Name: 비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 학습하세요 비활성 X 염색체에 Mecp2 약리학적 재활성화를 위한 비랜덤 마우스 모델 생성 방법을. 이 기법은 Rett 증후군 등 X 연관 유전 질환 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 시 약을 제공 하기 위한 안토니오 Bedalov 감사 합니다; 냉동 절편에 대 한 버지니아 조직 조직학 코어 대학; 유 세포 분석을 위한 버지니아 대학교 유 세포 분석기 코어; 크리스천 블루와 샐로 니 싱은 유전형 분석에 대 한 기술 지원을 제공 합니다. 이 작품은 Z.Z.에 더블 후 연구 보조금에 의해 지원 되었다, 및 S.B.에 대학 버지니아 테크 종자 펀드 상 및 Hartwell 재단 개별 생물 의학 연구 상에서 파일럿 프로젝트 프로그램 상 수상

마우스와 관련 된 작업 버지니아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (IACUC; #4112).
1. Mecp2 에 유전으로 표시 된 비 랜덤 Xci 마우스 모델 생성
참고: 연구에 사용 되는 마우스 균 주는 다음과 같이 하였다: Mecp2-gfp/Mecp2-gfp (Mecp2 tm는 새, 물자의 테이블) 및 xist/δ xist (B6 > <;를 제공 합니다. 안토니오 베다로 브, 프레드 허 친 슨 암 센터, 시애틀). 각각의 균 주 들 중에서 사육 전략은 각각의 균 주에 대 한 마우스 콜로 니를 확장 하도록 설계 되었다.
<ol><li>표 1에 열거 된 유전자 특이 적 프라이 머를 사용 하 여 사육 후 얻어진 모든 생쥐 균 주와 각각의 양성자에 대 한 PCR 유전형 분석을 수행 한다.</li>
</ol>2. 생성 하는 마우스 사육 전략을 설계 합니다. Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp
<ol><li>Mecp2-Gfp/Y 수 컷과 XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 여성을 함께 하우징 하 여 번 식 쌍을 설정 합니다 (그림 1a). 이상적으로, 실행 가능 하 고 비옥한 쥐를 사용 하 여 한 번에 적어도 5 번 사육 쌍을 설정 합니다. 임신 한 여성이 출산 후, 그녀는 남성과 그녀의 첫 번째 쓰레기를 인상 할 수 있습니다. 참고: 때문에 아버지의 xist 녹아웃 손상 된 xci, 복용량 보상, 그리고 분화 경로17, 사육에서 xistδ-Mecp2/Y 마우스의 사용은 필요한 유전자 형으로 여성 새끼를 생산 하는 데 실패 합니다.</li>
	<li>후 산 후 일 21 (P21)에서 쓰레기를 본 후에는 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 여성 새끼는 PCR 기반 유전형 분석 법을 사용 하 여 식별 하 고 태그를 지정 합니다 (그림 1b). 참고: 그룹 당 필요한 동물의 수 측면에서, 아래에 보고 된 결과를 위해, 5 번의 사육 쌍은 약 10 여성 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스를 생성 하는 설정 되었다.
