Name: 포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 학습하세요 포유류 세포에서 미세 코칼 뉴클레아제를 이용한 개선된 염색질 면역침전 분석법으로 단백질-DNA 상호작용을 정확히 식별하고 유전자 전사 조절 메커니즘을 연구하는 방법입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 희망의 도시에 제넨테크 로열티에 의해 지원됩니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 전체 또는 부분적으로 지원 되지 않습니다.

<ol><li>Nikolov, D. B., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+transcription+initiation%3A+a+structural+view%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II transcription initiation: a structural view.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+whole-cell+fixation+to+visualize+replicating+and+maturing+simian+virus+40%3A+identification+of+new+viral+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).</li>
<li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+isolation+of+replicative+chromatin%3A+selective+deposition+of+histone+on+both+new+and+old+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA.</a> Cell. 23 (1), 121-134 (1981).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).</li>
<li>Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Genomic DNA.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).</li>
<li>Crouse, J., Amorese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+Precipitation%3A+Ammonium+Acetate+as+an+Alternative+to+Sodium+Acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate.</a> Focus. 9 (2), 3-5 (1987).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+Precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol Precipitation of DNA.</a> Focus. 7 (4), 1-2 (1985).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+landmark+and+transcription+initiation+at+most+promoters+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells.</a> Cell. 130 (1), 77-88 (2007).</li>
<li>Louie, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen-induced+recruitment+of+RNA+polymerase+II+to+a+nuclear+receptor-p160+coactivator+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+loop+mediated+by+protein+phosphatase+1alpha+mobilization+of+P-TEFb+and+basal+CDK1+drives+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+valid+reference+genes+for+mRNA+and+microRNA+normalisation+in+prostate+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines.</a> Scientific reports. 8 (1), 1949(2018).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nature. 1 (1), 179-185 (2006).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).</li>
<li>Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin.</a> Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28microChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).</li>
<li>Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT-rich+interactive+domain+5B+regulates+androgen+receptor+transcription+in+human+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells.</a> Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

초음파 처리는 일반적으로 조각난 염색체를 얻기 위하여 사용되지만, 재현 가능한 조건을 확인하기 위하여 시간이 많이 걸리고 성가신 입니다. 이 프로토콜에서는 효소 소화가 재현 가능한 조건을 식별하는 것이 더 쉬워야 하기 때문에 MNase 소화를 사용했습니다. MNase 소화 후 간단한 초음파 처리 단계 (단계 참조 2.2) 세포 막을 휴식 하 고 소화 된 염색질을 해제 하는 데 필요한. 따라서 프로토콜의 초음파 처리 전력은 가능한 한 낮아야합니다. 우리는 우리가 채택한 모든 세포에 대해 동일한 초음파 처리 조건을 사용합니다(그림 1 및 표 1참조)는 멤브레인의 완전한 분해를 얻습니다.
MNase에 의한 염색질 의 소화는 우리의 프로토콜에서 중요한 단계이며, 따라서 우리는 세포 내부의 염색질 의 소화조건을 최적화하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 소화 활성은 효소 및 기질(크로마틴) 및 배양 시간의...

