Name: 실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 학습하세요 후각 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링 방법을 증기상 자극을 사용하여. 이 기술은 생리학적으로 관련성 높은 환경에서 후각 인지의 역학을 연구하고 후각 수용체 기반 바이오센서 개발을 가능하게 합니다.

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이 작품은 NIH (DC014423 및 DC016224)와 방위 고급 연구 프로젝트 기관 RealNose 프로젝트에서 교부 금에 의해 지원 되었다. YF 순환 재능 있는 연구원 (R2801)를 가속 화 하기 위해 전략적인 국제 네트워크 발전 위한 JSP 프로그램에서 재정 지원을 가진 듀크 대학에 머물렀다. 우리 감사 Sahar Kaleem 원고 편집.

1. Hana3A 셀 문화
<ol><li>M10 준비 (최소 필수 매체 (MEM) 플러스 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청 (FBS))와 M10PSF (m 10와 100 µ g/mL 페니실린-스 및 1.25 µ g/mL 암포 B).</li>
	<li>37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 설정 하는 인큐베이터에서 100 mm 셀 문화 접시에 M10PSF의 10 mL에 셀 문화.</li>
	<li>분할 셀 20% 비율로 매 2 일: 셀 (약 107 셀 x 1.1)의 100% 합류 단계 대조 현미경 관찰은, 미디어를 갈망 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL와 함께 부드럽게 세포를 씻어.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 0.05 %trypsin 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA, 0.48 m m)의 3 mL를 추가 합니다. 셀 접시에서 해리 될 때까지 약 1 분 동안 행동 하자.</li>
	<li>하는 트립 신을 비활성화 하 고 결국 아래로 pipetting으로 접시에 여전히 연결 된 셀 분리 M10의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브를 볼륨 (8 mL)를 전송 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 200 x g 에서 원심 및 위쪽 및 아래쪽을 셀 대량 pipetting으로 M10PSF의 5 mL로 세포를 resuspend. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.</li>
	<li>Resuspended 셀 솔루션 새로운 100 mm 셀 문화 접시에서의 1 mL를 전송 하 고 신선한 M10PSF의 9 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
</ol>2입니다. 세포 Transfection에 대 한 준비
<ol><li>단계 대조 현미경으로 관찰 하 여 합류, 또는 세포의 수를 평가 합니다. 적어도 10% 합류 (약 106 셀 x 1.1) 한 접시에 필요한.</li>
	<li>미디어를 발음 하 고 부드럽게 10 mL의 PBS로 세포를 씻어. PBS를 발음 하 고 EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 셀 접시에서 해리 될 때까지 실내 온도에, 대략 1 분 동안 행동 하자.</li>
	<li>하는 트립 신을 비활성화 하 고 결국 아래로 pipetting으로 접시에 여전히 연결 된 셀 분리 M10의 5 mL를 추가 합니다. 15 mL 튜브를 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기 (8 mL) 볼륨을 전송.</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 위쪽 및 아래쪽을 셀 대량 pipetting으로 M10PSF의 5 mL로 세포를 resuspend. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.</li>
	<li>페 수에 번호판의 수에 따라 적당 한 양만큼 저수지에 셀의 M10PSF의 적절 한 해당 볼륨을 전송. 한 96 잘 접시 6 mL의 총 볼륨에 도달 하는 M10PSF에 희석 100% confluent 100 mm 접시 (약 106 셀 x 1.1)의 1/10으로 도금 한다. 한 96 잘 접시 100% 합류 100 mm 접시로 시작, 신선한 M10PSF의 5.5 mL를 사용 resuspended 셀의 5 mL에서 500 µ L을 추가 합니다. 공기 거품을 생성 하지 않고 셀과 M10PSF를 혼합.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 각 음에 일시 중단 된 셀의 50 µ L 플라스틱. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.</li>
