입니다. 농축 된 아미노산은 유한 tRNAs에 대한 유사체를 능가하고 기능성 단백질의 올바른 합성을 보장합니다. 따라서, 유사체에서 살아남는 균주를 선택할 수 있고 상응하는 아미노산의 과잉 생산자일 가능성이 있다.
L-류신 6와 같은 아미노산에 대한 과잉 생산자를선택하는 데 성공했지만 아날로그 기반 전략은 심각한 단점을 겪고 있습니다. 한 가지 주요 관심사는 돌연변이 발생 의 과정에서 또는 자발적인 돌연변이를 통해 서 유래 아날로그 저항이다. 저항이있는 균주는 아날로그5를차단, 내보내기 또는 저하시켜 선택을 벗어날 수 있습니다. 또 다른 관심사는 다른 세포 과정에 아날로그의 독성 부작용7. 결과적으로, 아날로그 선택에서 살아남은 균주는 아미노산 과잉 생산자가 아닐 수 있으며, 원하는 과잉 생산자는 부정적인 부작용으로 인해 거짓으로 박멸 될 수 있습니다.
여기서, 코돈 편향의 법칙에 기초한 새로운 전략이 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 신속한 식별을 달성하기 위해 제시된다. 대부분의 아미노산은 숙주 유기체8,9에의해 다르게 선호되는 하나 이상의 뉴클레오티드 삼중항에 의해 인코딩된다. 몇몇 코돈은 코딩 순서에서 드물게 사용되지 않으며 희소한 코돈으로 불립니다. 아미노산으로의 그들의 번역은 해당 아미노산을 운반하는 코그네이트 tRNAs에 의존합니다. 그러나, 희귀 코돈 인식 하는 tRNAs는 일반적으로 일반적인 코돈10,11의tRNAs 보다 훨씬 낮은 풍부. 따라서, 이러한 희귀 한 tRNAs는 다른 이소 수용자와의 경쟁에서 자유 아미노산을 포착 할 가능성이 적으며, 희귀 코돈이 풍부한 서열의 번역은 감속하기 시작하거나 아미노산의 양이 제한될 때 종료됩니다. 10. 번역은, 이론적으로, 해당 아미노산의 과잉 생산 또는 추가 공급으로 인해 동의어 일반적인 tRNAs를 충전 한 후 아미노산 잉여가있는 경우 복원 될 수있다12. 희소코돈이 풍부한 유전자가 선택 또는 스크리닝 마커를 인코딩하는 경우, 상응하는 표현형을 나타내는 균주는 쉽게 식별될 수 있으며 표적 아미노산의 과잉 생산자일 가능성이 높습니다.
상기 전략은 아미노산 과잉 생산자의 식별을 위한 선택 및 스크리닝 시스템을 확립하기 위해 적용된다. 선택 시스템은 항생 저항 유전자(예를 들어, kan R)를 마커로서 사용하며, 스크리닝 시스템은 형광(예를 들어, 녹색 형광 단백질[GFP]) 또는 염색체성(예를 들어, PrancerPurple) 단백질을 인코딩하는 유전자를 사용한다. 두 시스템의 마커 유전자는 그것의 동의어 드문 대안으로 표적 아미노산에 대한 일반적인 코돈의 정의 된 숫자를 대체하여 수정됩니다. 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자를 수용하는 돌연변이 라이브러리의 균주는 적절한 조건 하에서 선택되거나 스크리며, 표적 아미노산의 과잉 생산자는 쉽게 식별될 수 있다. 워크플로우는 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자 시스템의 구축으로 시작하여 작업 조건의 최적화를 거친 다음 아미노산 과잉 생산자의 식별 및 검증을 수행합니다. 이 아날로그 독립적 인 전략은 단백질 번역의 교리를 기반으로하며 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 신속한 식별을 가능하게하는 실질적으로 검증되었습니다. 이론적으로, 그것은 직접 희귀 코돈과 모든 미생물 아미노산에 고용 될 수 있습니다. 대체로, 희귀 코돈 기반 전략은 특정 아미노산에 대한 적절한 유사체를 사용할 수 없거나 높은 거짓 긍정률이 주요 관심사인 경우 기존의 아날로그 기반 접근법에 대한 효율적인 대안으로 작용할 것입니다. 아래 프로토콜은 대장균 L-류신 과잉 생산자를 식별하는 이 전략을 입증하기 위해 류신 희귀 코동을 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>Thermo</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure HiPure 플라스미드 MiniPrep 키트</td><td>트랜스젠</td><td>EM111-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure 퀵 젤 추출 키트</td><td>트랜스젠</td><td>EG101-01</td><td></td></tr><tr><td>깁슨 어셈블리 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필&베타;-D-1-티오갈락토피라노사이드</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>n-hexane</td><td>Thermo</td><td>H3061</td><td></td></tr><tr><td>Phenyl isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1034</td><td></td></tr><tr><td>PrancerPurple CPB-37-441</td><td>ATUM</td><td>CPB-37-441</td><td></td></tr><tr><td>TransStar FastPfu Fly DNA 중합효소</td><td>트랜스젠</td><td>AP231-01</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>초고성능 액체 크로마토그래</td>피 <td>Agilent</td><td>1290 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Wild type C. glutamicum</td><td>ATCC</td><td>13032</td><td></td></tr><tr><td>XL10-Gold E. coli 유능 세포</td><td>Agilent</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 컬럼 Agilent</td><td></td><td>959759-902케이</td><td></td></tr></tbody></table>

