Name: 인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 배우세요 인간 뉴런에 렌티바이러스를 이용한 돌연변이 타우 형질도입을 통해 시험관 내 타우병증 모델을 구축하는 방법을. 이 기법은 타우 독성 평가와 치료제 선별을 신속하게 수행하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는 PHF-1과 CP13 항 체를 공급 하 고, 사우스 웨스턴 텍사스 대학교에서 마크 다이아몬드 박사를 제공 하 고, 타우의 구조를 제공할 수 있는 피터 데이비스 박사에 게 감사를 드립니다. 이 작품은 알 츠 하이 머 협회에서 보조금에 의해 지원 되었다 (니 렝-14-322164) S.H.Y. 및 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에서 (TB1-01193) P.R.

1. 미디어 및 시 약의 제조
<ol><li>배양 플레이트에 대 한 지 하 막 매트릭스 코팅을 4°c에서 해 동 (지 하 막 매트릭스를 따뜻하게 하거나 응고 하는 것을 허용 하지 않는다). 1 mL의 알리 쿠오를 만들고-20°c 또는-70 ° c에서 보관 하십시오.</li>
	<li>10 µ g/mL에서 멸 균 인산 완충 식 염 액 (PBS)에 기본 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF)를 재구성 하 고 10 µ L 분 취를 만듭니다. 4°c에 보관 하십시오.</li>
	<li>미 개봉 500 mL 병 DMEM, 글루타민을 사용 하 여 B27, 5ml(15 ml) 및 페니실린 streptomycin (5ml)을 첨가 하십시오. 이 신경 줄기 세포 (NSC) 매체의 50 mL을 원추형 튜브에 넣고 10 µ L의 10µ을 추가 합니다. NSC (+) bFGF 매체를 4°c에서 보관 한다.</li>
	<li>(-) BFGF 미디어를 만들려면 1.3 단계에서 설명한 것과 동일한 레시피를 사용 하 되 bFGF 추가 하지 마십시오. 이 매체는 뉴런에 대 한 NSCs를 차별화 하 고 분화 후 신경 배양을 유지 하는 데 사용 됩니다.</li>
</ol>2. 렌 티 바이러스 구조
참고: 렌 티 바이러스 구문을 사용 하 여 작업을 시작 하기 전에 실험실에서 생물학적 안전 수준-2(BSL-2) 에이전트를 사용할 수 있도록 승인 되었는지 확인 하십시오. 또한 렌 티 바이러스 벡터로 작업할 때는 BSL-2 배양 후드, 개인 보호구 및 폐기 방법을 사용 해야 합니다.
<ol><li>선호 하는 공급원 으로부터 렌 티 바이러스으로 포장 된 타우 컨스트 럭 트를 구합니다 (구성 정보는 샌 더 스 외.10 참조).</li>
</ol>3. 인간 신경 줄기 세포 배양
참고: NSCs는 전형적으로 100000-150000 세포/cm2 에서 시 딩 되 고, 시판 되는 대부분의 nscs는 1 x 106 세포/바이 알로 판매 된다. 이 프로토콜은 10cm 세포 배양 접시에 최적화 되어 있습니다 (다른 크기의 요리가 사용 될 수 있지만). 따라서 상업적으로 입수 가능한 NSCs가 사용 되는 경우, NSCs는 10 cm의 접시를 종자에 충분 한 세포를 초래 하기 위해 6-웰 디쉬에 먼저 배양 됨으로써 확장 될 필요가 있다. 이 프로토콜은 대안적으로 다양 한 세포 배양 접시 크기에 적용 될 수 있다 (그러나 이러한 프로토콜이11,12의 다른 곳에서 사용 가능 하므로 nscs를 통과 시키기 위한 지침이 포함 되어 있지 않습니다).
<ol><li>
세포 배양 플레이트의 제조를 위해, 세포 배양 플레이트에 대 한 동결 된 지 하 막 매트릭스 코팅의 1 개의 취 액을 제거 하 고 4°c에서 해 동 할 수 있게 한다 (앨 리 쿠오 트는 세포가 시 딩 되기 전날 밤새 4°c에서 배치 가능). 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 385 µ L을 DMEM/F12 미디어 + 페니실린 streptomycin에 추가 하십시오. 참고: DMEM의 5ml/F12 미디어 + 페니실린-streptomycin은 단일 10cm 접시를 코팅 하기에 충분 합니다 (이 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 용액 1 mL은 6 웰 디쉬를 잘 코팅 하기에 충분 합니다). 대안적으로, 세포가 고정 되 고 면역 염색 되거나 thioflavin을 위해 염색 되는 경우, 유리 커버 상의 배양 세포는 24 웰 배양 접시에 슬립 된다.<ol>