</ol>3. 플라스 미드 Transfection
<ol><li>30%와 50% 사이 셀 합류 보장 단계 대조 현미경 96 잘 접시를 관찰 합니다.</li>
	<li>전체 접시에 일반적인 플라스 미드를 포함 하는 첫 번째 transfection 믹스를 준비 (RTP1S, 또는 Glosensor 단백질, 테이블의 자료를 참조 하 고) 다음 표 1에 볼륨. 통보의 수량 여러 경우로 태그 OR ORs의 수로 분할 되어야 ORs. 참고: 우리가 강력 하 게 조언 빈 벡터 부정적인 제어 (여기로 pCI) 및 어떤 긍정적인 제어 (테스트 odorant에 응답 또는 알려진) 실험 계획을 추가 하려면.</li>
	<li>MEM의 500 µ L의 Lipofectamine 2000 시 약 20 µ L을 포함 하는 두 번째 transfection 믹스를 준비 (적합 한 96 잘 접시, 테이블의 자료를 참조). 첫 번째, 두 번째 믹스를 추가 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 섞어 실 온에서 15 분 동안 품 어. M10의 5 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합.</li>
	<li>최종 transfection 미디어의 50 µ L에 의해 이전 platted 96 잘 접시에 M10PSF를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 incubate 및 루미 노 하룻밤 다음 6 단계에 설명 된 절차의 챔버를 진공.</li>
</ol>4. 기판 부 화
<ol><li>60%와 100% 사이 셀 합류 보장 단계 대조 현미경 96 잘 접시를 관찰 합니다. 자극 솔루션의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 10 mM의 hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 및 D-포도 당의 5 mM을 포함 준비.</li>
	<li>75 µ L 캠프 시 약의 희석 (참조 테이블의 재료) 자극 솔루션의 2.75 mL 해결책. 96 잘 접시에서 transfection 매체를 제거 하 고 각 음을 신선한 자극 솔루션의 50 µ L을 추가 하 여 셀을 세척.</li>
	<li>자극 솔루션을 제거 하 고 25 µ L 캠프 시 약 해결책 단계 4.2 각 영역에서에서 준비의 추가. 실내 온도 2 h에 대 한 어둡고 냄새 없는 환경 (예: 화학 물질 또는 odorant 소스에서 멀리 떨어져 깨끗 한 빈 서랍) 96 잘 접시를 품 어.</li>
</ol>5. Odorant 자극
<ol><li>첫째, 휘발성 odorant 분자와 루미 노 챔버 equilibrate. 미네랄 오일 (그림 2A) 10 mL에 원하는 농도에 odorant 희석. 캠프 시 보육 시간 끝나기 전에 추가 25 µ L odorant 솔루션의 새로운 96 잘 접시에서 (아니라 셀을 포함 하는 하나). 실내 온도 5 분 (그림 2B) (루미 노 기록 없음)가 필요 합니다 여기 루미 노 챔버에이 odorant 접시를 품 어.</li>
	<li>설정 기록 0 발광을 루미 노 s 90의 격판덮개 측정의 20 주기 동안 지연의 0.7의 주기 사이 간격의 s.</li>
	<li>접시를 읽기 전에 바로 상공에서 odorant 플레이트를 제거 합니다. (추가 하지 않으면는 odorant 우물을 포함 하는 셀) 셀에 포함 된 96 잘 접시의 우물 사이 odorant의 25 µ L을 추가 하 고 신속 하 게 30 분 (그림 2C) 이내 20 사이클에 대 한 모든 우물의 발광 측정을 시작.</li>
</ol>6. 나머지 odorant는 루미 노 안에 제거
<ol><li>루미 노의 문을 열으십시오. 진공 펌프에 연결 하는 튜브를 삽입 합니다.</li>
	<li>독서에 진공 odorants 챔버 광범위 하 게 (적어도 2 h, 선호 하룻밤) 다른 한 실험에서 냄새 휘발성의 교차 오염을 피하기 위하여 두 odorants 사이. 다음 odorant 잠복기 전에 5 분 동안 압축 공기를 전송 하 여 신선한 공기를 바꿉니다.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>루미 노 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다.</li>
	<li>녹화 때마다 또는 동일의 복제를 평균. OR 평균 하는 컨트롤 값을 분할 하 여 최종 컨트롤 (예: 빈 벡터 그림 3A , 대표적인 결과 섹션)를 정규화 또는 응답 각 녹화 시간 (그림 3B에 값 평균을 계산합니다 및 대표적인 결과 섹션).</li>
	<li>0에서 평균된 또는 응답을 분할 하 여 각 OR에 대 한 응답의 기저 활동을 표준화 각 녹음 시간 응답 (참조 그림 3C 와 대표적인 결과 섹션)에 s.</li>
	<li>단일 또는 응답 값을 가져오기 위해 각 OR의 곡선 아래의 영역을 계산 합니다. 이렇게 하려면 각 OR에 대 한 각 녹음 시간의 모든 발광 값을 합계 하십시오.</li>
</ol>

Y.F., H. K와의 HM 특허 출원 27 10 월 2016에이 작품에 관련 된 신청.

