Name: 신경 질환의 리피도혈 및 전사학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 신경 질환 마우스 모델에서 조직 리피도믹스와 전사학을 동시 분석하는 모듈형 프로토콜을. 뇌 영역별 샘플링과 추출법으로 염증 및 신경 신호 전달 관련 지질 메커니즘을 정밀하게 규명할 수 있습니다.

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우리는 이 기사를 에르멜린다 로마초 박사에게 헌납합니다. 이 원고를 마무리하는 동안 에르멜린다 로마조 박사는 세상을 떠났습니다. 그녀는 의미있는 연구 목적을 달성하기 위해 연구 작업에 과학과 사심없는 참여에 대한 열정의 구현이다. 그녀는 항상 인간의 더 큰 복지에 의미 있는 기여를 꿈꿔주었다. 그녀의 선한 성격은 과학과 삶의 격렬한 길로 인해 결코 타협되지 않았습니다. 그녀는 우리의 마음에 귀중하고 영원히 남아있을 것입니다.
줄리아 M. 포스트는 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠의 대학 의료 센터에서 번역 신경 과학 (FTN)에 대한 초점 프로그램에 의해 투자되었으며, 현재 LB에 SPP-2225 EXIT 프로젝트에 의해 투자된다. 이러한 연구에 대 한 부분 자금 은 리피도믹스 코어 시설에 의해 제공 되었다, 생리 화학 연구소, 그리고 교내 기금 (LB에) 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠의 대학 의료 센터에서.

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<li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li>
<li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li>
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<li>Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+determination+of+23+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).</li>
<li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).</li>
<li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li>
<li>Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li>
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<li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death%3A+Implications+for+gene+targeting+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 신경 지질도혈 및 전사 방법론은 뇌 및 말초 장기의 높고 낮은 공간 해상도에서 질병이나 건강한 발달을 조사하는 실행 가능한 의미입니다. 최적화된 플라즈마 샘플링 및 취급 절차로 인해 혈장 리피도믹 분석은 조직 리피도믹스 및 전사학을 위해 희생된 동일한 동물로부터 수행될 수 있으므로 조직 혈액 분자 상관관계 및 바이오마커 발견의 신뢰성을 향상시킬 수 있습니다. 3개의 프로토콜 또는 그 조합 중 하나를 적용하여 광범위한 데이터 세트를 제공하면 컨텍스트(동물 모델 실험) 내의 신경 질환뿐만 아니라 실험 모델 컨텍스트 를 가로질러 사이를 조사하는 것이 가치가 있습니다. 더욱이, 샘플링, 처리 및 분자 분석의 높은 수준의 표준화는 분자 데이터의 높은 재현성을 용이하게 하므로 연구 와 실험실 내의 분자 변화를 안정적으로 참조합니다.
그러나 이를 달성하기 위해 정의된 연구 목표에 대한 최대 판독 가능성을 제공하는 실험 설계의 설정이 중요합니다. 실험군 간의 분자 변화에 대한 신...