포유류 세포에서 유전자 발현은 단단하고 동적으로 조절되며, 전사는 주요 단계 중 하나입니다. 유전자 전사는 주로 전사 인자와 히스톤에 의해 조절됩니다. 전사 인자는 특정 DNA 서열에 결합하고 유전자 전사를 제어하는 단백질입니다. 이러한 인자는 유전체 DNA로부터 mRNA 합성을 템플릿으로 개시하는 RNA 폴리머라제 II(PolII)의 모집을 촉진하거나 억제한다1. 히스톤 변형은 히스톤 꼬리 잔기의 아세틸화 및 메틸화와 같은 염색질 구조를 변화시킴으로써 유전자 전사에긍정적이고 부정적인 영향을 미친다 2. 유전자 발현에 있는 변경이 세포 문맥에 영향을 미치기 때문에, 전사가 통제되는 분자 기계장치를 검토하는 것이 필수적입니다.
현재까지 유전자 전사의 조절을 조사하기 위한 여러 가지 방법이 있습니다. 겔 시프트 분석이라고도 하는 전기영동 이동성 시프트 분석(EMSA)은 단백질-DNA상호작용 3을 분석하는데 사용된다. 관심 있는 세포로부터의 핵 추출물은 방사성 동위원소(예를 들어, 32P)로 배양되고 폴리아크릴아미드 겔상에 DNA 프로브및 전기환동된다. 그것의 autoradiogram는 DNA 단백질 복합체가 젤에 있는 탐사기 보다는 더 느리게 이동한다는 것을 보여줍니다. 단백질에 대하여 항체의 존재에서, DNA 단백질 항체 복합체는 DNA 단백질 복합체 보다는 더 느리게 젤에서 이동합니다. 이 수퍼 시프트 밴드는 DNA와 단백질 사이의 특정 결합을 밝혀. 그러나, EMSA는 무세포 시스템에서 특정 DNA-단백질 상호작용을 결정하고, 따라서 상호작용이 살아있는 세포에서 전사를 제어하는지 여부는 알려지지 않았다. 일반적으로 루시퍼라제 리포터 분석이라고 불리는 일시적인 기자 분석은 세포에서 유전자 발현 조절을 해결하기 위해 개발되었습니다. 전형적으로, 관심 있는 유전자의 상류 게놈 영역은 리포터 플라스미드내로 삽입되고, 세포내로 과도하게 형질전환되고, 리포터 활성이 측정된다. 다양한 결실 돌연변이체는 유전자 조절을 담당하는 영역의 식별을 허용한다. 리포터 분석법은 전사 인자를 식별하고 전사를 제어하는 결합 DNA 서열을 식별하는 데 유용한 도구이지만,이 방법은 리포터 플라스미드가 염색질 구조가 없고 "실제"를 반영하지 않는다는 점에서 큰 단점이 있습니다. 전사 기계. 또한, 히스톤 수정의 변화는 시스템에 의해 결정될 수 없다.
염색질 면역침전(ChIP) 방법의 개발은 포름알데히드가 보존된 염색질 구조4,5를가진 "전체 세포" 고정이 잭슨과 Chalkley의 보고에 근거하였다. 그 이후로, 많은 관련 기술이 개발및 개선되었다6. ChIP 분석에서, 세포는 DNA와 단백질을 가교하기 위하여 포름알데히드로 고정됩니다. 염색질은 단편화되고 관심있는 항체로 면역 침전됩니다. 면역 복합체는 세척되고 DNA는 정제됩니다. 게놈의 특정 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭은 게놈에 관심 있는 단백질의 점유를 제시합니다.
ChIP는 DNA를 가진 전사 인자 및 수정한 히스톤과 같은 단백질의 상호 작용을 확인하는 강력한 도구이지만, 이 방법은 실제로 염색질 단편화 단계와 같은 몇 가지 어려움을 수반합니다. 초음파 처리는 크로마틴을 깎는 데 널리 사용되었습니다. 그러나 재현 가능한 조건을 식별하는 것은 번거롭습니다. 마이크로코칼 뉴클레아제(MNase) 치료는 염색질 전단을 위한 대체 방법이다. MNase는 이중 가닥, 단일 가닥, 원형 및 선형 DNA 및 RNA를 소화하는 내분과 핵산입니다. 최적의 크로마틴 단편화를 위해 염색질과 효소의 양, 온도 및 배양 시간을 포함하여 조건을 결정하는 것이 비교적 쉽습니다. 기존 프로토콜을 수정하고 단순화했으며 간단하고 재현 가능한 방법을 수립했습니다. 본 논문은 포유류 세포에서 MNase를 사용하여 ChIP 분석에 대한 프로토콜을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2x iQ SYBR Green supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1706862</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>50 bp DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Product International</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>분지 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올</td><td>밀리포어 시그마</td><td>I8896</td><td>IGEPAL CA-630</td></tr><tr><td>ChIP 등급 단백질 G 마그네틱 비드</td><td>세포 신호 기술</td><td>9006S</td><td></td></tr><tr><td>크로마틴 면역침전(ChIP) 희석 버퍼</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-153</td><td>버퍼 구성: 0.01% SDS, 1.1% 트리톤 X-100, 1.2mM EDTA, 16.7mM 트리스-HCl, pH 8.1, 167mM 염화나트륨</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0724</td><td>전기영환 등급</td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Millipore</td><td>Sigma G1767</td><td>19-22 mg/mL</td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>High Salt Immune Complex Wash Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-155</td><td>버퍼 구성 : 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 20 mM 트리스 -HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.</td></tr><tr><td>히스톤 H3K4me3 항체 (pAb)</td><td>Active Motif</td><td>39915</td><td></td></tr><tr><td>LiCl 면역 복합체 세척 버퍼</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-156</td><td>버퍼 조성 : 0.25 M LiCl, 1 % IGEPAL CA630, 1 % deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.</td></tr><tr><td>저염 면역 복합체 세척 버퍼</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-154</td><td>버퍼 구성 : 0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.</td></tr><tr><td>Magna GrIP Rack (8 well)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-400</td><td>1.5 mL 튜브와 호환되는 모든 종류의 자기 분리 스탠드는 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>는 10x 완충액 (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, 25°C에서 pH 7.9; C) 및 100x BSA (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>JT Baker</td><td>3506-01</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit IgG</td><td>Millipore Sigma</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Millipore Sigma</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR system</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96, C1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA pol II CTD phospho Ser5 항체</td><td>Active Motif</td><td>39749</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>100155</td><td>전기폐전도 등급</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>마이크로팁 프로브</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td>이 장착된 초음파 <td>발생기 1.5mL 튜브와 호환되는 모든 종류의 초음파 발생기는 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>초순수 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1, V/V)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15593031</td><td>pH 8.05</td></tr></tbody></table>

