단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

이 프로토콜은 단백질 품질 관리 및 특성화를 위한 새로운 방법인 이온 교환 MALs를 제시하며, 생명 과학 연구 및 의약품 개발결과 결과의 일관성과 무결성에 필수적인 품질 관리를 제공합니다. 이온 교환 MALS는 단백질 순도, 올리고머 상태, 균질성, 정체성, 변형, 구조, 번역 후 수정 및 기타 특성을 결정합니다. 측정은 비파괴적이며 거의 생리적 완충 조건하에서 용액으로 만들어집니다.

이 방법은 단백질 또는 펩타이드, 올리고머 상태 및 당과 단백질과 같은 유도 정도를 정확하게 결정합니다. 그것은 또한 막 단백질에 적용 될 수 있습니다. IEX는 표면 전하에 의해 거대 분자를 분리합니다.

음이온 교환, AIEX 및 양이온 교환, CIEX, 매트릭스는 각각 음전하고 양화하의 변이체를 결합합니다. IEX-MALS는 상대적으로 가까운 질량 또는 모양을 공유하는 단백질 집단 간의 미세한 분리로 혼합물 샘플에서 각 개별 단백질 상태의 어금니 질량을 성공적으로 결정합니다. 시작하려면 0.1 마이크로미터 필터를 사용하여 세척 및 용출 버퍼를 포함한 모든 시약을 필터링합니다.

건조 필터에서 미립자를 제거하기 위해 처음 50~100밀리리터의 완충기를 폐병에 넣습니다. 여과된 물로 철저히 세척하고 먼지가 유입되는 것을 방지하기 위해 덮인 깨끗하고 멸균 병에 담겨 버퍼의 나머지 부분을 필터링합니다. pH-8 Tris 버퍼와 50 밀리머 나트륨 염화 나트륨을 사용하면 BSA 샘플을 밀리리터당 6밀리그램으로 희석하여 pH및 이온 강도가 이온 교환 열에 결합할 수 있도록 합니다.

주사기를 사용하여 고품질 MALS 분석을 달성하기 위해 BSA의 0.3 ~ 0.5 밀리그램이상을 1 밀리리터 컬럼에 주입하십시오. 이온 교환 MALS 실험을 시작, 새로운 열고, MALS 소프트웨어에서 방법에서 실험하고, 라이트 산란 시스템 방법 폴더에서 온라인 방법을 선택합니다. DLS 모듈을 사용할 수 있고 DLS 데이터를 획득하려면 QELS 하위 폴더를 사용하여 라이트 산란에서 온라인 방법을 선택합니다.

매개 변수를 설정하려면 구성 섹션에서 실행의 유량을 먼저 일반 펌프 섹션에서 실행의 유량을 분당 1.5 밀리리터로 FPLC에 사용되는 유량으로 설정합니다. 용매 섹션에서 버퍼 매개 변수를 입력하거나 확인합니다. 인젝터 섹션에서는 단백질 이름을 BSA로 입력하고, 굴절률증은 그램당 0.185 밀리리터로 증가하며, 280 나노미터의 파장에서 UV 소멸 계수는 그램당 0.66리터로 입력합니다.

샘플 탭에서, 밀리리터 당 6 밀리그램으로 단백질 샘플의 농도를 입력한 다음 170 마이크로리터로 주사시 부피를 삽입한다. 프로시저 섹션에서 기본 컬렉션 탭에서 자동 삽입시 확인란 트리거를 선택하고 실행 기간을 70 밀리리터로 설정하여 그라데이션이 최종 값에 도달한 후 최소 5분 동안 데이터 수집이 계속되도록 합니다. 그런 다음 FPLC 소프트웨어에서 메서드 편집기 탭에서 새 실험을 만듭니다.

초기 실험의 경우, 소금 또는 pH의 선형 그라데이션을 만들고 최적화된 메서드에 대해 원고에 따라 보다 구체적인 그라데이션 또는 단계별 프로그램을 만듭니다. MALS 소프트웨어에서 데이터 수집을 트리거하는 메서드에 펄스 신호를 포함합니다. 이어서, 펌프 밸브를 열고, 0.5-대구나트륨 수산화나트륨으로 세척하여 강하게 바운드불순물을 제거하고 중화 완충세척을 한다.

그런 다음, 트라이스 버퍼 pH 8, 세척 버퍼가 있는 A 밸브, 용출 버퍼로 B 밸브로 컬럼을 세척합니다. 컬럼을 헹기 위해 최종 세척으로 낮은 염 농도로 세척 버퍼를 사용하여 단백질을 컬럼 매트릭스에 결합할 수 있도록 한다. 시료 주입 전, 세척 후, 용출의 끝에서, 낮은 소음과 완전히 순수한 희석을 보장하기 위해 광 산란 기준선을 안정화해야합니다.

주사기를 사용하여 단백질 샘플을 루프에 놓습니다. 실행 버튼을 클릭한 다음 FPLC 소프트웨어에서 먼저 실험을 시작합니다. 데이터는 MALS 검출기를 통해 FPLC 기기로부터 펄스 신호를 받은 후 수집됩니다.