냄새의 인식을 근본적으로 ORs의 활성화에 따라 달라 집니다. 따라서, 그들의 기능에 대 한 이해는 뇌의 휘발성 화학 환경 인식에 사용 하는 복잡 한 메커니즘을 깰 필요 합니다. 그러나,이 과정의 이해는 생체 외에서 odorants. 에 대 한 기능 또는 레 퍼 토리에 강력한 방법 수립에 어려움에 의해 방해 되었습니다. 셀 태그 수용 체13,19 의 창조와 발견과 OSNs22 에 표현 된 수용 체 수송 단백질 (RTPs)의 최적화 ORs의 표면과 분리 식 부분적으로 해결 되었습니다 , 23. 첫 번째 심사 연구 다음 등장, 자신의 odorant 인식 패턴6,7,,...

냄새의 감각 지상파 동물을 그들의 휘발성 화학 환경 드라이브 행동과 감정에 작용할 수 있습니다. 근본적으로, 냄새 탐지 과정 odorant 수용 체 (ORs)1의 수준에 후 각 시스템과 odorant 분자의 첫 상호 작용으로 시작 됩니다. 포유류에서 ORs 개별적으로 후 각 감각 신경 (OSNs)2후 각 상피 위치한 표현 됩니다. 그들은 rhodopsin 같은 하위 가족 (클래스 A 라고도 함) 보다 정확 하 게 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) 가족에 속한다. ORs는 물질로 G 단백질 Golf 의 활성화 캠프 생산 주기적인 뉴클레오티드 문을 단 수로의 개통 및 활동 전위의 발생에 이르게 된 커플. 그것은 허용 냄새 percept 활성화 ORs,34 의 특정 패턴에 의존 하 고 따라서 냄새 인식와 조합 코딩 체계, 한 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant 활성화할 수 있는 ORs의 조합입니다. 그리고 이러한 조합 코딩을 통해 그것은 가정 하는 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별. 냄새 인식 하는 방법을 이해 하는 열쇠 중 하나를 이해 하는 방법 및 ORs 주어진된 냄새에 의해 활성화 되는.
Odorant 명료 하 게 하려고-또는 상호 작용, 생체 기능 분석은 필수적인 역할을 했다. 고아 ORs (OR 드 orphanization)에 대 한 길 항 제 향기가 ligands의 식별 다양 한 생체 외에서, 비보, vivo에서 기능 분석 실험5,6,7 전을 통해 지난 20 년간 매우 활성 필드 되었습니다. ,8,9,10,11,12,13,,1415,16, 17.
생체 외에서 분석 결과 시스템은 ORs, 식별 기능 도메인 및 ORs, 잠재적인 엔지니어링 응용 프로그램의 중요 한 잔류물 등의 상세한 기능 특성에 가장 적합. 그러나, 추가 ORs 위한 귀중 한 생체 외에서 시스템의 개발 자란 OSNs와 어려움과 분리 셀에서 ORs의 기능적 표현 때문에 부분에 도전이 되었습니다. 첫 번째 도전 odorant의 매핑 기능 ORs의 세포 표면 표현에 대 한 허용 하는 프로토콜 설정 있 었-또는 상호 작용. 다양 한 접근5,6,7,,89,10,11,12을 활용 하는 독립적인 그룹 수 14,18,,1920. 초기 성과 중 하나는 Krautwurst 그 외 여러분에 의해 만들어진에 N-말단 ORs의 rhodopsin (Rho-태그)의 단축 시퀀스를 태그 하 고 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀13에 향상 된 표면 식을 관찰. 유사 또는 시퀀스에 연결 된 태그를 여전히 OR 표현과 기능19,21을 향상을 위한 탐험 경로입니다. 사이토 외. 다음 수용 체 수송 단백질 1 (RTP1) 식별 및 RTP2 OR 매매를 용이 하 게. 22 RTP1, RTP1S, 라는의 짧은 버전 원래 단백질23보다 훨씬 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 또한. 개발 선의 셀 (Hana3A) Golf를 안정적으로 표현, REEP1, RTP1, RTP2 24, 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 기자 들의 사용과 함께 odorant의 활성화-또는 상호 작용. 단백질의 RTP 가족 ORs의 세포 표면 표현 촉진 메커니즘 확인할 수 있다.
이러한 설립된 방법의 하나 주의할 그들이 odorant 자극 액체 단계에서 odorants 자극 매체에 미리 용 해 세포를 자극 하는 매체를 대체 하 여 의미에 의존입니다. 이 생리 적인 조건 odorant 분자 수증기 단계에서 후 각 상피에 도달 하 고 비 강 점 막에 의해 해산 ORs를 활성화 매우 다릅니다. 더 밀접 하 게 닮은 순수 관련 자극 노출, 펠 레 외.20 플라스틱 필름 셀 웰 스 상단에 배치의 내부 얼굴 아래 걸어 odorant 솔루션의 방울을 적용 하 여 증기 자극에 따라 분석 결과 제안. 그들은 형광 강도 모니터링 하 여 칼슘 응답을 기록 했다. 이 메서드는 공기 단계 odorant 자극을 사용 하 여 처음 하지만 또는 활성화의 큰 심사를 허용 하지 않았다.