포유류 세포에서 미세 coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

유기체에서 세포 표현형을 표현하기 위해 살아있는 세포는 그에 따라 유전자 발현을 실행하고 전사 프로그램은 유전자 발현에서 중심적인 역할을 합니다. 세포 전사 기계 및 그것의 염색질 수정 단백질은 전사를 조절하기 위하여 조정합니다. 분자 수준에서 전사 조절을 분석하기 위해 전기 동이동성 이동, 과도 리포터 및 크로마틴 면역 침전(ChIP) 분석과 같은 여러 실험 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 이 문서에서 수정된 ChIP 분석법(ChIP) 분석법(ChIP)을 자세히 설명하며, 이는 히스톤 수정과 세포내 의 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 직접 보여주는 이점 때문입니다. 성공적인 ChIP 분석의 주요 단계 중 하나는 염색질 전단입니다. 초음파 처리는 일반적으로 크로마틴 을 깎는 데 사용되지만 재현 가능한 조건을 식별하기는 어렵습니다. 초음파 처리에 의한 크로마틴 전단 대신, 우리는 더 재현 가능한 결과를 얻기 위해 소각뉴클레아제(MNase)를 사용하여 효소 소화를 활용했습니다. 이 문서에서는 MNase를 사용 하 여 간단한 ChIP 분석 프로토콜을 제공 합니다.

염색질은 ChIP 분석법의 중요한 단계 중 하나입니다. 우리는 MNase를 사용하여 크로마틴을 소화하여 뉴클레오좀 올리고머의 혼합물을 얻었습니다. MNase 소화 단계에서, MNase 는 핵 막을 통과하고 염색질을 소화 할 수 있습니다. 그러나, 소화된 염색질은 막을 통과할 수 없고 핵에 남아 있습니다. 핵에서 소화 된 염색체를 방출하려면 간단한 초음파 처리가 필요합니다. 그림 1A는 VCaP 세포 현탁액의 초음파 처리 전후의 마이크로사진을 나타낸다. 초음파 처리없이 세포 구조는 그대로 유지되어 염색질이 핵에 존재한다는 것을 나타냅니다. 짧은 초음파 처리는 세포 구조를 깨고 마이크로 사진에서 세포를 검사하면 간단한 초음파 상태를 결정하는 데 도움이됩니다. 우리는 또한 293T 세포에서 간단한 초음파 처리에 대한 다른 예를 나타냈다 (그림1B)인간 B 세포 급성 림프 구성 백혈병 세포주, REH 세포 (도<strong cla...