</li>
	<li>모든 제안 된 실험에 대 한 여성 마우스 모델을 사용 합니다. 참고: 섹스는 XCI 연구에 대 한 중요 한 생물 학적 변수 이며, 남성 모델은 랜덤 XCI의 혼동 효과를 고려 하지 않습니다.</li>
	<li>동물 연구를 통해 일관 되 고 동물 연령의 모든 효과를 배제 하기 위해, 5-8 주 령 여성 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 쥐의 모든 실험을 수행 한다.</li>
</ol>3. 분리 여성 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 배아 섬유 아 세포 (mefs)
<ol><li>Mecp2-Gfp/Y 수 컷과 Xistδ-Mecp2/Xist-Mecp2 여성 사이의 시간 결합을 설정 합니다. 임신 가능성을 높이기 위해 최소 3 개의 결합 케이지를 설정 하십시오.</li>
	<li>짝짓기 후 아침에 질 플러그를 확인 한 후, 여성을 분리 하 고이 날은 배아 날 0.5 (E 0.5)로 간주 됩니다. 장래 임산부의 체중 증가를 모니터링 하 고 생쥐의 복 부를 육안으로 검사 하 여 임신을 확인 합니다. E 14.5-15.5에서 경 추 탈 구를 통해 임신 한 여성 마우스를 안락사 시킵니다.</li>
	<li>층 류 후드 아래에 70% 에탄올로 임산부의 복 부를 닦아 냅니다. 무 균가 위를 사용 하 여 복 강을 분해 하 고 배아를 포함 하는 자 궁 뿔을 제거 합니다. 핀셋을 사용 하 여 남은 복 부 조직을 절단 하는 동안 배아를 부드럽게 꺼내 냅니다 (6-12 배아는 일반적으로 예상 됨).</li>
	<li>배아를 포함 하는 자 궁 뿔을 10mm 조직 배양 접시에 넣습니다. 무 균가 위 및 집게를 사용 하 여 배아를 운반 하는 개별 낭을 분리 하기 위해 자 궁 뿔을 따라 절 개 하십시오. 신중 하 게, 나머지 배아를 포함 하는 자 궁 뿔을 얼음 위에 30ml의 멸 균 된 하 Ks의 균형잡힌 염 용액 (HBSS)에 넣습니다.</li>
	<li>부드럽게 자른 낭을 열고 무 균가 위 및 집게를 사용 하 여 배아를 분리 합니다. 탯 줄을 절단 하 여 태 반을 제거 하십시오.</li>
	<li>배아를 욕 한다. 참고: 배아 조직의 나머지 부분은 더 처리 될 것 이지만, 배아 머리의 조직은 유전형 분석을 위한 DNA를 분리 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>무 균가 위 및 집게를 사용 하 여 배아의 중간 선을 절단 하 여 복 부를 엽 니 다. 심장, 간, 폐와 같은 내장 기관을 제거 하십시오.</li>
	<li>남은 배아 조직을 멸 균 60 mm 조직 배양 플레이트로 옮겨가 위나 면도날을 사용 하 여 작은 조각으로 자릅니다. 세포 덩어리를 열기 위해 트립 신-EDTA 3 mL를 추가 하십시오 (0.05%). 15 분 동안 37 ° c에서 배양 한다.</li>
	<li>10%의 태아 소 혈 청 (FBS)과 10 µ G/ml 페니실린/streptomycin (펜/스 트리 트)를 첨가 하 여 트립 신-EDTA를 중화 하 고 반복적 피 펫 팅 (약 DMEM 배)으로 조직을 해리 합니다.</li>
	<li>300 x g 에서 세포를 5 분간 스핀 다운 하 고 DMEM 4ml의 셀 펠 렛을 10% FBS 및 10 µ의 펜/스 트 렙으로 다시 정지 시킵니다. 60 mm 배양 접시에 세포를 플레이트 하 고, 5% CO2의 존재 하에 37 ° c에서 세포를배양 한다.</li>
	<li>각 배아에 대해 3.5-3.10 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>배양 된 MEFs는 적어도 3-4 일 동안 3.11 단계에서 얻어진 다. 참고: 이 단계에서, MEFs는 또한 미래의 실험을 위해 냉동 보존 될 수 있다.</li>
	<li>각 배아의 성별 및 유전자 형을 확인 하기 위해, 표 1에 열거 된 프라이 머 및 PCR 조건을 이용 하 여 배아의 머리 로부터 분리 된 DNA를 이용 하 여 유전형 분석 pcr을 수행 한다.</li>
</ol>4. Xistδ의 뇌에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현의 부족을 확인 하십시오 : Mecp2/Xist: Mecp2 활성 세포 선별 기반 분석을 사용 하는-GFP 생쥐