지질의 기능과 신경 질환의 발병 및 진행에 대한 역할의 최근 발전은 새로운 치료 목표 및 질병 메커니즘 의 새로운 연구 및 개발 장소를 열어1. 질량 분석 영상 및 고급 질량 분광 프로파일링과 같은 현대 분자 이미징 기술에 의해 강조되는 다른 뇌 영역에서 지질 조성에 대한 문서화 된 차이는 전체 뇌에서 지질 조사의 패러다임을 기능적으로 뚜렷하고 이산적인 뇌 영역으로 전환합니다. 지질 성분이 다른 뇌 영역에서 다르다는 사실은 기능적으로 뚜렷한 뇌 영역을 가로지르는 뇌 모욕이나 자극에 대응하여 멤브레인 지질 감수성과 하류 지질 신호의 새로운 개념화를 자극합니다. 따라서 지질 프로토콜은 더 높은 공간 분해능 검출 및 정량화, 그리고 동시에 세포막 및 신호 경로의 여러 지질 성분의 분석을 위해 낮은 조직 량의 과제를 해결하기 위해 새로운 개발이 필요합니다. 또한, 효소의 결정, 지질 리간드, 그들의 수준 및 기능의 조절에 관련 된 수용 체는 신경 질환에 영향을 받는 신호 경로를 해명 하 고 병리학적 맥락에서 새로운 기계분석 조사를 안내 하는 것이 가장 중요 하다.
증가 된 뇌 공간 해상도 뿐만 아니라, 새로운 신경 지질 도성 접근의 개발에 도전 하는 두 가지 주요 어려움이 있다. 첫째, 지질 신호 분자는 일반적으로 막 구성 지질에 비해 매우 낮은 풍부의. 둘째, 리피돔은 단일 분석 접근법을 사용하여 해부하기 어려운 높은 구조적 이질성을 나타낸다. 따라서 추출 및 분석 방법은 다른 지질 범주에 맞게 조정되며 일반적으로 뚜렷한 조직 샘플에서 수행됩니다.2. 산탄총 리피도믹 방법3 막 지질의 광범위한 프로파일을 빠르게 드러내는 우수한 도구이며, 표적 발견 및 정량화 질량 분광 방법에 의해 제공되는 감도와 선택성이 증가하면서: i) 염증지질 및 ii) 지질을 포함하는 낮은 풍부한 신호 지질의 조사를 위해 자본화되어 있습니다. 등.4,5. 신경 질환 모델의 뇌 영역에서 발생하는 세포막 및 신호 수준 모두에서 지질 변화를 포괄하기 위해, 전형적으로 지질 추출 및 분석은 뚜렷한 조직 샘플에서 수행되며, 뚜렷한 동물 배치 또는 다른 반구로부터 얻어지거나, 더 큰 조직 영역을 여러 조각으로 해부함으로써 수행된다. 효소 수용체의 mRNA 수준이 또한 관심있는 때, 그들의 조사는 일반적으로 명백한 조직 견본의 조달을 요구합니다. 예를 들어, 막 지질, 내인성 카나비노이드 및 mRNA의 조사는 3개의 다른 조직 샘플(예를 들어, 2개의 지질 추출 방법-막 지질 및 신호 지질에 대한 2개의 샘플-및 mRNA 분석을 위한 1개의 샘플)을 요구할 것이다. 염증성 지질 및 내인성 카나비노이드에 대한 조사는 각각 두 가지 조직 샘플, 추출 방법 및 분석 방법을 필요로합니다. 또 다른 예는 mRNA와 뇌 펀치 또는 레이저 미세 절 샘플에서 임의의 지질 범주의 조사로, 결과적으로 뇌 (하위) 지역 당 두 개의 샘플을 조달하기 위해 두 개의 별개의 동물을 필요로합니다. 결과의 가변성 및/또는 나쁜 재현성의 상당한 정도는 생물학적 가변성 및/또는 조직 이질성에서 기인하는 그러한 경우에 자주 발생합니다. 