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

이 프로토콜에서, 우리는 단백질과 DNA 사이 상호 작용을 확인할 수 있습니다, 유전자의 전사 적인 규정을 공개. 이것은 세포에 있는 분자 기계장치를 이해하는 것을 돕습니다. 기존 프로토콜을 수정한 다음 간단하고 명확한 분석 프로토콜을 설정합니다.첫 번째 단계에서 프로토콜을 따르기만 하면 분석이 성공적으로 수행될 수 있습니다. 교차 연결된 크로마틴을 연기 후드에 넣고 1%VCaP 세포 배양 배지의 4밀리리터와 18.5%의 PFA0.229 밀리리터를 6센티미터 접시에 넣습니다. 접시를 부드럽게 소용돌이어 PFA를 고르게 분배합니다.실온에서 정확히 10분 동안 배양하세요. 그런 다음 접시에 1.25-어어 글리신 용액의 0.47 밀리리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하여 추가 교차 연결을 중지합니다. 원고에 따라 세포를 세척한 후 세포를 긁어 내고 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮김합니다.세포 현탁액을 가진 튜브를 실온에서 5분 동안 3, 000배 g에서 원심분리하여 세포 펠릿을 회수합니다. 파이펫을 사용하여 PBS를 완전히 제거합니다. 튜브 당 세포 수를 기록하고 셀 펠릿을 영하 80도에서 저장합니다.세포 리시스를 수행하기 위해 먼저 저장된 VCaP 세포 펠릿을 얼음 위에 해동하십시오. 각 튜브에 PIC로 보충된 준비된 ChIP 셀 리시스 버퍼 300마이크로리터를 추가하고 펠릿을 철저히 재보냅니다. 튜브를 15초 동안 소용돌이치게 하고, 10분 동안 얼음에 서스펜션을 배양합니다.섭씨 4도에서 3분간 9, 000배 g의 원심분리기. 상체를 완전히 제거하고 MNase 소화 버퍼300 마이크로리터를 추가하여 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 1.5 밀리리터 튜브에 MNase 소화 버퍼로 MNase를 희석하여 마이크로리터 당 50 젤 단위를 산출합니다.희석된 MNase를 서스펜션에 넣고 정확히 10분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 2 1/2 분마다 반전으로 믹싱을 설정합니다. MNase 소화를 종료하려면 pH 8에 0.5-어금다EDTA의 30 마이크로리터를 추가하고 잠시 소용돌이를 추가하십시오.얼음에 5 분 동안 잠복 후, 원심 분리기는 섭씨 4도에서 5 분 동안 9, 000 배 g에서. 상체를 완전히 제거하고 PIC로 보충된 제조된 ChIP 희석 버퍼의 300 마이크로리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 그런 다음 마이크로팁 프로브가 장착된 초음파 처리기에서 초음파 처리 조건을 2, 처리 시간 15초, 펄스 5초, 펄스 OFF 30초로 설정합니다.얼음에 서스펜션을 초음파 처리합니다. 서스펜션의 마이크로리터 1개를 끌어내고 슬라이드 글래스에 반점합니다. 현미경의 밑에, 세포 구조가 거의 끊어졌는지 확인하기 위하여 관찰하십시오.원심 분리튜브는 9, 000배 g에서 섭씨 4도에서 10분 동안, 새로운 1.5밀리리터 미세센트심분리기 튜브로 상전자관을 옮긴다. 소화된 크로마틴 20마이크로리터를 1.5밀리리터 스크류 튜브에 저장하여 추가 치료를 위해 나머지는 영하 80도에 보관하십시오. 첫째, 각 1.5 밀리리터 나사 튜브에서 75마이크로리터의 물, 5마리의 염화나트륨 4마이크로리터, 단백질과 DNA 사이의 교차 연결을 제거할 K.To 단백질아제 1마이크로리터를 추가하고, 각 MNase 소화 조건에서 20마이크로리터의 소화된 크로마틴을 스크류 튜브에 추가합니다.캡을 단단히 닫고 완전히 섞은 다음 밤새 섭씨 65도에서 튜브를 배양합니다. 아침에는 튜브를 2~3, 000배, 몇 초 동안 원심분리한 후 100마이크로리터의 PCI를 추가합니다. 소용돌이는 적극적으로 에멀젼을 형성합니다.실온에서 30초 동안 최대 속도로 튜브를 다시 원심분리합니다. 그런 다음 조건당 1.5 밀리리터 미세 센심 분리구 두 개를 준비합니다. 하나의 튜브에 100 마이크로리터의 PCI를 추가합니다.pH 5.2에 3개의 어진 나트륨 아세테이트 10개, 글리코겐 2개를 다른 튜브에 넣습니다. 원심분리기에서 꺼낸 튜브에서 DNA를 함유한 상면을 조심스럽게 끌어들이고 PCI를 함유하는 튜브에 추가합니다. 소용돌이를 적극적으로, 실온에서 30 초 동안 최대 속도로 튜브를 원심 분리합니다.다음으로, 이전에 제조된 아세테이트 나트륨과 글리코겐을 함유한 튜브로 상위를 이송한다. 