여기, 우리는 Glosensor 분석 결과 (그림 1)에 의해 증기 위상 odorant 자극을 통해 생체 외에서 또는 활성화의 실시간 모니터링 하는 새로운 방법을 개발 했다. 이 분석 결과 이전 액체 odorant 자극18,19,25,26,,2728,29, 의 맥락에서 사용 되었습니다. 30 , 31. 모니터링 챔버는 루미 노의 플레이트 (그림 1A)를 읽기 전에 증발된 odorant와 equilibrated 처음 이다. Odorant 분자는 버퍼, 관심, RTP1S 및 Glosensor 단백질 (그림 1B) OR을 표현 하는 Hana3A 세포 목욕으로 solvated. odorant or 주 작동 근 이면 OR 전환 활성화 나 란 하 고 바인딩할 Golfadenylyl 있고 (AC), 활성화 되며 궁극적으로 캠프 레벨 상승 원인이. 이 상승 캠프 바인딩할 하 고 발광 소 catalyzing를 생성 하는 Glosensor 단백질을 활성화할 것 이다. 이 발광 다음는 루미 노에 의해 기록 되 고 또는 활성화 모니터링. 이 메서드는 또는 deorphanization의 문맥에 높은 관심의 냄새의 자연 인식에 생체 외에서 시스템 가까이 제공로 서.

<table><tbody><tr><td>0.05 % 트립신 -EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05 % 트립신 - EDTA (1x), 페놀 레드 - 4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>100mm 세포 배양 접시&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>353003 100 mm x 20 mm 세포 배양 접시&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td>17 mm x 120 mm 원뿔형 튜브</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3843</td><td>96 well, LE 뚜껑 흰색 투명 바닥이 있는 Poly-D-lysine 코팅 폴리스티렌</td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Amphotericin B 250 &micro; g/mL - 4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>원심 분리기</td> 기계 <td>Jouan</td><td>C312</td><td>원심 분리기 기계 15 mL</td></tr><tr><td>클래스 II 유형 A / B3 흄 후드</td><td>NUAIRE</td><td>NU-407-500</td><td>흄 후드 세포 배양</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Fetal Bovine Serum --20 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>GloSensor cAMP 시약</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td>GloSensor cAMP 시약 발광 단백질 기질 - -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>인큐베이터 37 &deg; C; 5 % CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-604</td><td>세포 배양용 인큐베이터</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000 시약 1mg/ml 형질 주입 시약 - 4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>Luminometer POLARstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>discontinued</td><td>96 well plate reader for luminescence</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>냄새 유발 물질 용 솔벤트 - 실온에서 보관</td></tr><tr><td>최소 필수 매체 (MEM)</td> <td>Corning cellgro</td><td>10-010-CV</td><td>최소 필수 매체 Eagle with Earle' S 솔트 & L-글루타민 - 4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4333</td><td>페니실린-스트렙토마이신 용액은 10,000U의 페니실린과 10mg 스트렙토마이신으로 안정화됨 - -20°C에서 보관 C</td></tr><tr><td>pGlosensor</td><td>Promega</td><td>E2301</td><td>pGloSensor-22F cAMP 발광 단백질 플라스미드 - 4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>Leica</td><td>090-131.001</td><td>위상차 현미경 x4, x10, x20 대물렌즈</td></tr><tr><td>RTP1S</td><td>H. Matsunami</td><td></td> <td>lab-100 ng/&micro; L 플라스미드 - 4 &deg에 보관; 씨</td></tr></tbody></table>