이온 교환 MALS가 독립 실행형 메서드 대신 연속 흐름 모드로 수동으로 수행되는 경우 이전에 설명한 것과 실행 및 명령의 동일한 매개 변수를 적용합니다. 최종 메서드가 확인되고 실행되면 샘플 대신 버퍼를 로드하여 빈 주입을 사용하여 정확히 동일한 메서드를 수행합니다. 자동 주입 펄스와 빈 실행의 그라데이션 사이의 타이밍이 샘플 실행의 타이밍과 동일합니다.

분석을 시작하려면 MALS 소프트웨어의 프로시저 섹션에서 탈피 탭과 일반 레벨을 사용하여 크로마토그램을 부드럽게 합니다. 소음이 많다면 레벨을 헤비로 설정합니다. 기준선 보기에서 LS, UV 및 RI 검출기를 포함한 모든 신호에 대한 기준선을 정의합니다.

Peaks 뷰에서 해석의 피크를 정의합니다. 각 피크 아래 단백질에 대한 RI 증분 값 dn/dc 및 UV 소멸 계수의 정확한 값을 확인합니다. 광 산란 뷰의 몰 질량 및 반경 아래에서 짐 모델을 사용하여 어금음 질량과 반경을 분석하고 0도에 맞습니다.

QELS를 사용할 수 있는 경우 QUELS 뷰의 Rh 에서 Rh 값과 상관 관계 함수의 적합성 품질을 관찰합니다. RI 신호는 염 농도의 증가로 인해 이온 교환 MALS 실행 중에 크게 변화한다. 빈 주입에서 기준선 신호를 빼려면 단백질과 빈 이온 교환 MALS 실험을 모두 엽니다.

단백질 실험 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 방법 적용을 선택하고 파일 대화 상자에서 기준 선위 뺄셈 폴더를 선택합니다. 표준 어금니 질량 분석을 위한 온라인 방법을 선택합니다. 기준선 빼기 보기 에서 빈 실행 신호를 가져오려면 빈 가져오기를 클릭합니다.

악기 아래에서 모든 검출기를 사용하여 빼야 합니다. 이온 교환 MALS 시스템을 절차 및 구성 보기에서 BSA 단조로 보정하려면 피크를 정렬합니다. 정규화 뷰에서 정규화를 수행하려면 Rg 값으로 3.0 나노미터를 입력합니다.

그런 다음 동일한 구성 탭에서 밴드 확대에서 피크를 선택하고 성능 적합성 버튼을 사용하여 UV 및 LS 신호를 RI 신호에 일치시합니다. 결과의 그래프는 결과 피팅 보기에 표시됩니다. 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 편집을 선택한 다음 고급 단추를 클릭하여 축 축 및 기타 그래프 매개 변수를 변경합니다.

더 많은 디스플레이 옵션을 얻으려면 EASI 그래프 탭을 선택하고 디스플레이 드롭다운 메뉴의 창 상단에서 어금니 질량, 반지름, 순도 수준 등 Molar Mass 또는 Rh Q.All 결과를 선택합니다. 보고서 디자이너 버튼을 사용하여 보고서에 결과 나 매개 변수와 수치를 더 추가합니다. 본 실험에서, BSA는 음이온 교환 분석 컬럼을 사용하여 이온 교환 MALS에서 분석하였다.

크로마토그램은 280나노미터의 UV를 표시하고, 빛이 90도 각도로 산란하고, 굴절률, 그리고 각 피크의 어금니 질량과 함께 전도도 곡선을 나타냈다. 75밀리머에서 350밀리머 나트륨 염화나트륨까지 30개의 컬럼 볼륨으로 구성된 넓은 선형 그라데이션은 BSA 모노머를 조광기및 고밀도머로부터 분리했습니다. 다운스트림 MALS 분석은 66.8킬로달톤의 계산된 단량어 질량과 130킬로달톤의 계산된 이머 어어 질량을 초래했습니다.

용출된 봉우리에서완충전도도에 기초하여, 그라데이션은 다른 프로그램으로 변경되었고, 175밀리머 나트륨 염화나트륨의 긴 단계, 175밀리머에서 500밀리알라 나트륨염화나트륨으로 선형 그라데이션이 뒤따랐다. 새로운 그라데이션은 해상도를 크게 향상시키고 BSA 단백기와 높은 올리고머 종 사이의 우수한 분리를 생산했습니다. 200 밀리머와 250 밀리머 나트륨 염화물의 단계별 프로그램은 또한 높은 올리고황 종에 초점을 적용했다.

그것은 BSA 단조량, 이량조 및 트리머 사이의 우수한 분리 결과. 이 절차에 따라 질량 분석법, SDS-PAGE 활동 및 안정성 테스트와 같은 방법은 이온 교환에 의해 분리된 각 변형에 대해 수행하여 각 변형을 식별하고 추가로 특성화할 수 있습니다. 우리는 이온 교환 MALS가 SEC-MALS에 의해 완전히 분석될 수 없는 샘플에 MALS 분석의 힘을 확장한다는 것을 것을을 발견했습니다.

요금별 분리는 SEC에서 동종으로 구분되는 별개의 종을 해결합니다.