<li>미디어와 매트릭스 코팅을 전 및 배양 접시에 추가 하는 동안 차갑게 유지 합니다. 지 하 막 매트릭스 코팅을 배양 접시에 넣고 요리를 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° c)에 넣습니다. 최적의 코팅을 위해 지 하 막 매트릭스를 1 h 이상 또는 미만으로 배양 하지 마십시오. 1 시간 후, 세포 배양 접시에서 지하실 막 매트릭스 코팅을 흡 기. 이것이 도금 될 준비가 된 것이 NSCs와 일치 하는지 확인 하십시오. 참고: 냉동 주식에서 세포를 해 동 하지 않는 경우, 3.2 단계를 건너 뛰고 단계 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포가 동결 된 NSC 주식에서 해 동 되는 경우, 동결 된 세포의 유리병을 취하고 물에서 바이 알을 앞뒤로 이동 하 여 37 ° c로가 열 된 수조에 따뜻하게 합니다. 동결 해제 되 면, 바이 알을 70% 에탄올로 분무 하 여 세포 배양 후드에 넣습니다. 세포를 DMEM의 10 mL/F12 + 페니실린 streptomycin 매체에 전달 하 고 실 온에서 5 분 동안 1000 x g 의 튜브를 원심 분리 합니다. 미디어를 흡 인 하 고 NSC 매체에 있는 세포를 소생 시킵니다.</li>
	<li>사용 되 고 있는 세포 배양 용기에 대 한 적절 한 시 딩 밀도를 얻기 위해 NSC 배지에서 세포를 희석 한다. 참고: 예를 들어, NSCs가 6 웰 플레이트에 도금 되는 경우-6 웰 배양 접시에 한 웰은 9 cm2-90만의 표면적을 가지 며 종자에는 135만 세포가 필요 하다. 따라서, 100만 세포를 함유 하는 1 개의 바이 알은 2 mL의 배지로 재현 탁 수 있으며 6 웰 디쉬의 단일 웰에 첨가 된다.</li>
	<li>지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 배양 접시 (10만 셀/cm2)를 종자로 NSC 미디어에 부유 하는 충분 한 세포를 추가 하 고 매일 미디어를 변경 (냉동 재고를 사용 하는 경우, 그 이후 매일 도금 후 하루에 미디어를 변경). 80%의 confluent가 될 때까지 세포를 성장. 참고: 이 세포는 도금 직후에는 80%의 합류에 도달 하 게 될 것 이지만 냉동 주가 사용 되는 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>일단 NSCs가 75%-80% confluent가 되 면 NSC (+) bFGF 매체를 제거 하 고 NSC (-) bFGF 매체로 교체 하 여 뉴런 분화를 시작 합니다. 적어도 4 주 동안이 미디어의 세포를 배양 하 여 (매일 미디어 교체). 참고: 세포는 bFGF의 철수 후에 며칠 동안 계속 해 서 나눌 것입니다; 따라서 세포는 90-100% 합류에 도달 할 수 있습니다. 4 주 동안 배양 한 후, 세포는 신경 운명을 달성 하 고 렌 티 바이러스의 치료를 위한 준비가 될 것입니다.</li>
</ol>4. 신경 배양 물의 형질 도입 및 유지
<ol><li>렌 티 바이러스를 사용 하 여 뉴런을 트랜스 코딩 하려면 역가 3.4 x 10 의 변환 가능한 장치/셀 (100% confluent 10 cm 접시에는 ~ 1000만의 뉴런이 포함 됩니다). 세포 배양 배지에서 필요한 농도로 생산 가능한 단위를 희석 하 여 세포에 추가 합니다 (세포 배양 접시에는 정상적인 분량의 배지 사용). 렌 티 바이러스를 첨가 한 후 이틀 후, 신선한 (-) bFGF 배지 (렌 티 바이러스 없이)로 1x 세포를 세척 하 고 평소와 같이 (-) bFGF 배지에서 계속 배양 합니다.</li>
	<li>렌 티 바이러스 치료를 위해, 세포 배양 배지를 변경 하 여 형질 도입 뉴런을 먹이 ([-] bFGF 미디어) 매일. 형질 도입 후 8 주 동안 세포를 유지 한다. 생존을 보장 하기 위해 정기적으로 빛 현미경으로 세포를 시각화. 참고: 스파스 또는 수지상 파손은 세포가 더 이상 실행 가능 하지 않다는 징후입니다.</li>
</ol>5. 세포의 이미징
<ol><li>
살아있는 세포 화상 진 찰
	<ol>
<li>형질 도입 후 (렌 티 바이러스의 첨가 후 4 일째), 살아있는 세포 이미징이 가능한 형광 현미경 하에서 YFP 신호를 관찰 한다. 배양 기에서 세포 배양 접시를 꺼내 배양 접시의 상단에 뚜껑을 유지 하 여 문화 우물이 살 균 남아 있는지 확인 합니다. ~ 514 nm의 여기 파장의 10 배 목표와 ~ 527 nm의 방출 필터를 사용 하 여 셀을 시각화 합니다. 참고: 집계는 일반적으로 형질 도입 세포 배양 물에서 렌 티 바이러스의 적용 후에 6-8 일에 보입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
고정 세포 염색 (β-투 불 린 III 라벨링 및 thioflavin 염색)
	<ol>