특히 뇌의 높은 공간 해상도에서 발생하는 다분자 분석의 이러한 실질적인 한계에 의해 유도된 3모듈 신경지질학 프로토콜은 염증지질의 LC/MRM(예를 들어, eicosanoids(eiC)에 의한 코추출 및 공동 분석을 포괄하도록 설계되었으며, eCB와 같은 뉴런 활동의 변조에 관여하는 지질2; 2) 후속 멀티스캔 LC/MRM 및 전구체/중립 손실 스캔 분석을 통해 인지질(PL) 및 ECB의 공동 추출2; 및 3) 후속 LC/MRM 및 qPCR 또는 RNA 염기서열 분석과 함께 막(인)과 eCB뿐만 아니라 mRNA의 이중 추출6. 신경질환과 관심있는 뇌 영역에서 다루어야 할 생물학적 질문에 따라, 제1 및 제2 프로토콜의 조합, 또는 제 1 및 제 3 프로토콜의 조합은 약 4 mg의 조직을 위한 동일한 조직 표본에 적용될 수 있다. 첫 번째 및 세 번째 프로토콜은 약 2 mg의 조직에 독립적으로 적용할 수 있습니다. 두 번째 프로토콜은 0.5 mg의 무게 조직에 적용할 수 있습니다. 선택된 신경지질성 프로토콜 모듈에 관계없이, 조직 샘플링 및 사전 분석 처리, 뇌 격리 및 영역 해부뿐만 아니라 동물 모델을 희생하는 절차는 프로토콜의 세 모듈 모두에 대해 표준화되고 동일하다. 신경 질환에 대한 우리의 조사에서, 질병의 병리학적 결과에 관련있는 말초 기관은 항상 이러한 모듈형 프로토콜을 사용하여 수집및 분석됩니다. 또한, 혈액은 정기적으로 플라즈마 리피도믹스를 위해 샘플링되어 미래의 번역 응용 분야에 대한 견해를 가진 신경 질환의 판독 도구로 사용됩니다. 여기에 제시 된 모듈식 리피도믹스 프로토콜은 매우 다재다능합니다 : 더 큰 조직 양으로 확장 가능하고 거의 모든 조직 유형및 질병에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 모듈식 프로토콜의 적용을 위해(그림 1)) 신경질환에서는 외상성 뇌손상, 파킨슨병, 알츠하이머병, 간질 등 신경질환의 발병 및 진행의 표준화된 설치류 모델이 가능하다.
이러한 프로토콜은 kainic acid (KA)유도 마우스 모델인 간질의 급성 단계에서 조직 립피돔 및/또는 전사체의 변화를 연구하기 위해 광범위하게 적용되었으며, 인간 측두엽 간질(TLE)과 유사하기 때문에 전임상 연구에서 널리 사용되는 모델이다.8,911.11. 이러한 프로토콜을 이용하여, 팔미토일레탄올라미드(PEA)12,13과 같은 약물의 치료 잠재력은 간질의 동일한 마우스 모델에서 평가되었다. 이 연구는 뇌와 주변의 높고 낮은 공간 해상도에서 지질 및 mRNA 의 변화를 확인, 최대 급성 발작 강도의 시점에서 (60 분 발작 유도), 4 개의 다른 시점에서 완두콩과 과급성 및 급성 치료에 (20, 60, 120, 180 분) 후 KA 발작 후 급성 시간 감이, 시간 감전. 치료되지 않은 KA 주입 마우스의 플라즈마, 뇌 및 말초 기관, 급성 및 하위 완두콩 처리 마우스뿐만 아니라 차량 및 완두콩 차량 제어 마우스는 매 시점 12,13에 수집되었으며, 이러한 분자 분석을 통해 조사하였다. 분자 데이터는 급성 간질 단계및 PEA의 잠재력의 진행을 해명하기 위해 발작 점수에 의해 얻어진 행동 표현형뿐만 아니라 신경 퇴행성 과정에 대한 면역 조직화학 유래 데이터와 상관관계가 있었다.