희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자 식별

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

아미노산에 대한 계속 성장하는 시장을 만족시키기 위해서는 고성능 생산 균주가 필요합니다. 아미노산 과잉 생산자는 아미노산과 그들의 유사체 사이 경쟁을 이용하 여 전통적으로 확인됩니다. 그러나, 이 아날로그 기반 방법은 낮은 정확도이며, 특정 아미노산에 대한 적절한 유사체는 제한된다. 여기에서는 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 민감하며 처리량이 높은 스크리닝을 가능하게 하는 대체 전략을 제시합니다. 이 전략은 코돈이 코딩 DNA에서 발생 빈도에 따라 일반적이거나 희귀 한 것으로 분류되는 단백질 번역에서 코돈 사용 편향현상에서 영감을 받습니다. 희귀 코돈의 번역은 기아하에 코그네이트 아미노산에 의해 완전히 충전 될 수없는 해당 희귀 전사 RNAs (tRNAs)에 달려 있습니다. 이론적으로, 희귀 한 tRNAs는 동의어 일반적인 이소 수용인을 충전 한 후 아미노산의 잉여가있는 경우 충전 될 수있다. 따라서, 희소한 코돈에 기인한 지체번역은 대응하는 아미노산의 공급 또는 세포내 과잉 생산에 의해 복원될 수 있었다. 이러한 가정하에, 표적 아미노산의 일반적인 코돈들을 항생제 내성 유전자 또는 유전자의 동의어드문 대안으로 대체함으로써 아미노산 과잉 생산자를 식별하기 위한 선택 또는 스크리닝 시스템이 확립된다. 형광 또는 발색성 단백질을 인코딩합니다. 우리는 단백질 발현이 희소한 코돈의 통합에 의해 크게 방해될 수 있고 단백질의 수준이 아미노산 농도와 긍정적으로 상관관계가 있다는 것을 보여줍니다. 이 시스템을 사용 하 여, 여러 아미노산의 과잉 생산자 돌연변이 라이브러리에서 쉽게 밖으로 선별 될 수 있습니다. 이 희소한 코돈 기지를 둔 전략은 단지 단 하나 수정한 유전자를 요구하고, 호스트는 그밖 방법에서 보다는 선택을 탈출하기 위하여 확률이 낮습니다. 그것은 아미노산 과잉 생산자를 얻기 위한 대체 접근 을 제안 합니다.

선택 시스템의 경우, 희귀 코돈이 풍부한 항생 저항 유전자를 품고 있는 균주에 대한 OD600의 급격한 감소는 야생형 항생저항유전자를 배양할 때 균주에 비해 관찰되어야 한다. (그림1a)를참조하십시오. 동일한 조건하에서, 항생저항성 유전자에서 희귀 코돈의 수가 증가함에 따라 세포 OD600의 감소가 더욱 명백해진다(도1a). 단백질 발현에 대한 희귀 코돈의 억제는 대부분 굶주인 조건에서 일어난다는 점에 유의해야합니다. 따라서, LB 배지가 적절히 희석되지 않은 경우, 야생형 유전자를 항하는 균주에 비해 희귀코돈이 풍부한 마커 유전자를 항재하는 균주에 대해 세포OD(600)의 유의한 감소가 관찰되지 않을 것이다(도1b). 상응하는 아미노산의 추가 수유 후,...