에탄올 250 마이크로리터를 넣고 반전으로 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양하세요.4섭씨에서 30분 동안 최대 속도로 튜브를 원심분리합니다. 튜브 바닥의 펠릿을 확인합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 상체를 조심스럽게 제거하고 70 %의 마이크로 리터 500 을 추가하십시오.4섭씨에서 최대 속도로 튜브를 원심분리합니다. 상체를 완전히 제거하고 실온에서 약 5 분 동안 펠릿을 건조시십시오. 그런 다음 20 개의 마이크로 리터를 추가하여 펠릿을 녹입니다.UV 분광계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 소화 된 크로마틴을 준비 한 후 얼음에 있는 모든 샘플을 해동하십시오. 500 마이크로리터 당 5 마이크로 그램의 농도로 소화 된 크로마틴을 희석하기 위해 PIC로 보충 된 준비 된 ChIP 희석 버퍼1200 마이크로 리터를 추가하십시오.희석된 소화 된 크로마틴의 마이크로 리터 5 를 입력 샘플로 1.5 밀리리터 나사 튜브에 추가합니다. 샘플을 영하 80도에 보관하십시오. 희석된 소화된 크로마틴 을 각각 500마이크로리터를 면역 침전 시료로 1.5밀리리터 나사 관에 추가합니다.각 튜브에 2 마이크로그램의 항체를 추가하고 뚜껑을 닫습니다. 하룻밤 사이에 4도에서 튜브를 배양하고 흔들 기 장에서 부드럽게 섞습니다. 아침에는 각 튜브에 ChIP 급 단백질 G 자기 구슬 30 마이크로리터를 추가합니다.부드러운 혼합으로 2 시간 동안 섭씨 4도에서 튜브를 다시 배양하십시오. 그 후, 튜브를 2~3, 000배로 짧게 회전시키고, 1분 동안 네오디뮴 자석이 들어있는 폴리에틸렌 랙에 튜브를 놓습니다. 그런 다음, 조심스럽게 포부에 의해 상부를 제거합니다.다음으로, 각 튜브에 저염 면역 복합 세척 버퍼의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 잠시 소용돌이쳐 구슬을 분산시합니다. 흔들리는 플랫폼에서 부드러운 혼합으로 5 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 배양하십시오.원고에 따라 고염 면역 복합체및 염화리 면역 복합체로 세척을 반복합니다. 나머지 상체를 완전히 제거한 후 튜브에 용출 버퍼 150 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 소용돌이하여 구슬을 완전히 분산시합니다.뚜껑을 닫고 튜브를 섭씨 65도에서 30분 동안 배양합니다. 구슬을 완전히 분산하려면 5분마다 반전으로 섞습니다. 인큐베이션 동안 1.5 밀리리터 나사 튜브를 준비하고, 5개의 어금니 나트륨염화와 2개의 미백제 K.Thaw의 마이크로리터 6개를 얼음에 미리 준비한 1%의 입력 샘플을 추가합니다.용출 완충제 150마이크로리터, 염화나트륨 5개소미리터 6개, 단백질제 K 마이크로리터 2개를 입력 시료에 추가합니다. 구슬이 들어 있는 튜브의 잠복 후, 아래로 회전. 튜브를 자기 랙에 1분 동안 놓고, 초음파 처리 전후의 교차 연결된 세포 펠릿의 염화 나트륨 과 단백질을 포함하는 나사 튜브로 상체를 전송한다.초음파 처리없이, 세포 구조는 크롬틴이 핵에 존재한다는 것을 나타내는 그대로 유지됩니다. 간단한 초음파 처리는 세포 구조를 깨뜨립니다. 크로스 링크 크로 마틴VCaP 세포에서 제조 하 고 MNase의 다양 한 금액으로 소화.MNase를 추가하지 않고, 매우 높은 분자량을 가진 얼룩 패턴이 나타났습니다. MNase의 추가는 MNase가 중핵을 소화한다는 것을 보여주는 사다리 패턴을 주었습니다. 최대 900bp까지 크롬타닌 단편을 생성한 조건만 적절한 소화로 간주될 수 있지만 부적절한 소화 패턴은 주로 단핵증 생성을 초래한 과다소화를 보여줍니다.VCaP 세포에서 크로마틴의 소화 패턴은 크로마틴의 적절한 소화를 나타냅니다. H3K4methyl3의 가장 높은 점유율은 AR-TSS의 약 0.5 킬로베이스와 1킬로베이스 상류로 관찰되었다. 그러나 AR-TSS의 19킬로베이스와 8kb 상류 및 12킬로베이스 하류에 위치한 지역은 H3K4methyl3의 점유율이 거의 없었기 때문에 부정적인 영역으로 사용할 수 있음을 나타냅니다.MNase 소화 상태를 결정하는 것이 가장 중요합니다. 모든 실험에서 세포 수, 완충부 및 효소 양을 유지합니다. 조건은 각 세포 모형에 대해 확인되어야 합니다.우리는 변성 게놈 병변 사이의 상호 작용을 결정하기 위해 요인과 크로마틴 형성 캡처의 글로벌 점유를 위한 ChIP 순서를 수행할 수 있습니다. 이 방법은 전사의 공정 메커니즘을 공개할 수 있다. ChIP 분석은 전사 적 규제를 조사하기위한 강력한 도구이지만 번거롭고 재현 할 수 없습니다.우리의 방법은 연구원이 일상적으로 쉽게 분석법을 수행하도록 장려합니다.