<table><tbody><tr><td>12(S)-HETE</td><td>Biomol</td><td>Cay10007248-25</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>12(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay334570-25</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>1200 시리즈 LC 시스템</td><td>애질런트</td><td></td><td>기기/LCMS</td></tr><tr><td>2100 바이오분석기</td><td>애질런트</td><td></td><td>기기/qPCR</td></tr><tr><td>5(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay 334230</td><td>지질 Std</td></tr><tr><td>ABI 7300 Real-Time PCR cycler</td>, <td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Instrumentation/qPCR,</td></tr><tr><td>아세토니트릴 LC-MS, 크로마 솔브</td><td>, Honeywell</td><td>9814920</td><td>용매/LCMS</td></tr><tr><td>황색 에펜도르프 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td></td><td>Sample Prep.</td></tr><tr><td>Analyst 1.6.2 소프트웨어</td><td>AB SCIEX, 다름슈타트</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>계장/샘플 준비.</td></tr><tr><td>Arachidonic Acid-d8 MS Standard</td><td>Biomol</td><td>Cay-10007277</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Bessmann Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)</td><td></td><td>기기/시료 준비</td></tr><tr><td>Bino</td><td>Zeiss</td><td></td><td>현미경</td></tr><tr><td>cleaved Caspase 3 항체</td><td>Cellsignaling</td><td>9661S</td><td>현미경</td></tr><tr><td>Cryostat, Leica CM3050 S</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>기기/샘플 준비.</td></tr><tr><td>CTC HTC PAL 자동시료주입기</td><td>CTC Analytics AG</td><td></td><td>Instrumentation/LCMS</td></tr><tr><td>Dumont Curved Forceps Dumoxel #7</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Dumont 펜치 초미세 팁 #5SF (x2)</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>EDTA 1000 A R&ouml; hrchen</td><td>Kabe Labortechnik</td><td>078001</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>EP-1 EconoPump</td><td>BioRAD</td><td>700BR07757</td><td>기기/시료 준비</td></tr><tr><td>미세 집게 미러 마감</td><td>FST</td><td>11412-11</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>미세 홍채 가위 스트레이트 샤프</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>미세 가위 텅스텐 카바이드 스트레이트</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>홍채 주걱</td><td>FST</td><td>10094-13</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Kainic acid</td><td>Abcam</td><td>ab120100</td><td>간질 약물</td></tr><tr><td>지질 보기 소프트웨어</td><td>AB SCIEX, 다름슈타트</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>LPC 17:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>855676P</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>LPC 18:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>855775P</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>루나 2,5&마이크로; m C18(2)- HAST 100A LC 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td>00D-4446-B0</td><td>계측/LCMS</td></tr><tr><td>확대</td>등 <td>Maul GmbH</td><td></td><td>계측/샘플 준비</td></tr><tr><td>메탄올 LC-MS 크로마 용매 99.9%</td><td>Honeywell</td><td>9814920</td><td>용매/LCMS</td></tr><tr><td>Motic Camara</td><td>Motic</td><td></td><td>현미경 MTBE</td></tr><tr><td></td><td>Honeywell</td><td>34875-1L</td><td>용매/LCMS</td></tr><tr><td>MultiQuant 3.0 정량 분석 소프트웨어 패키지</td><td>AB SCIEX, 다름슈타트</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>기기/qPCR</td></tr><tr><td>PA 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>840857P</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>PA 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1404</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>팔미토일 에탄올 아미드</td><td>Biomol</td><td>Cay90350-100</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>팔미토일 에탄올 아미드-d5</td><td>Biomol</td><td>Cay9000573-5</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>Avanis 폴라리스</td><td>850457P</td><td>지질 Std</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850457P</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>PC 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1004</td><td>지질 Std</td></tr><tr><td>PE 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850757P</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>PE 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1104</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>PG 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>840457P</td><td>지질 표준</td></tr><tr><td>PG 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1204</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PI 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1504</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Precelleys 24</td><td>Peqlab</td><td></td><td>기기/시료 준비</td></tr><tr><td>Precellys Keramik-K&uuml; gelchen</td><td>Peqlab</td><td>91-pcs-ck14p</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>Precellys Stahlkugeln 2,8mm</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS-MK28P</td><td>샘플 준비.</td></tr><tr><td>Precellys-keramik-kit 1,4mm</td><td>VWR</td><td>91-PCS-CK14</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>프로스타글란딘 D2</td>, <td>Biomol</td><td>Cay, 12010</td>, <td>지질 Std</td></tr><tr><td>프로스타글란딘 D2-d4</td>, <td>Biomol</td><td>Cay 312010</td>, <td>지질 Std</td></tr><tr><td>프로스타글란딘 E2</td>, <td>Biomol</td><td>Cay10007211-1</td>, <td>지질 Std</td></tr><tr><td>프로스타글란딘 E2-d9</td>, <td>Biomol</td><td>Cay10581-50</td>, <td>지질 Std</td></tr><tr><td>PS 17:0-14:1</td>, <td>Avanis Polaris</td><td>LM-1304</td>, <td>지질 Std</td></tr><tr><td>Q 트랩 5500 삼중 사중극자 선형 이온 트랩 MS</td><td>AB SCIEX</td><td></td> AU111609004 <td>기기/LCMS</td></tr><tr><td>실시간 PCR 시스템</td><td>Appliert Biosystem</td><td></td><td>기기/qPCR</td></tr><tr><td>Resolvin D1</td><td>Biomol</td><td>Cay10012554-11</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Sample Prep.</td></tr><tr><td>경비원 프리 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>Instrumentation / LCMS</td></tr><tr><td>Shandon 커버 플레이트</td><td>Thermo Fisher</td><td>72110017</td><td>현미경</td></tr><tr><td>Shandon 슬라이드 랙 및 뚜껑</td><td>Thermo Fisher</td><td>73310017</td><td>Microscopy</td></tr><tr><td>SM 18 : 0</td><td>Avanis Polaris</td><td>860586P</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>SM d18 : 1 / 12 : 0</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-2312</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>표준 겸자 직선 부드러운</td><td>FST</td><td>11016-17</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>수술 용 가위 ToughCut 표준 패턴</td><td>FST</td><td>14130-17</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>T3000 Thermocycler</td><td>Biometra</td><td></td><td>Instrumentation/qPCR</td></tr><tr><td>Thromboxane B2</td><td>Biomol</td><td>Cay19030-5</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Thromboxane B2-d4</td><td>Biomol</td><td>Cay319030-25</td><td>지질 Std</td></tr><tr><td>Tissue Lyser II</td><td>Qiagen/ Retsch</td><td>12120240804</td><td>기기/시료 전처리</td></tr><tr><td>Tissue Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>현미경</td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Roth</td><td>0300.2</td><td>현미경</td></tr><tr><td>Vapotherm</td><td>Barkey</td><td>4004734</td><td>기기/샘플 준비</td></tr><tr><td>Wasser LC-MS 크로마 솔브</td><td>VWR</td><td>9814920</td><td>솔벤트/LCMS</td></tr></tbody></table>