<li>파라 포름알데히드 (PFA)의 세포를 고정 하기 위해 유리 커버 슬립에서 자란 형질 도입 뉴런에서 배양 배지를 제거 합니다. PBS로 1x 셀을 세척 하 고 세척을 제거 하 고 µ의 4% PFA (24 웰 플레이트를 사용 하는 경우)를 실내 온도에서 20 분 동안 커버 슬립으로 300~500mb를 추가 하십시오. PFA를 제거 하 고 커버를 PBS로 2 배로 씻으십시오.</li>
		<li>PBS, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 및 0.3% 트리톤 X-100으로 구성 된 블로킹 용액을 제조 하였다. 용액의 300 ~ 500 µ L을 웰에 추가 하 고, 4°c에서 2 시간 동안 커버 슬립을 배양 한다. 2 시간 후, 차단 용액에 1 차 항 체 (1:500의 항 체 농도에서)를 희석 하 고 각 웰에 1 차 항 체 용액을 300 ~ 500 µ L을 첨가 한다. 4 ° c에서 밤새 흔들 또는 회전 플랫폼 (저속)에 플레이트를 놓습니다.</li>
		<li>다음날, 1 차 항 체 용액을 제거 하 고 각 PBS로 5 분 동안 커버 슬립 3을 세척 한다. 블로킹 완충 용액에 2 차 항 체를 희석 (1:1000의 농도로) 하 고 각각의 웰에 2 차 항 체 용액을 첨가 한다. YFP 신호와 겹치지 않는 형광 태그를 사용 하 여 적절 한 2 차 항 체를 선택 합니다 (예: CY-3). 흔들 또는 회전 플랫폼에서 2 시간 동안 실 온에서 세포를 배양 합니다. 2 시간 후, 이차 항 체 용액을 제거 하 고 각 PBS로 10 분 동안 커버 슬립 3을 세척 한다.</li>
		<li>이중 탈 이온 수 (DDW)의 커버 슬립을 10 분간 세척 합니다. DDW를 제거 하 고 10 분 동안 50% 에탄올에 0.015% thioflavin 희석 한 300 µ를 추가 합니다. thioflavin 용액을 제거 하 고 4 분 동안 각각 50% 에탄올을 가진 커버 슬립 2 배를 세척 한 후 4 분 30% 에탄올로 세척 하 고 각각 30% 에탄올로 5 분 동안 두 번 세척 합니다. 마운팅 전에 DDW로 커버 슬립을 1x로 씻으십시오. 참고: 5.2.4 단계에서 설명 된 thioflavin 염색은 선택 사항입니다.</li>
		<li>커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착 하려면 유리 슬라이드의 "+" 측면에 하나의 마운팅 미디어를 놓습니다. 유리 커버 슬립이 포함 된 우물에서 모든 액체를 제거 하 고 미세한 집게를 사용 하 여 유리 커버 슬립을 조심 스럽게 제거 하 고 배양 된 세포가 있는 쪽을 추적 합니다.</li>
		<li>커버 슬립의 가장자리를 키 지움에 살짝 눌러 여분의 수 분을 제거 하십시오. 여전히 커버 슬립을 미세 집게로 파지 하 고 커버 슬립의 가장자리 (장착 용지 방울을 향하게 하 여 셀 쪽)를 장착 매체에 터치 한 다음 장착 용지에 커버 슬립을 부드럽게 배치 합니다 (배양 된 셀을 장착 커버와 글래스 슬라이드 사이에 두고 양측). 이미징 하기 전에 마운팅 미디어가 30 분 동안 강화 되도록 하십시오. 슬라이드는 추후 사용을 위해-20°c에 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>형광 현미경을 이용 하 여 세포를 이미지 하 고 적절 한 여기/방출 스펙트럼 (yfp = ~ 514/527 nm, CY-thioflavin = 555/568 ~ 390/426 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 선택적 방법
<ol><li>2 일 마다 배양 물에서 컨디셔닝 된 배지를 수집 하 고 배양에 의해 방출 된 타우 종의 미래 분석을 위해-20°c에 보관 하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜은은-얼룩 양성 응집 체 및 thioflavin 양성 신경 섬유의 엉 킴 (NFTs)을 전시 하는 인간 타우 병의 시험관 내 모델의 생성을 설명 합니다. 더욱이, 형질 도입 세포는 형태학 적 결함, 감소 된 synaptogenesis 및 증가 된 리소 소 부피와 같은 타우-유발 병 리를 표시 한다. 이 프로토콜의 주요 이점은 타우 독성의 분석 뿐만 아니라 약물 스크리닝 연구에 사용 될 수 있는 신경 병 증의 접근 및 비용 효율적인 모델을 제공 한다는 것입니다. 이 모델은 인체 타우 병 세포 주를 아직 널리 사용할 수 없고 마우스 유래 뉴런에서 형질 전환 타우를 사용 하 여 동물 사육이 필요 하 고 신경 세포의 차이로 인해 신경 변성 연구에 필요한 물질을 채 웁 니다. 종 사이의 특성.
위에 나열 된 것 외에도이 절차를 성공적으로 수행 하려면 여러 가지 중요 한 단계가 있습니다. 먼저, 바이러스 성 역가가 너무 낮으면 문화가 응집을 형성 하지 않기 때문에 올바른 바이러스...