이 연구는 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 달성하기 위해 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자를 식별하는 기존의 독성 아날로그 기반 방법에 대한 대체 전략을 제시합니다.

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

이 방법은 아미노산 과잉 생산자를 얻기에 기존의 아날로그 기반 접근 방식에 효율적인 대안을 제공합니다. 이 기술은 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 제공함으로써 기존의 아날로그 기반 방법을 능가합니다. 이 방법은 아미노산 과잉 생산 강도와 희귀 코돈의 번역을 이해하는 새로운 빛을 발산하고, 이론적으로, 모든 미생물에 적용 할 수 있습니다.이 프로토콜은 주로 따르기 쉬운 기본 분자 실험 작업에 의존하지만 긴장 문자열의 적절한 선택을 달성하기 위해 여러 시험을 요구할 수 있습니다. 이 기술의 시각적 데모는 아미노산 생산자를 식별하는 선택 및 선별 시스템의 성능에 대한 직접적인 감사를 제공합니다. 이 절차를 시작하려면, 마커 조각에 벡터를 추가, 얼음에, 1 ~ 7 점 조립 믹스의 어셈블리 믹스의 어셈블리 의 어퍼 비에 10 마이크로 리터의 총 부피에.1 시간 동안 섭씨 50도에서 배양하십시오. 조립 제품의 5마이크로리터를 섭씨 42도에서 50마이크로리터로 30초 동안 변환합니다. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 카타볼라이트 억압 배지로 슈퍼 최적 국물에 있는 세포를 복구하십시오.그런 다음 LB Agar 매체에 접시를 만들고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 플라스미드를 분리하기 위해 선호하는 상업용 키트를 사용합니다. 첫째, 야생형 KanR을 운반하는 플라스미드의 마이크로리터 1개로 유능한 세포의 50마이크로리터를 변환합니다.희귀 코돈 CTA로 대체된 모든 류신 코돈으로 KanR RC 29를 함유하는 플라스미드로 유능한 세포의 두 번째 세트를 변환합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양을 플레이트 및 배양한다. 다음으로, 희귀 코돈이 풍부한 유도체에서 야생형 선택 마커 유전자를 개별적으로 5배 희석LB 배지의 5밀리리터로 밀리리터당 50마이크로그램의 농도로 이송한다.250 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양합니다. 이어서, 정의된 시점에서 삼중판으로 각 세포 배양의 200마이크로리터를 96웰 플레이트로 이송한다. 플레이트 판독기를 사용하여 OD600을 측정합니다.칸르신을 함유하고 있는 0.2 x LB 배지의 5밀리리터 2세트에서 KanR RC 29 마커 유전자를 수용하는 얼룩을 L-류신의 공급 유무에 관계없이 접종한다. 리터당 1그램의 최종 농도에 L-류신을 매체 중 하나에 추가합니다. 250 rpm에서 흔들림과 37섭씨37도에서 셰이커에 샘플을 배양하고 정의 된 시점의 각 문화에 대한 OD600을 측정합니다.시작하려면, 야생 형 GFP 또는 야생 형 PPG를 운반하는 플라스미드의 하나의 마이크로 리터로 돌연변이 발생에 사용되는 부모 균주의 50 마이크로 리터를 변환합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양을 플레이트 및 배양한다. 다음으로, 제대로 희석된 LB 배지의 5밀리리터로 개별적으로 콜로니를 옮기.250 rpm에서 흔들어와 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양. 형광 마커의 경우, 정의된 시점의 트리플리케이트에서 세포 배양200 마이크로리터를 96개의 잘 맑은 바닥 백 플레이트로 옮기는다. 형광에서 OD600을 측정하고 형광 강도를 계산합니다.염색체 마커의 경우 세포 배양의 색상 개발을 측정합니다. 이전에 설명한 바와 같이 수유 분석서를 수행하고 정의된 시점의 형광 강도 또는 색상 개발을 측정합니다. 먼저, 선택 마커 KanR RC(29)를 운반하는 플라스미드의 1마이크로리터로 돌연변이 세포의 50마이크로리터를 변환하거나, 또는 선별 마커 GFP RC 또는 PPG RC를 변환한다. 다음으로, 세포 배양을 5분 동안 4000배 G로 원심분리합니다.선택을 위해, 상체를 버리고 선택 마커를 운반하는 세포에 카나마이신을 함유하는 0.2 x LB 배지의 5 밀리리터를 추가한다. 섭씨 37도에서 셰이커로 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 문화를 카나마이신을 함유한 0.2 x LB 천 배지에 접시를 달고 12시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.스크리닝을 위해, 적절한 항생제를 함유하는 LB 천 배지에 스크리닝 마커를 수용하는 적절한 수의 세포를 플레이트한다. 