신경 질환의 리피도혈 및 전사학

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

지질은 신경 질환에 도움이되는 뇌 모욕이나 자극에 대한 기본 인터페이스 역할을하며 질병의 발병 및 진행을 강조 할 수있는 다양한 신호 또는 리간드 기능을 가진 지질 합성을위한 저수지입니다. 종종 전증상 수준에서 변화, 지질은 약물 표적과 바이오 마커의 신흥 소스입니다. 많은 신경 질환은 신경 염증을 전시, 신경 변성, 일반적인 특징으로 신경 흥분성, 부분적으로 특정 지질 신호 시스템에 의해 변조. 다양한 지질의 합성의 상호 의존성 및 상호 관계는 신경학적 맥락의 공통점과 특이성을 도출하고 질병 발병 및 진행의 기계적 측면의 해명속도를 촉진하기 위해 다중 지질, 다효소 및 다수용체 분석을 자극한다. 뚜렷한 뇌 영역에 지질 역할을 아스포딩하는 것은 신경 질환과 관련된 지질 분자 표현형 및 형태학의 결정을 진행합니다.
여기에 제시된 모듈식 프로토콜은 특정 신경 질환 및/또는 조건에 관련있는 이산 뇌 영역에서 추출된 기능의 근간이 되는 효소 및 중재자의 mRNA와 함께 멤브레인 지질 및 하류 지질 신호의 분석에 적합한 모듈식 프로토콜이다. 정확한 비교 지질 프로파일링을 보장하기 위해, 워크플로우 및 운영 기준은 최적화 및 표준화되었다: i) 뇌 샘플링 및 관심 영역의 해부, ii) 다중 지질 신호 및 멤브레인 지질의 공동 추출, iii) 이중 지질/mRNA 추출, iv) 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링(LC/MRM), 및 v) 표준 mRNA 프로파일링에 의한 정량화. 이러한 워크플로우는 기능적으로 이산뇌 하위 영역(즉, 뇌 펀칭에 의한)의 샘플링에 의해 얻어진 낮은 조직량에 대해 가능하므로 조직 이질성 및/또는 동물 적 변이성으로 인한 다분자 분석의 편견을 방지할 수 있습니다. 신경 질환의 말초 결과를 밝히고 신경 질환 상태의 번역 분자 판독을 확립하기 위해 말초 장기 샘플링, 처리 및 후속 지방 피도혈 분석뿐만 아니라 혈장 리피도믹도 추구되고 설명됩니다. 프로토콜은 급성 간질 마우스 모델에서 입증된다.

기술 된 프로토콜의 집합은 동물 모델의 선택, 샘플링 경로, 추출 및 프로파일링 방법과 같은 목표 특정 방식으로 상이한 수준에서 결합 될 수있다 (그림 1).
급성 간질 발작 상태의 시간 과정 동안 뇌와 주변의 지질 수준 변화를 결정하고 완두콩의 잠재적 인 항 간질 효과를 해명하기 위해13 뇌와 주변의 립피돔 변화에 미치는 영향, 세 가지 실험 동물 그룹은 차량으로 치료되었다, KA 급성 간질을 유도하기 위해, 및 PEA는 항질 약물 후보로. 완두콩은 KA-주입 전에 i.p.p.를 통해 투여되었다(예를 들어, 급성 치료를 위한 단일 완두콩 주사와 아만성 치료를 위한 2개의 완두콩 주사). 다중 분자 분석 및/또는 면역히스토케토화학 염색을 치료 후 5일 동안 의목적으로,...

이 기사에서는 지질학 및 전사학, 그리고 지질의 근본적인 염증 및 신경 활동, 막 지질, 다운스트림 메신저 및 mRNA 인코딩 효소/수용체를 대상으로 하는 신경 질환 마우스 모델의 혈장 지질학에 대한 모듈식 프로토콜을 제시합니다. 샘플링, 샘플 처리, 추출 및 정량화 절차가 설명되어 있습니다.