<ol><li>가 위를 사용 하 여 뇌 반구의 나머지 부분에서 대뇌 피 질을 분리 하 고 250 mM 자당, 25mm 염화 칼륨 (KCl), 5mm 염화 마그네슘 (MgCl2), 10mm 트리 스 cl의 얼음-차가운 핵 분리 미디어 (NIM) 버퍼의 1 mL에 위치, 2% 파라 포름알데히드 (PFA) 및 0.1% 비 이온 성 계면 활성 제 (재료 표)로 보충 됩니다.</li>
	<li>얼음-차가운 유리 균질 화기를 사용 하 여 균질 화.</li>
	<li>600 x g, 4°c에서 5 분간 균질 화 된 조직을 스핀 다운 한다.</li>
	<li>NIM 용액에서 상 등 액 및 소생 펠 렛을 25%의 iodi황색 올의 1Ml에서 제거 한다.</li>
	<li>4 mL ultracentrifuge 튜브에 NIM 용액에 29%의로 디 산 졸 1 mL을 넣고 (샘플이 준비 될 때까지 얼음 위에 보관) 시료 1Ml를 조심 스럽게 레이어 합니다 (25%로 디 산 놀).</li>
	<li>Ultracentrifuge에서 10 분 동안 9000 x g, 4°c에서 원심 분리기.</li>
	<li>500 μ l의 형광 활성 세포 선별 (FACS) 완충 액 (인산 완충 식 염 수가 1Mmedta, 0.05% 나트륨 아 지 드 및 2% 소 혈 청 알 부 민 [BSA])로 보충 된 상 청 및 소생 펠 렛을 흡 인 한다. 참고: 샘플은 4°c 또는 최대 1 주일에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>상 온에서 5 분 동안 7-아미노 액티 50 D의 5 μ l를 첨가 하 여 DNA 얼룩을 냅니다.</li>
	<li>유 세포 분석을 사용 하 여 7-AAD 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 신호에 대 한 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>5. Xistδ의 타당성 결정: Mecp2/Xist: Xi 재 활성화를 위한 Mecp2-Gfp 마우스 모형
<ol><li>종자 1 x 105cell/mL 여성 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2 에서 3.12 단계에서 얻어진 Mecp2/Mecp2-Gfp 및 Xist-Mecp2/Y mefs를 10% DMEM 및 10 FBS 펜/스 트 렙과 함께 µ에서 37 ° c에서 5% CO2의 존재. 참고: Mecp2/Mecp2-Gfp 및 Xist-Mecp2/Y mefs는 실험에서 양성 및 음성 대조 군으로 사용 된다.</li>
	<li>24 시간 후에 세포에 신선한 배지를 추가 하십시오. Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp Mefs는 xcifs 억제제 (예를 들어, 0.5 μ m LDN193189 및 2.5 μ m GSK650394) 또는 단독 차량으로 보충 된 배지를 추가 합니다. 2 일 마다 신선한 억제제 또는 차량을 단독으로 보충 하는 배지를 교체 하십시오. Mecp2/Mecp2 및 Xist-Mecp2/Y mefs의 경우 2 일에 한 번씩 신선한 배지를 추가 하십시오.</li>
	<li>
1 주 후에 억제제 치료를 하 고, MEFs를 RNA 분리 (6 웰 플레이트) 또는 면역 형광 (챔버 슬라이드)을 위해 고정 합니다. Mecp2/Mecp2 배아 로부터 분리 된 mefs를 각각 네거티브 컨트롤로 서 양성 및 Xist-Mecp2/Y 배아로 사용 한다.
	<ol>
<li>RNA 분리의 경우, 이세티 기반 RNA 추출 시 약으로 총 RNA를 분리 하 고 역 역전사를 사용 하 여 역 변환 합니다. 앞서 설명한 바와 같이 Mecp2-WT 및 Mecp2-gfp를 사용 하 고 표 1에 열거 된 프라이 머를 이용 하 여 정량적 역 역전사 (qrt-pcr)에의 한 Mecp2 발현을 측정 하였다.</li>
		<li>면역 형광 염색을 위해, 항-GFP 일차 항 체 (1:100)를 가진 얼룩 mefs는,16이전에 기술 한 바와 같이. 이전에 설명 된 바와 같이 약물 처리 된 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-gfp mefs에서 정량적 면역 형광 화에의해 GFP 강도를 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Xistδ의 뇌에서 약리학 적 Xi 재 활성화를 입증 하십시오: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형
<ol><li>약물 및 차량 제어를 준비 합니다.