소 세관-관련 단백질 타우의 병리학 적 응집은 AD, 전방 측 두 성 치 매 (FTD), 픽의 질병 및 진보적인 수 아 핵 성 마비 (PSP)1을 포함 하는 많은 신경 변성 질환의 정의 특징 이다. 질병이 없는 상태에서, 타우는 뉴런 축 삭2에서 미세 구 필 라 멘 트에 결합 하 고 안정화 시킵니다. 그러나, 타우의 질병 관련과 인 산화는 타우 응집을 촉진 하 고, 미세 세관에서 해리 되며, 신경 독성3. 집계 된 tau의 독성 효과는 세포내 칼슘의 장애 조절을 초래 하 고, 최종적으로는 세포 사 멸을 유발 하는 콜린 성4 및 glutamatergic 수용 체의 변종 활성화를 수반할 수 있다. 동물 모델에서, 뇌 타우의 감소는 AD 마우스에서 병리학을 향상6 반복적 인 가벼운 외상 성 뇌 손상의 마우스 모델에서7.
장착 증거는 마우스 유래 타우의 구조와 결합 친화도가 인간 유래 타우와 구별 된다는 것을 보여주고, 마우스 타우는 인간 tauopathies 모델링에 부적합 하다8. 그러나, 인간 세포 동종 요법 모델은 널리 상업적으로 입수 가능 하지 않다. 이 작업의 전반적인 목표는 인간 뉴런이 돌연변이 인간 타우 컨스트 럭 트9를 포함 하는 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 타우 응집의 시험관 내 모델을 기술 하는 것 이다. 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트를 유발 하는 타우 집합체는 yfp 리포터 (타우-wt-yfp)에 융합 된 야생 형 (wt) 타우 반복 도메인에 대 한 대조 군 코드를 생성 하는 반면, 타우 반복 도메인의 품고 P301L 및 V337M 돌연변이에 융합 하는 것 이다. 이 방법을 사용 하 여 형질 도입 신경 배양 물은 nontransduced 문화 보다 약 9 배 더 많은 타우를 표현 한다. 타우 발현의 과다 발현 양은 타우-르 DLM-YFP와 타우 Wt-형질 도입 세포 사이에서 대략적으로 동일 하지만, 타우-RDLM-YFP 디스플레이 응집 체로만 뉴런 형질 도입. 배양 액은 thioflavin 및 시 냅 스 밀도의 표시 감소에 대 한 긍정적 인 형질 도입-YFP 얼룩과 함께 제공 됩니다. 따라서,이 셀룰러 모델은 시험관 내에서 타우 응집을 연구 하기 위한 유용한 도구가 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>10cm 배양 접시</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 배양 플레이트</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>스프레이 병</td><td>에 70% 에탄올다양한 출처</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>기저막 매트릭스 (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>다양한 출처</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>다양한 공급원</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>글루타민을 함유한 DMEM-F12 배양 배지</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(50% 농도 이상)</td><td>다양한 공급원</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>형광 표지된 2차 항체</td><td>다양한 공급원, 실험 의존적</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>다양한 공급원</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>인간 신경 줄기 세포</td><td>다양한 소스</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 벡터</td><td>다양한 소스</td><td>맞춤형 주문</td><td></td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1차 항체</td><td>다양한 공급원, 실험에 의존하는</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>로킹 또는 회전 플랫폼</td><td>다양한 공급원</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 배양 후드</td><td>다양한 출처</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>티오플라빈 S</td><td>시그마</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>써모피셔</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>다양한 출처</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