8시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. 그 후, 플레이트로부터 각 단일 콜로니와 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지를 접종한다.250 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 셰이커에 샘플을 배양합니다. GFP RC를 사용하는 경우 OD600 및 형광을 측정하고 형광 강도를 계산합니다. PPG RC를 사용하는 경우 세포 배양의 색상 개발을 측정합니다.후보균의 아미노산 생성성을 확인하기 위해, 각 응시자 균주와 LB 배지의 5밀리리터를 접종하여 종자 배양을 준비하고 세포가 250 rpm및 섭씨 37도에서 셰이커에서 하룻밤 사이에 성장할 수 있도록 합니다. 다음 날, 세포 배양의 1 밀리리터에서 2 분 동안 4000 회 G에서 원심분리하여 세포를 수확하십시오. 상체를 버리고 1 밀리리터의 멸균물로 팔레트를 다시 분리합니다.20 밀리리터의 M9 배지는 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 함유하고 250 rpm에서 250 밀리리터 셰이커와 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 원심분리기 는 5 분 동안 4000 배 G에서 배양 배지의 1 밀리리터. 200 마이크로리터의 초미세먼지를 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮킨다.여기에 표시된 농도로 L-류신 표준 솔루션을 준비하십시오. 연기 후드에, 1 밀리머 트리에틸라민의 100 마이크로 리터와 1개의 어금니 페닐 이소티오카네이트의 마이크로리터를 슈퍼나틸트와 표준 모두에 추가합니다. 용액을 부드럽게 섞고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 동일한 튜브에 400 마이크로리터를 추가하고 10 초 동안 소용돌이를 피하십시오. 하부 상에는 아미노산 유도체가 포함되어 있으며 HPLC 분석에 사용됩니다. 0.2 마이크로리터 폴리테트라플루오로로틸렌 멤브레인을 통해 하부 위상을 필터링합니다.그런 다음 분당 0.42 밀리리터의 유속과 40°C의 열 온도가 있는 C18 컬럼을 장착한 초HPLC에서 샘플의 마이크로리터 1개를 실행합니다. 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 254 나노미터에서 표적 아미노산을 감지하고 표준 곡선 아래의 피크 영역을 매핑하여 농도를 계산합니다. 이 연구에서 아미노산 과잉 생산자는 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 달성함으로써 식별됩니다.선발 시스템의 경우, 희귀 코돈이 풍부한 항생저항 유전자를 수용하는 균주에 대한 OD600의 급격한 감소는 야생형을 수용하는 균주에 비해 관찰되어야 한다. 단백질 발현에 희귀 코돈의 억제는 주로 굶주리고 있는 조건 하에서 일어난다. 해당 아미노산의 추가 공급 후, 희귀 코돈이 풍부한 항생제 내성 유전자를 수용하는 균주에 대한 OD600이 크게 증가한다.스크리닝 시스템의 경우, 형광 세포의 수에 있는 형광 강도는 야생형 유전자보다 희귀 코돈이 풍부한 유전자로부터 형광 단백질을 표현하는 균주에 대해 현저히 낮다. 해당 아미노산의 공급은 희귀 코돈이 풍부한 유전자에서 단백질 발현을 회복시킬 것이다. 보라색 단백질을 사용하는 경우, 희귀 코돈이 풍부한 PPG로부터 개발된 색상은 야생형 유전자보다 가볍다.희석되지 않은 LB 배지는 세포가 펠릿화되면 발현된 보라색 단백질에서 L-류신 공급없이 희귀 코돈이 풍부한 PPG의 느린 발현을 허용한다. 그러나, 이것은 희소한 코돈 이 풍부한 PPG에서 유전자 발현이 L-류신의 공급에 의해 강화된다는 사실을 은폐하지 않습니다. 희귀 코돈 기반 전략은 돌연변이 라이브러리에서 표적 아미노산의 과잉 생산자를 식별 할 수 있으며,이 돌연변이는 부모 균주보다 표적 아미노산의 높은 금액을 생산해야합니다.이 절차를 시도할 때, 희귀 코돈 주파수를 조정하여 야생형 마커와 희귀 코돈이 풍부한 유도체를 수용하는 세포 간의 OD 또는 색상에서 명확한 차별을 달성하는 것이 중요합니다. 전사 분석 및 게놈 시퀀싱은 아미노산 생산과 관련된 메커니즘을 조사하기 위해 선택된 균주에 적용될 수 있다. 이 기술을 사용하여 아미노산 과잉 생산자는 효율적으로 식별 될 수 있으며 유전 정보의 분석은 아미노산 과잉 생산 뒤에 자신의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다.아미노산 유도는 유해할 수 있습니다. 장갑과 보호복을 착용하고 연기 후드로 이러한 단계를 수행해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 - 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 - TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