	<ol>
<li>뇌 주사를 위해 0.9% 염화 나트륨, 0.5% 메 틸 셀 룰로 오 스, 4.5% 디 메 틸 설 폭 사이드의 신선한 멸 균 용액을 준비 합니다.</li>
		<li>1.5 mM LDN193189 (ACVR1의 소 분자 억제제) 및 1.6 mM GSK650394 (SGK1의 소 분자 저 해제, PDPK1의 다운스트림 이펙터)를 포함 한 화학 억제제를 제조 하 여 차량에 재 부유 (0.9% 염화 나트륨, 0.5% 메 틸 셀 룰로 오 스, 4.5% DMSO) 또는 차량 혼자. 화학 억제제 또는 주입 된 차량의 총 부피는 동물 당 투여 량 당 10 µ L 이다.</li>
	</ol></li>
	<li>뇌 주사를 위한 동물을 준비 합니다.
	<ol>
<li>벤치와가 열 패드를 소독 제 (10% 차 아 염소 산 나트륨 용액)로 닦아 수술 부위를 준비 합니다.</li>
		<li>4 주 오래 된 마우스를 각각 140 mg/kg 및 10mg/kg의 용량으로 케 타 민/자일 린 혼합물의 복 강 내 주입으로 마 취 시켰다. 마 취의 수준을 결정 하기 위해 페달 철수 반사를 사용 합니다.</li>
		<li>각 막 건조를 방지 하기 위해 마 취의 유도 다음 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.</li>
		<li>목에서 마우스의 머리 꼭대기까지 털을 깎아 냅니다.</li>
		<li>주 둥이 제한 수단은의 물린 막대에 마우스의 절 개를 후 킹 하 고 마우스의 머리가 레벨 평면에 있는지 확인 하면서 코 클램프를 조여 서 정위 플랫폼에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>필요에 따라 귀 바의 높이를 조정 하 여 외이도의 꼬리 부분에 도달 하 고 마우스의 머리가 레벨 평면에 있고 손가락 터치에 고정 되도록 합니다.</li>
		<li>포 비 돈-요오드와 70% 에탄올과 같은 국 소 방부 제를 번갈아 사용 하 여 마우스의 머리를 소독 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마약을 관리 하십시오.
	<ol>
<li>무 균 메스를 사용 하 여, 두 피 중반에 0.75 센티미터의 수평 절 개를 하십시오.</li>
		<li>0.45 mm 버를 사용 하 여 오른쪽 및 왼쪽 대뇌 피 질 반구 위의 두 개의 대칭 구멍을 뚫습니다 (시상 봉합 사에서 2mm와 양 정 뼈의 중심에서 약 2mm).</li>
		<li>10 μ l 주사기를 정위 플랫폼에 단단히 부착 합니다.</li>
		<li>화학 억제제의 용액을 혼합 하 고 주사기에 용액 10 μ l를 그리십시오. 주사기의 기포를 피하십시오.</li>
		<li>바늘을 두개골에 수직 (90 °)으로 유지 하는 버 구멍에 주사기 바늘을 전진 시킵니다. 바늘이 두개골을 통과 할 때, 정위 디지털 디스플레이에 좌표를 0 2.5 mm의 깊이에 도달 할 때까지 바늘의 끝을 전진.</li>
		<li>2mm에 대 한 깊이 바늘 0.5 mm을 철회.</li>
		<li>용액 10 μ l를 서서히 주입 한다 (~ 1 분). 주사가 완료 된 후, 뇌의 바늘을 1 분 동안 두고 바늘을 철회 하십시오.</li>
		<li>두 번째 반구에 대 한 주입을 반복 합니다 (차량 전용 제어).</li>
		<li>봉합 사 또는 "피부 접착제"를 사용 하 여 마우스의 피부를 닫습니다 (상처가 > 0.5 cm 인 경우 봉합과 "피부 접착제"를 사용 해야 합니다).</li>
		<li>귀 바를 느슨하게 하 고 정위 장치에서 마우스를 제거 합니다.</li>
		<li>진통제 (부 프레 노르 핀 SR 0.5 밀리 그램/kg IP)를 투여 하 고 동물이 의식이 회복 될 때까지 37 ° c로 설정 된가 열 패드 위에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>마우스가 경고 하 고 반응 하면, 원래 케이지에 동물을 다시 전송 합니다.</li>
		<li>20 일 동안 2 일 마다 절차를 반복 합니다. 후속 주사에는 영역의 반복 드릴링이 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스 뇌를 분리 합니다.