단백질 타우의 변종 응집은 병리학 적으로 알 츠 하이 머 병 (AD)을 비롯 한 다 수의 퇴행 성 신경 질환에 관여 한다. 동종 요법의 마우스 모델은 집계 된 타우의 신경 독성 메커니즘을 조사 하기 위한 귀중 한 자원을 제공 했지만, 신경 생리학의 종 간 차이로 인해 마우스 뇌는 적합 하지 않다는 것이 점차 명백 해지고 있습니다. 인간의 상태 모델링. 세포 배양 방법의 진보는 시험관에서 실험적인 사용을 위해 인간적 인 신경 배양을 접근 하 고 신경 치료제의 발달에 원조 했습니다 만들었습니다. 그러나, 인간 신경 세포 배양의 적응에도 불구 하 고, 인간 타우 병의 시험관 내 모델은 아직 널리 이용 되지 않는다. 이 프로토콜은 인간 뉴런이 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터에 융합 된 병리학 적 돌연변이 타우에 대 한 코드를 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 하는 타우 응집의 셀룰러 모델을 기술 한다. 형질 도입 배양은 thioflavin에 대해 긍정적으로 얼룩을 발생 하는 타우 응집 체를 생산 하 고 신경 독성의 마커를 표시 합니다 (예: 감소 된 축 사 길이 및 증가 된 리소 소 양). 이 절차는 인간적 인 tauopathies를 공부 하기를 위한 유용 하 고 비용 효과적인 모형 일 수 있습니다.