실시간 체 외 odorant 수용 체 활성화는 odorant 수증기 단계에서의 모니터링

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

후 각 인식 odorant 수용 체와 odorants의 상호 작용으로 시작 (또는) 후 각 감각 신경 (OSN)에 의해 표현. 냄새 인식 조합 코딩 구성표, 어디 하나 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant ORs의 조합을 활성화할 수 있습니다 다음과 같습니다. 이러한 조합 코딩을 통해 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별 수 있습니다. 따라서, 주어진된 농도에서 냄새는 각 냄새에, ORs의 활성화 패턴으로 설명할 수 있습니다. 그런 의미에서 두뇌를 사용 하 여 냄새 필요 이해 odorant 인식 메커니즘 크래킹-또는 상호 작용. 이 때문에 후각이 지역 사회는 "-orphanize" 이러한 수용 체. 기존의 체 외 시스템 odorant 식별 하는 데 사용-또는 상호 작용 이용 잠복기 셀 미디어 odorant, ORs와 상호 작용 하기 전에 비 강 점 막에 증기 odorants 해산을 통해 냄새의 자연 검색에서 별개입니다. 여기, 우리는 기상 odorants 통해 또는 활성화의 실시간 모니터링을 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 캠프 릴리스 Glosensor 분석 결과 사용 하 여 발광 측정에 의존 합니다. 그것은 현재 간격 vivo에서 그리고 생체 외에서 접근을 다리 고 biomimetic 휘발성 화학 센서에 대 한 기반을 제공 합니다.

우리는 3 개의 마우스 ORs, Olfr746, Olfr124 및 Olfr1093의 응답 상영 cinnamaldehyde 증기 자극 (그림 3)를 사용 하 여. 동시에, 우리는 테스트 ORs의 odorant 유발 활동은 특정 보장 빈 벡터 제어 (Rho-pCI) 사용 (그림 3A). 증기 odorant 자극 시 ORs의 실시간 활성화 모니터링된 20 측정 주기를 했다. 각 데이터 잘 했다 먼저 정규화 빈 벡터 제어 평균 값을 각 주기 (그림 3B)에 대 한. 그것은 ORs 또는 종속 방식에서이 분석 결과에서 변수 수준의 기저 활동을 표시할 수 있습니다 그것은 또한이 매개 변수 (그림 3C)에 그들의 응답을 정상화 하는 것이 중요...

순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.