	<ol>
<li>투여 식이 완료 되 면, CO2 챔버에서 마우스를 안락사 시켰다.</li>
		<li>바늘을 사용 하 여 표면에 마우스를 고정 시킵니다.</li>
		<li>가 위 및 집게를 사용 하 여 늑 골 케이지 바로 아래에 외피와 복 벽을 통해 측면 절 개를 하십시오. 간을 다이어 프 램에서 조심 스럽게 분리 합니다.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 다이어 프 램을 자르고 늑 골 케이지의 전체 길이를 따라 절단 하 여 흉 막 강을 노출 시킵니다.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 좌 심 실의 후부 끝을 절 개 하십시오.</li>
		<li>즉시, ~ 약 15 mL의 PBS로 오른쪽 심장 챔버를 주입 시작 ~ 2 분. 간 색은 적색에서 옅은 분홍색으로 변화 하 여 양호한 관류를 나타냅니다.</li>
		<li>마우스 심장의 우측 챔버를 PBS에 4%의 파라 포 르 말린 ~ 약 10 mL를 넣고 2 분 동안 주입 합니다.</li>
		<li>마우스를 욕 하 고가 위를 사용 하 여 두개골을 노출 하는 두 피의 중간 선 절 개를 만듭니다.</li>
		<li>가 위 한쪽 끝을 포 아 멘 매그넘에 넣고 두개골을 눈 쪽으로 옆으로 자릅니다. 반대쪽을 반복 합니다. 뇌의 부상을 방지 하기 위해 가능한 피상적으로가 위 끝을 유지 하려고 합니다.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 눈과 마우스의 코 위로 영역을 자릅니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 뇌 반구에서 두개골 뼈를 부드럽게 벗 겨 냅니다.</li>
		<li>주걱으로 뇌를 들어 올리고,가 위를 사용 하 여 두개골에 고정 하는 두개골 신경 섬유를 조심 스럽게 분해 합니다.</li>
		<li>뇌를 플라스틱 접시에 놓고 소 뇌와 후 각 전구를 자르고 4% PFA 인 PBS로 채워진 15 mL 튜브에 뇌를 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>크라이 오-섹션 마우스 브레인.
	<ol>
<li>4%의 파라 포 름 알 데히드를 4°c에서 하룻밤에 4%의 뇌에 고정 시킵니다.</li>
		<li>각각 5 분 동안 4 ° c 이상에서 PBS로 뇌를 헹 구 십시오.</li>
		<li>티슈를 냉동 보존 하기 위한 일회용 몰드에 라벨을 부착 합니다.</li>
		<li>가 위 및 집게를 사용 하 여 뇌의 전면을 잘라 (사출 사이트에서 ~ 5mm 섹션을 만들기 시작).</li>
		<li>뇌의 앞면을 아래로 향하게 하 여 두뇌를 동결 금형으로 옮겨 코로나 섹션을 얻습니다. 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT)에서 뇌가 포함 된 몰드를 서브 머지 한다.</li>
		<li>액체 질소를 10mm 플라스틱 페 트리 접시에 붓고 cryo 몰드에 뇌를 질소로 넣습니다. 참고: 6.5.5 단계에서 설명한 바와 같이 조직의 방향을 조정 하 여 뇌의 절편을 안내 하는 것이 중요 하다.</li>
		<li>OCT가 흰색으로 고정 되 면 냉동 된 뇌를-80 ° c 냉동 고에 넣어 보관 하십시오.</li>
		<li>동결 상태 및 동결 부 (5-6 μ m 두께)로 절편 하기 전에 적어도 30 분 동안 뇌를-20°c로 평형 하 여 슬라이드 당 2-3 섹션을 장착 합니다. 슬라이드는 나중에 사용 하기 위해-80 ° c에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>면역 형광 기반 접근법을 사용 하 여 Xi 재 활성화를 결정 합니다.