형질 도입 뉴런은 형광을 YFP로 태깅 하였으며, RDLM-형질 도입 배양은 형질 도입 후 응집 체를 표시 하였다. 이러한 개재 물은 thioflavin을 위해 긍정적으로 염색 되었습니다 (그림 1). 그림 1 에서 알 수 있듯이이 프로토콜은 thioflavin 타우 응집 물을 표시 하는 뉴런 문화를 생성 합니다. 초기 실험의 경우, 신경 세포 분화는 배양 물에서 뉴런 특이 적 마커 β-투 불 린 III를 면역 표지 하 여 확인 하는 것이 좋습니다. 중요 하 게는, 형광으로 태그 된 이차 항 체는 YPF (Cy3 예를 들어)와 겹치지 않는 흥분/방출 스펙트럼을 가져야 합니다. 황색 형광 타우 응집 체는 염색의 부재에서 볼 수 있지만, thioflavin 또한 형광 신호가 타우 및 세포 잔해가 아니라 응집 되어 있음을 확인 하기 위해 이미징에 사용 되어야 한다. 추가적으로, 도 1</st...

이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

이 프로토콜에서 우리는 인간 타우오병증의 체외 모델을 자세히 설명합니다. 이 방법은 약물 선별 및 질병 메커니즘 연구에 유용 할 수있는 물질 필요를 채웁니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 배양 패러다임이 동물 연구에 비해 타우 독성 및 잠재적 타우 치료에 대한 보다 신속한 평가를 허용한다는 것입니다.이 절차는 4섭씨에서 배양 판에 대한 지하 막 매트릭스 코팅을 해동하기 시작한다.1 밀리리터 알리쿼트를 만들고 영하 20도 또는 영하 70도에 보관하십시오. 다음으로, 밀리리터당 10 마이크로그램의 농도로 멸균 PBS의 기본 섬유아세포 성장 인자를 재구성한다. 10 마이크로 리터 알리쿼트를 만들고 섭씨 4도에 보관하십시오.그런 다음 글루타민을 곁들인 DMEM-F12의 새로운 미개봉 500 밀리리터 병을 설정합니다. B27의 밀리리터 10개, N2 5밀리리터, 페니실린 연쇄상 구균 5밀리리터를 추가하여 신경 줄기 세포 매체를 준비합니다. NSC 미디어의 50 밀리리터를 원내 튜브에 넣고 준비된 bFGF의 마이크로리터 10기를 추가합니다.이 NSC 플러스 bFGF 미디어를 섭씨 4도에 저장합니다. 첫째, 냉동고에서 세포 배양 판을 위한 냉동 지하 막 매트릭스 코팅의 알리쿼트를 제거하고 섭씨 4도에서 해동할 수 있게 한다. 페니실린-연쇄상 구균을 함유한 DMEM-F12 매체의 5밀리리터에 해동된 지하 막 매트릭스 코팅의 385마이크로리터를 추가합니다.동결된 NSC 주식에서 세포가 해동되는 경우 냉동고에서 냉동 셀 바이알을 가져 와서 물 에서 유리병을 앞뒤로 이동하여 섭씨 37도까지 가열된 수조에서 따뜻하게 하십시오. 그 후, 바이알을 70%에탄올로 스프레이합니다. 그런 다음 세포 배양 후드 하에서 페니실린-연쇄절제술을 함유한 DMEM-F12 배지의 약 10밀리리터로 세포를 이송한다.실온에서 원심분리기는 5분 동안 1, 000배 g입니다. 그런 다음 미디어를 흡인하고 NSC 미디어의 세포를 다시 중단합니다. 사용 중인 세포 배양 용기에 적합한 파종 밀도를 얻기 위해 NSC 매체에서 세포를 희석한다.NSC 배지에 매달린 충분한 세포를 추가하여 지하 막 매트릭스 코팅 배양 접시를 시드합니다. 75~80%의 컨실수될 때까지 이산화탄소가 5%인 섭씨 37도에서 세포를 성장시켜 매일 미디어를 변경합니다. 렌즈 바이러스와 뉴런을 변환하려면, 세포 당 340, 000 변환 단위의 티터 수를 사용합니다.세포 배양 매체의 변환 가능한 단위를 필요한 농도로 희석하고 세포에 추가합니다. 렌티 바이러스를 추가 한 후 이틀, bFGF를 포함하지 않는 신선한 매체로 한 번 세포를 씻어. bFGF없이 미디어에서 5 %의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 계속 배양하십시오.세포 배양 매체를 격일로 변경하려면 트랜스포션 후 약 8주 동안 세포를 유지한다. 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 일상적으로 시각화하고 생존가능성을 보장합니다. 트랜스포메이션 후 인큐베이터에서 배양 접시를 제거하여 배양소가 멸균되도록 뚜껑을 유지하십시오.514 나노미터의 여기와 527 나노미터의 방출 필터로 10X 목표하에서 세포를 시각화하기 위해 살아있는 세포 이미징이 가능한 형광 현미경을 사용합니다. 이 연구에서 타우 RDLM-YFP 렌티바이러스로 변형된 뉴런은 YFP로 형광태그가 매답합니다. RDLM 변환 배양은 변환 후 집계를 표시하는 것으로 보입니다.이러한 포함 은 티오 플라빈에 대한 긍정적 인 얼룩. 뉴런 분화는 배양에서 뉴런 특이적 마커 베타-튜불린 III의 면역 라벨링에 의해 확인된다. 형광 태그이차이차 항체는 YFP의 것과 겹치지 않는 흥분 방출 스펙트럼을 가져야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.황색 형광 타우 응집체는 염색이 없는 상태에서 볼 수 있지만, 티오플라빈은 형광 신호가 세포 이물질이 아닌 타우를 집계하는지 확인하기 위해 이미징에도 사용되어야 한다. 타우 과잉 발현 세포의 생성에 이어, 신경 건강과 타우 응집의 평가의 숫자는 수행 될 수있다. 예를 들어, 우리는 이 세포가 축축변성을 표시한다는 것을 것을을 발견했습니다.세포 배양 연구 외에도, 우리는 병원성 엑소소말 유래 타우를 검사하기 위해이 방법을 사용했다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 pH 민감성 형광 표지 타우 응집체를 사용하여 쥐 미세아교세포의 Tau 흡수를 정량화하는 세포 기반 분석을 보여주며, 정량적 평가를 위해 형광 활성화 세포 분류를 통해 분석됩니다.