실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

우리의 프로토콜은 냄새 수용체 패널로 휘발성 냄새의 검출 및 차별을 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 악취 수용체 기반 바이오 센서를 개발할 가능성을 열어줍니다. 이 기술은 증기 상에서 악취 분자에 악취 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링을 할 수 있습니다.그것은 체외와 생체 내 접근 사이의 간격을 채웁니다. 이 방법은 점막 대사 효소의 역할을 포함하여 악취 지각으로 이끌어 내는 사건의 운동학을 이해하는 데 이용될 수 있습니다. 시작하려면 원고에 따라 M10 및 M10 PSF를 준비하십시오.세포는 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 M10 PSF의 10밀리리터로 배양됩니다. 상 대비 현미경으로 배양 접시를 관찰한다. 100%의 합류에 도달하면 세포를 미디어를 심고 PBS의 10 밀리리터로 부드럽게 세포를 세척하여 세포를 더 낮은 농도로 분할합니다.그런 다음 PBS를 흡인하고 트립신-EDTA의 3 밀리리터를 추가합니다. 세포가 접시에서 해리 될 때까지 약 1 분 동안 반응하게하십시오. 5 밀리리터의 M10을 추가하여 트립신을 비활성화하고 파이펫을 위아래로 사용하여 접시에 부착 된 세포를 분리합니다.접시에서 15 밀리리터 튜브로 셀 서스펜션 8밀리리터를 옮기고 튜브를 200회 G에서 5분간 원심분리합니다. 수퍼네티드를 흡인시키고 M10 PSF의 5밀리리터에서 세포를 재보페팅하여 세포 질량을 분해하도록 배관합니다. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.세포의 20%의 합류를 얻으려면 새로운 1, 000mm 세포 배양 접시에 M10 PSF의 9밀리리터를 추가하고, 재중단된 세포 용액의 1밀리리터를 전달한다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 20%의 합류로 자리한 이 요리는 48시간 만에 100%에 도달할 것입니다.접시를 위상 대비 현미경 아래에 놓아 관찰합니다. 100% 세포 합류 배양 접시의 1/10을 가져 가라. 미디어를 흡인하고 PBS의 10 밀리리터로 부드럽게 세포를 씻으십시오.그런 다음 트립신-EDTA 및 M10, 원심분리기로 세포를 치료하고 M10 PSF로 이전에 수행된 대로 다시 치료합니다. 한 개의 96웰 플레이트를 실현하려면, 5밀리리터의 재부유셀5밀리리터에서 5.5 밀리리터의 신선한 M10 PSF에 500 마이크로리터를 추가합니다.파이펫 50 마이크로리터는 멀티채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 희석된 부유 세포의 마이크로리터를 삽입한다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5

real-time-vitro-monitoring-odorant-receptor-activation-an-odorant

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오를 문서에서, 우리는 안정적이고 제어 형상과 odorant의 그라디언트의 건설을 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 우리는 간단히 다음과 그라디언트가 후각 결함 (전체 및 부분 후각 상실증)의 화면으로 사용할 수있는 방법을 설명하고 chemotaxis 행동보다 미묘한 기능을 연구하기 위해 서요.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

이 문서는 생쥐의 후각 망울의 표면에지도 냄새 evoked 활동에 고유 광 신호와 flavoproteins autofluorescence 신호 이미징의 프로토콜을 제공합니다.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

이 동영상은 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 바이오센서 및 발광 검출을 사용하여 형질 주입된 세포에서 냄새 수용체 활성화를 측정하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 후각 뉴런의 수용체-리간드 상호 작용 및 신호 경로를 연구하는 데 적용됩니다.

Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay를 사용한 Odorant Receptor Activation 측정

출처: de March, C. A. et. al., 증기 단계에서 냄새 물질에 의한 냄새 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 발광 측정을 사용하여 재조합 포유류 세포에서 냄새 수용체의 실시간 활성화를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 냄새 물질 결합은 G-단백질 활성화 및 cAMP 생산을 유발하여 기질 결합 시 발광을 방출하는 글로센서 단백질을 활성화하여 수용체 반응의 정량적 측정을 제공합니다.

재조합 세포에서 Odorant Receptor 활성화에 대한 실시간 모니터링

수직, T-미로 olfactometer는 절지 동물의 행동 반응을 시금에 설명되어 있습니다. olfactometer은 두 잠재적 인 냄새 필드에 대상이 때 실험은 실험 대상으로 수행 선택권을 측정 할 수 있습니다. 모두 인력과 odorants의 반발이 장치와 함께 측정 할 수 있습니다.

Odorants에 Arthropod 응답을 수직 T-미로 초이스 분석

후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다.

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

학습하세요 후각 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링 방법을 증기상 자극을 사용하여. 이 기술은 생리학적으로 관련성 높은 환경에서 후각 인지의 역학을 연구하고 후각 수용체 기반 바이오센서 개발을 가능하게 합니다.

실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링

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