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

이 모듈식 프로토콜을 사용하면 지질 및/또는 RNA, 신중한 조직 영역 및 샘플 시편당 향상된 정량적 및 질적 데이터 출력을 갖춘 혈액에서 구조 및 신호 지질 및/또는 RNA에 의해 렌더링되는 여러 분자 이벤트를 탐색할 수 있습니다. 이 방법은 모든 실험 모델에 적용되며 인간 조직 표본 및 혈액에도 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 클라우디아 슈비터, 기술자, 줄리아 포스트, 졸업생, 그리고 라이사 러너, 내 그룹의 포스트 독이 될 것입니다.시작하려면, 급성 및 예방 처리 카이닉 산 유도 간질을 가진 마우스의 이전에 고립 된, 전체, 냉동 뇌를. 뇌를 극저온의 장착 시스템에 장착합니다. 두께를 50 마이크로미터로 설정하고 관심 영역과 가까운 트림 모드에서 뇌를 슬라이스합니다.관심 영역에 접근할 때 두께를 18 내지 20 마이크로미터로 설정합니다. 관심의 하위 영역을 국소화하기 위해, 토루이딘 블루를 사용하여 뇌 슬라이스 얼룩. 현미경을 사용하여 얼룩진 조각을 검사하여 주먹으로 볼 수 있는 관심 영역을 식별하고 마우스 아틀라스를 참조하여 적절한 뇌 해부학 적 영역을 찾습니다.샘플 코러스를 사용하여 직경 0.8~1.0mm의 펀치를 사용하십시오. 엔도칸 나비 노이드와 에리코사노이드 코추출에 대한 펀치를 튜브 당 7 개의 미리 냉각 된 강철 볼로 미리 냉각 된 2 밀리리터 호박 색 튜브로 옮긴다. 인지질 및 엔도칸 나비노이드 코추출, 듀얼 지질 및 RNA 공동 추출의 경우, 세라믹 구슬이 있는 2밀리리터 RNase 프리 추출 튜브로 펀치를 옮기습니다.차가운 방에서 냉동 펀치의 무게와 즉시 추출 또는 섭씨 80도에서 동결 진행합니다. 뇌 조각, 펀치 또는 조직 분말 샘플에서 엔도 칸 나비 노이드와 eicosanoids의 액체 액체 지질 co추출을 수행하려면, 얼음에 조직 샘플과 일곱 강철 공을 포함하는 추출 튜브를 배치합니다. 600 마이크로리터의 얼음 차가운 MTBE와 내부 표준을 포함하는 아세토닐레 물 50마이크로리터를 추가합니다.0.1 어금니 포름산의 400 마이크로리터를 추가한 후, 조직 용액을 사용하여 30초에서 1분 동안 균질화합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 5, 000배에서 15분 동안 이 동종포를 합니다. 80°C에서 10분 동안 냉동실에 넣어 수성 하면을 동결하여 상부 유기상 의 전적을 용이하게 합니다.상부 유기상을 새로운 1.5 밀리리터 호박색 튜브로 옮기고, 10분 동안 섭씨 37도에서 부드러운 질소 스트림 하에서 증발한 다음, 아세토나이트 수의 50마이크로리터로 재구성하여 추가 분석을 수행합니다. 추가 단백질 함량 분석을 위해 수성 상을 섭씨 20도 또는 80도에 저장하십시오. 플라즈마 샘플에서 엔도칸 나비노이드와 에리코사노이드를 코추출하려면 냉동 플라즈마 샘플을 얼음에 놓고 완전히 해동하십시오.MTBE 800 마이크로리터와 참조 플라즈마 샘플을 사용하여 스파이크에 최적화된 내부 표준을 포함하는 50마이크로리터의 아세토나이트 워터를 추가합니다. 600 마이크로리터의 0.1 어금니 포름산과 소용돌이를 섭씨 4도에서 2분간 첨가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 4, 000배 g에서 원심분리합니다.유기 상을 새로운 튜브로 옮기. 37섭씨에서 질소의 부드러운 스트림에서 증발한 다음 액체 크로마토그래피 다중 반응 모니터링 분석을 위해 50 마이크로리터의 아세토나이트 워터로 재구성합니다. 뇌 영역, 펀치 또는 기타 조직 분말 샘플에서 인지질 및 엔도 칸 나비 노이드의 공동 추출을 수행하려면, 얼음에 조직 샘플과 세라믹 구슬을 포함하는 추출 튜브를 배치합니다.메틸 테르부틸 에테르와 메탄올 혼합물 800 마이크로리터와 내부 표준을 포함하는 메탄올 10 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 25 마이크로몰라 테트라하이드로립스타틴/URB597 및 BHT 밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 0.1%의 마이크로리터를 추가합니다. 