다운스트림 분석을 포함하여 비표준 아미노산 유사체를 단백질에 잔류물 특이적으로 통합하기 위한 사용하기 쉬운 무세포 발현 프로토콜이 의료, 제약, 구조 및 기능 연구를 위해 제시됩니다.

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립<em&gt; 대장균</em&gt; 휴대없는 전사 번역 시스템

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

합성 생물학 비정규 아미노산의 co-translational 삽입을 사용 하 여 전례 없는 속성으로 단백질의 엔지니어링을 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 소설 형광 분 광 속성, "금" 형광 성 단백질 (GdFP), 불리는 GFP 형 fluorophore의 spectrally 레드 이동 변종 생산 대장균 에서 선택적 압력 관 (SPI)를 통해 제시.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

아미노산 수준 신호-잡음 분석 주어진 인구의 유전 변이 배경으로 정규화는 주어진된 아미노산 위치에 유전 변이의 보급을 결정 합니다. 이 인구 (잡음)에 희소 한 이체의 주파수 이상으로 상승 하는 단백질 시퀀스 (신호) 내에서 변형 "핫스폿"의 확인에 대 한 수 있습니다.

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인

리보솜을 번역하면 코돈 당 세 개의 뉴클레오티드를 펩티드로 해독합니다. 리보솜 프로파일링에 의해 포착된 mRNA를 따른 그들의 움직임은 특징적인 삼중항 주기성을 나타내는 발자국을 생성한다. 이 프로토콜은 RiboCode를 사용하여 리보솜 프로파일링 데이터에서 이 두드러진 기능을 해독하여 전체 전사체 수준에서 활발하게 번역된 열린 판독 프레임을 식별하는 방법을 설명합니다.

데 노보 리보솜 프로파일링 데이터를 사용하여 능동적으로 번역된 오픈 리딩 프레임 식별

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

여기에 설명 된 프로토콜은 사용자 친화적 인 UCSC 게놈 브라우저에서 PhyloCSF를 사용하여 마이크로 단백질 코딩 잠재력에 대한 게놈 영역을 분석하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 또한, 그들의 추정 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 확인 된 마이크로 단백질의 서열 특성을 더 조사하기 위해 몇 가지 도구와 자원이 권장됩니다.

마이크로단백질 동정 및 서열 분석을 위한 통합 접근법

이 프로토콜은 관심 항원에 결합하는 단백질 변이체를 풍부하게 하기 위해 효모 표면 디스플레이 선택 캠페인을 수행하기 위한 필수 단계를 설명합니다.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

학습하세요 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자를 식별하는 방법을 배우세요. 이 기술은 정확성과 민감도, 고처리량을 동시에 제공하여 전통적인 독성 유사체 기반 방법보다 우수합니다.

희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자 식별

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