	<ol>
<li>염색 절차를 시작 하기 전에, 4 ° c에서 밤새 뇌 부분을 건조.</li>
		<li>항 원 검색 용액 (0.1 M 구 연산, 0.1 M 트리 스 베이스, ph=6.0)에 슬라이드를 담가 5 분간의 100 온도 블록.</li>
		<li>실 온에서 5 분간 각각 1x PBS로 슬라이드를 4 배로 씻으십시오.</li>
		<li>블로킹 용액에 슬라이드를 담 그 십시오 (<s></s>0.1 M NH 4CL/PBS/0.2% 젤라틴/0.05% 비 이온 성 계면 활성 제) 실 온에서 20 분 동안.</li>
		<li>3 분 동안 실 온에서 세척 완충 액 (PBS/0.2% 젤라틴)을 사용 하 여 슬라이드 3x을 세척 하십시오.</li>
		<li>항-GFP-AlexaFluor647 (1:100) 및 항 MAP2을 가진 항 체를 배양 배지 (PBS/0.2% 젤라틴/1% BSA)로 염색 하 고 4°c에서 밤새 배양 한다.</li>
		<li>1 차 항 체를 수집 하십시오 (재사용할 수 있음). 실 온에서 총 30 분간 세척 완충 제를 사용 하 여 슬라이드 4x를 세척 하십시오.</li>
		<li>염소 항-닭고기 형광 추적용 (FITC)로 라벨링 된 2 차 항 체 (1:1000)를 배양 하 고 어두운 곳에서 실 온에서 1-2 시간 인큐베이션 한다.</li>
		<li>실 온에서 총 30 분간 세척 완충 제를 사용 하 여 슬라이드 4x를 세척 하십시오.</li>
		<li>22mm x 50 mm 커버 슬립에 4 ', 6DIDINO-2-페니 린 돌을 장착 매 질 한 방울을 놓은 다음 커버 슬립을 슬라이드에 뒤집어 모든 티슈 섹션을 덮으 십시오.</li>
		<li>이미지를 현미경으로 조정 하 고 명암 및 밝기에 맞게 이미지를 조절 합니다. 이미지를 캡처하고 약물 처리 및 차량 처리 모두에 대 한 GFP 양성 세포의 수를 정량화 : Mecp2/Xist: Mecp2-GFP 마우스 뇌 반구.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nucleic+Acid+Research+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li>
<li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin%3A+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+Development%22%5BJournal%5D)">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li>
<li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li>
<li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist+regulation+and+function+explored%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li>
<li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li>
<li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li>
<li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Curren+Biology%22%5BJournal%5D)">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383(2016).</li>
<li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li>
<li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+%28CIZ1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li>
<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Development%22%5BJournal%5D)">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li>
<li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome%3A+random+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li>
<li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li>
<li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Natlional+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li>
<li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li>
<li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li>
<li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이전에, 포유동물 여성 세포에서 Xi-연결 된 유전자의 침묵을 위해 선택적으로 요구 되는 XCIFs는12를 동정 하였다. 우리는 마우스 섬유 아 세포 주, 마우스 대뇌 피 질의 뉴런 및 인간 섬유 모 세포에서 Xi-연결 된 Mecp2 을 효율적으로 재 활성화 하는 PDPK1의 ACVR1 및 다운스트림 이펙터와 같은 xcifs를 대상으로 하는 강력한 소 분자 억제제를 추가로 최적화 했습니다. RTT 환자에서 파생 된 라인입니다. 이러한 결과는 Xi 재 활성화가 X-연결 된 질병 환자의 유전자 결핍을 구출 하는 그럴듯한 치료 적 접근법 임을 시사 한다. 그러나 생체 내 실현 가능성은 결정 되어야 한다. 최근에, XCIF 억제제는 Mecp2 의 Xi-연결 된 생체 내를 재 활성화 시키는 것으로 나타났다,이는 비 랜덤 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모델을 생성 하였다.