조직 균질화로 균질화 한 후 원심분리기는 5, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 15 분 동안.상부 유기상을 새로운 튜브로 옮기고, 37°C에서 부드러운 질소 스트림 에서 증발한 다음, 메탄올 의 마이크로리터 90마이크로리터로 이 지질 추출물을 재구성합니다. 즉시 진행하는 경우, 지질 추출물의 알리쿼트에 10%의 물을 추가하고 인지질 분석을 위해 LC/MS에 10마이크로리터를 주입한다. 추가 엔도칸 나비 노이드 분석을 위해 다음 단계를 진행하십시오.지질 추출물의 알리쿼트(aliquot)를 취하고, 건조함으로 증발하고, 아세토닐리(acetonitrile) 물로 재구성하십시오. 조직 샘플에서 RNA와 지질의 이중 추출 및 인지질 및 엔도 칸 나비 노이드의 공동 추출을 수행하기 위해, 4 섭씨에서 조직 분말 알리쿼트 또는 뇌 무리를 해동. 세라믹 구슬을 사용하여 추출 튜브에 조직을 추가합니다.그런 다음 200 마이크로리터의 클로로폼과 함께 RLT 버퍼 600 마이크로리터를 추가합니다. 인지질 및 엔도칸 나비노이드 코추출의 경우 내부 표준 혼합물 10 마이크로리터가 있는 스파이크 샘플을 스파이크하고 20초 동안 고속으로 균질화합니다. 균질화된 샘플을 새로운 원심분리기 튜브및 원심분리기로 5분간, 섭씨 4도로 옮겨 위상 분리를 가능하게 합니다.표준 키트를 사용하여 RNA 추출을 위한 상층부를 신선한 튜브로 옮는다. Elute는 총 50마이크로리터의 RNase 없는 물로 RNA를 추출하여 섭씨 80도에 보관했습니다. 지질 추출의 경우 MTBE/메탄올 800마이크로리터와 0.1%의 마이크로리터를 하부 클로로폼 함유 상에 첨가합니다.섭씨 4도에서 45분 간 소용돌이를 즐길 수 있습니다. 상부 유기 상을 새로운 튜브로 옮기. 섭씨 37도에서 질소의 부드러운 스트림에서 증발.추가 LC/MS 분석을 위해 메탄올 90 마이크로리터로 샘플을 재구성하고 섭씨 20도 또는 80도에 저장하거나 즉시 분석을 진행합니다. 추가 엔도칸 나비 노이드 분석을 위해 다음 단계를 진행하십시오. 지질 추출물의 알리쿼트(aliquot)를 취하고, 건조함으로 증발하고, 아세토닐리(acetonitrile) 물로 재구성하십시오.그런 다음 엔도칸 나비 노이드 분석을 위해 LC / MS에 20 마이크로 리터를 주입하십시오. 급성 간질 발작의 Kainic 산 유도는 최대 발작 강도 1 시간 후 주입을 주도. 내피칸 나비 노이드와 에이코사노이드의 지질 프로파일링은 물론 인지질 및 엔도 칸 나비 노이드는 대뇌 피질, 죽상 류, 시상 하부, 소뇌뿐만 아니라 카이닉 산 유도 간질 및 폐 조직에서 지질 수준 변화를 보여줍니다.마우스 뇌 펀치의 정량 프로파일링을 위한 인지질 및 엔도칸나비노이드 및 RNA의 이중 추출 후 시상하부내 지질의 정량적 분포, 바소포탈 편도체 및 복부 및 등대 해마를 분석했다. 지질 신호에 관여하는 내인성 효소 및 수용체의 상대적 발현 수준뿐만 아니라 카이닉산 유도 간질 발작 및 대조를 거친 마우스의 다른 뇌 영역 및 하위 영역에서 mRNA 수준에서 조사된 뇌 활동에 대한 마커. 카이닉산 유도 간질은 주로 해마의 CA1, CA3 및 힐루스 지역에서 NeuN 신호의 대규모 손실을 일으켰으며, 대조군 식염수 주입 마우스에 비해 caspase-3 신호로 표시된 세포질 이벤트를 수반하였다.아만성 팔미토일레탄올라미드로 치료한 후, 뉴런 핵 단백질 신호가 눈에 띄게 보존되었고 CASP3 신호는 거의 감지되지 않았다. 뇌 펀칭 및 신중한 뇌 영역의 해부는 매우 도전적이고 여러 코호트에 걸쳐 일관된 샘플링을 얻기 위해 좋은 기술이 필요합니다. 따라서, 테스트 장기에 연습 하 고 뇌 형태에 대 한 좋은 지식은 매우 권장.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Microglia은 중추 신경계의 방어 및 면역 감시의 첫번째 라인을 제공 macrophages를 거주하고 있습니다. MicroRNAs는 활성화 및 macrophages의 차별화 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을 규제 분자입니다. 이 문서에서는 microglia에서 microRNAs의 측정을위한 방법을 설명합니다.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