미세아교세포에 의한 타우 단백질 흡수를 평가하기 위한 세포 기반 분석

이 비디오는 단백질 응집을 연구하기 위해 노란색 형광 단백질(YFP)로 태그된 돌연변이 인간 타우 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스로 인간 신경 세포를 transduction하는 과정을 보여줍니다. 이는 바이러스 진입에서 돌연변이 타우 발현까지의 단계를 간략하게 설명하며, 뉴런에서 눈에 보이는 세포질 타우 응집체의 형성으로 절정에 이릅니다.

타우 단백질 응집 분석을 위한 인간 뉴런의 렌티바이러스 매개 형질도입

수정되지 hyperphosphorylated 타우 단백질 과인산 화 - 의존성 응집 빠른 반응 속도를 나타 내기 위해 두 응집 시험 관내 어 세이에 사용 하였다. 상기 분석 방법은 알츠하이머 질환의 진행의 기초를 형성하는 피 브릴 hyperphosphorylated 타우 성향을 변조 할 화합물에 대한 미래의 화면에 대해 방법을 포장.

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

단백질 응집체 또는 단백질 요법 씨앗의 세포 간 이동은 신경 퇴행성 질환에서 병리학의 진행의 기초가 될 수 있습니다. 여기에서는 재조합 또는 생물학적 샘플에서 시딩 활성을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있는 새로운 FRET 유세포 분석 분석에 대해 설명합니다.

FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

이 원고에 설명 된 타우 집계 분석 결과 vivo에서 타우 misfolding 및 집계의 예상된 기능을 모방 합니다.

생체 외에서 타우 단백질 및 마약 검사의 집계를 공부에 대 한 분석 결과

여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.

Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.

질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

폴리글루타민 척수뇌 운동실조증은 CAG 확장으로 인해 응집 가능성이 높은 단백질이 생성되어 발생합니다. 이 프로토콜은 벡터 생성, 입체적 전달, 포함물 및 신경 마커 손실 분석을 설명하여, 신경퇴행성 질환의 기전 조사와 표적 치료제를 평가할 수 있는 통제된 플랫폼을 제공합니다.

렌티바이러스 유발 선관절 병리학을 폴리글루타민 척수소뇌 운동증의 전임상 모델로 활용하다

배우세요 인간 뉴런에 렌티바이러스를 이용한 돌연변이 타우 형질도입을 통해 시험관 내 타우병증 모델을 구축하는 방법을. 이 기법은 타우 독성 평가와 치료제 선별을 신속하게 수행하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델

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