<p class="jove_content"...

X 염색체 불 활성화 (XCI)는 x 염색체의 1 카피를 여성에 게 침묵 시켜 서 X-연결 된 유전자 발현을 균형 조정하는 투약 보상의 과정 이다. 그 결과, 비활성 X 염색체 (Xi)는 히스톤 H3-리 신 27 trimethylation (H3K27me3) 및 히스톤 H2A 유비퀴틴 화와 같은 DNA 메 틸 화 및 억제 히스톤을 포함 하는 이종 염색 질의 특징을 축적 한다 (H2Aub) 2. x 염색체 침묵의 마스터 조절기는 x 염색체의 카운팅 및 쌍을 제어 하는 약 100500kb의 x-불 활성화 센터 (Xic) 영역, 비활성화를 위한 x 염색체의 무작위 선택 및 개시 및 X 염색체를 따라 침묵의 확산3. X 불 활성화의 과정은 x 염색체 전체의 침묵을 매개 하 고 3 차원 구조를 리 모델링 하 여 ci 에 Xi를 코팅 하는 비활성 특이 적 전사체 (xist) x에 의해개시 된다. 최근에, 몇몇 프로테오 믹 및 유전 성 스크리닝은 xci,예컨대 xist 상호작용 단백질5,6,8,9 등의 추가의 조절기를 동정 하였다 , 10 , 11 , 12. 예를 들어, 이전에는 편견 된 게놈 전체의 RNA 간섭 화면을 이용 하 여 13 개 트랜스-작용 Xci 팩터 (xci)12를 확인 하였다. 기계적으로 XCIFs는 Xist 표현식을 조절 하므로 xcifs 기능을 방해 하면 결함이 있는 xcifs12가 발생 합니다. 이 분야의 최근 진보는 XCI를 시작 하 고 유지 하는 데 필요한 분자 기계에 대 한 중요 한 통찰을 제공 했습니다.
Xci 레 귤 레이 터의 식별 및이의 메커니즘을 이해 하는 것은 rett 일으키는 증후군 (RTT)13과 같은 X 연결 인간 질병과 직접적으로 관련이 있습니다. RTT는 주로 여자15에 영향을 미치는 X-결합 메 틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2)에서의 이성애 변이에 의해 발생 하는 드문 신경 발달 장애입니다. MECP2 는 X 염색체에 위치 하기 때문에, RTT 소녀는 MECP2 변이 MECP2를 발현 하는 야생 형 및 ~ 50%를 발현 하는 세포 ~ 50%의 결핍에 의존 하 고 있다. 특히, RTT 돌연변이 세포는 시 Mecp2 의 휴면 하지만 야생 형 카피를 항구에 정박 하 여, 활성화 된 경우 잠재적으로 질병의 증상을 완화 시킬 수 있는 기능적 유전자의 공급원을 제공 합니다. RTT 외에도 Xi의 재 활성화는 DDX3X 증후군과 같은 잠재적인 치료 접근법을 나타내는 여러 가지 다른 X 연결 인간 질환이 있습니다.