우리는 여기에서 mRNA의 추출 및 정제를위한 절차와의 metabolites을...

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

고품질 총 RNA는 70% 에탄올에 Azure B로 척수 섹션을 염색한 후 레이저 포획 마이크로디스트섹션에 의해 마우스 척수 모터 뉴런의 세포체로부터 제조되었다. 충분한 RNA(~40-60 ng)는 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의한 하류 RNA 분석을 허용하기 위해 3,000-4,000개의 모터 뉴런으로부터 회수된다.

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

우리는 임상 번역 잠재력 개발 된 높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 뇌척수액 (CSF) 분석에 대해 설명합니다. 시험은 예컨대 아포지 단백질 E 변형 (E2, E3 및 E4)과 같은 신경 퇴행에 대한 잠재적 마커 및 위험 인자를 정량하고, 그 대립 유전자 발현을 측정 할 수있다.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

이 프로토콜은 임상 샘플에서 단백질의 다중 반응 모니터링 (MRM)에 대한 트리플 쿼드러폴 질량 분광계의 사용을 소개하는 것을 목표로합니다. 우리는 샘플 준비에서 임상 샘플을 위한 데이터 분석에 이르기까지 필요한 모든 예방 조치를 취하도록 체계적인 워크플로우를 제공했습니다.

인간 뇌 조직에서 단백질의 다중 반응 모니터링 기반 검출을 이용한 정량적 프로테오믹스 워크플로우

이 프로토콜의 목적은 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분광법 이미징을 사용하여 초파리 뇌와 같은 작은 조직에서 지질 및 대사 산물 분석을위한 적절한 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 이미징 을 사용한 초파리 뇌의 신속한 지질 분석을 위한 샘플 준비

DeepOmicsAE는 다중 오믹스 데이터의 차원을 줄이기 위해 딥 러닝 방법(즉, 오토인코더)을 적용하는 데 중점을 둔 워크플로우로, 여러 계층의 오믹스 데이터를 나타내는 예측 모델 및 신호 모듈을 위한 기반을 제공합니다.

DeepOmicsAE: 단백질체학, 대사체학 및 임상 데이터의 딥러닝 분석을 통한 알츠하이머병의 신호 모듈 표현

이 연구는 알츠하이머병(AD)을 앓고 있는 33명의 단일 핵 전사체를 분석하여 신경교세포에서 성별 특이적 DEG를 밝혔습니다. 기능적 농축 분석은 시냅스, 신경 및 호르몬 관련 경로를 강조했습니다. 주요 유전자, 즉 NLGN4Y와 그 조절인자를 규명하고, 성별 특이적 알츠하이머병에 대한 잠재적 치료제 후보를 제시했습니다.

Glial transcriptome profiles를 기반으로 한 Alzheimer's disease의 성별 특이성에 대한 바이오마커 식별

여기에서는 신경 장애에 대한 microRNA(miRNA) 바이오마커의 공급원으로 작은 세포외 소포체를 얻기 위해 최소량의 신선 냉동 뇌 조직 절편과 크기 배제 크로마토그래피와 결합된 접근 가능한 고속 원심분리 방법을 사용하여 프로토콜을 구축합니다.

갓 얼어붙은 인간 뇌 절편에서 방출된 작은 세포외 소포에서 MicroRNA 화물의 힘 활용 

학습하세요 신경 질환 마우스 모델에서 조직 리피도믹스와 전사학을 동시 분석하는 모듈형 프로토콜을. 뇌 영역별 샘플링과 추출법으로 염증 및 신경 신호 전달 관련 지질 메커니즘을 정밀하게 규명할 수 있습니다.

신경 질환의 리피도혈 및 전사학

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