chromatin-immunoprecipitation-assay-using-micrococcal-nucleases

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Nucleosome 엘리사 (NU - 엘리사)는 기본, 손상 nucleosomes의 준비에서 사후 translational 수정의 글로벌 패턴을 감지하는 민감한과 양적 방법입니다. 이러한 수정 methylations, acetylations 및 특정 히스톤 아미노산 잔류물에 phosphorylations를 포함하고, 따라서 NU - 엘리사는 특정 세포 유형의 전반적인 염색질 수정 상태의 글로벌 proteomic 분석을 제공합니다.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

출처: Mendez, F. M. et al., 쥐 뇌 종양 신경구를 사용한 네이티브 염색질 면역침전.J. vis. 특급 (2018). 이 비디오는 천연 염색질 면역침전을 사용하여 마우스 뇌종양에서 유래한 신경구 세포에서 단백질-DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 염색질 준비, 면역침전, 세척 및 단백질 분해를 위한 단계를 자세히 설명하여 다운스트림 분석을 위해 DNA를 방출합니다.

신경구 세포의 네이티브 염색질 면역침전(Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells)

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

표적 DNA 손상은 DNA 손상제를 삼중 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)에 묶음으로써 달성할 수 있습니다. 변형된 TFO를 사용하여, DNA 손상 특이적 단백질 결합, 및 DNA 토폴로지 변형은 본원에 기술된 변형된 염색질 면역침전 분석 및 DNA 슈퍼코일링 분석의 활용에 의해 인간 세포에서 연구될 수 있다.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

후 성적인 기계 장치는 자주 glioma에서 변경 됩니다. Chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 chromatin 구조와 유전자 전사 조절에 따른 결과 glioma의 유전 변경의 결과 연구에 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜 murine 뇌 종양 neurospheres에 네이티브 chromatin immunoprecipitation을 설명합니다.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

CUT&amp;RUN 및 그 변이체는 크로마틴에 대한 단백질 점유율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 단일 세포 uliCUT&amp;RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 방법을 설명합니다.

표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

게놈 전체 염색체 형태 캡처 방법인 Micro-C-XL을 사용하여 뉴클레오솜 분해능으로 3차원 게놈 조직을 매핑하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

학습하세요 포유류 세포에서 미세 코칼 뉴클레아제를 이용한 개선된 염색질 면역침전 분석법으로 단백질-DNA 상호작용을 정확히 식별하고 유전자 전사 조절 메커니즘을 연구하는 방법입니다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

더 많은 동영상 탐색