XCIFs의 억제, 3 phosphoinositide 의존적인 단백질 키나 제 PDPK1) 및 액티 빈 수용 체 타입 1(ACVR1), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 소 분자 억제제에 의해, Xi-연결 된 유전자를 재 활성화 시킨다12. Xi-연결 된 유전자의 약리학 적 재 활성화는 RTT 환자 (12) 로부터 유래 된 마우스 섬유 아 세포 주, 성체 마우스 피 질 뉴런, 마우스 배아 섬유 모 세포 및 섬유 모 세포 주를 포함 하는 다양 한 전 생체 모델에서 관찰 된다. 그러나, Xi에 연결 된 유전자의 약리학 적 재 활성화 여부는 생체 내에서 입증 될 수 있다. 한 가지 제한 요인은 재 활성화 된 Xi에서 유전자의 발현을 정확 하 게 측정 하는 효과적인 동물 모델의 부족 이다. 이 목표를 향하여, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형은 모계 X 염색체16에 있는 xist 에 있는 이성애에 있는 다 수 적 삭제 때문에 모든 세포에서 Xi에 유전자로 표지 된 Mecp2 를 운반 하는 생성 되었습니다. 이 모형을 사용 하 여, Xi에서 Mecp2 의 표현은 살아있는 쥐의 두뇌에 있는 xcifs 억제제를 가진 처리 다음에 정량화 되었습니다. 여기서, 상기 Xistδ의 생성은: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모델과 면역 형광 기반 분석 법을 사용 하 여 피 질 뉴런에서의 양자화 된 Xi 재 활성화 방법을 설명 한다.

<table><tbody><tr><td>MICE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mecp2tm3.1Bird</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#014610</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-Xist (tm5Sado)</td> <td>제공 안토니오 베달로프, 프레드 허친슨 암 센터, 시애틀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm 커버슬립</td><td>FISHERfinest (Fisher Scientific)</td><td>125488</td><td></td></tr><tr><td>32% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>50ml 주사기</td><td>Medline Industries</td><td>NPMJD50LZ</td><td></td></tr><tr><td>60mm 배양 접시</td><td>CellStar</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD </td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄(NH4Cl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A661-3</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP-AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-31852</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Aves Labs</td><td>MAP</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Promega</td><td>R396D</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 SR</td><td>Zoopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구연산 </td><td>Sigma</td><td>C-1857</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>VWR Life Science</td><td>89510-198</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-닭 FITC 표지 2차 항체 </td><td>Aves Labs</td><td>F-1005</td><td></td></tr><tr><td>GSK650394</td><td>ApexBio</td><td>B1051</td><td></td></tr><tr><td>hamilton 10&mu; l 주사기 </td><td>Hamilton Sigma-Aldrich</td><td>28615-U</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Ketaset</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td></td></tr><tr><td>Large blunt/blunt curved scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11802</td><td></td></tr><tr><td>lodixanol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>1343517</tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M35-212</td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>시그마</td><td>M0262-100G</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어(DAPI </td><td>Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>니들 팁, 26 GA x 1.25"</td><td>PrecisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고 </td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>93468</td><td></td></tr><tr><td>최적 절삭 온도(O.C.T.) </td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 혼합물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep)</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 pH 7.4(PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-103-CM</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>얕은 유리 또는 플라스틱 트레이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피부 접착제 / 조직 접착제</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>아 지드 화 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>표준 지혈 겸자</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>표준 핀셋</td><td>미세 과학 도구</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 아이리스 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>트리스 기반</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA </td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDC: 59399-111-50</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver 라이브 셀 현미경 </td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>0.45mm 버</td><td>IDEAL MicroDrill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScalibur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 균질화기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Leica 3050S 연구용 저온 유지 장치 정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>위 플랫폼 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>타이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Optima L-100 XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조 (37 &ordm; C)</td> <td>피셔 사이언티픽 Isotemp 2239</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비활성 x 염색체에 대 한 mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

X 염색체 불 활성화 (XCI)는 남녀 간의 유전자 투약 균형을 달성 하기 위해 암컷에서 1 개의 X 염색체의 랜덤 침묵 이다. 결과적으로, 모든 암컷은 X-연결 유전자 발현에 대 한 이종 접합 이다. XCI의 주요 규제 기관 중 하나는 XCI의 시작과 유지 보수에 필수적인 Xist입니다. 이전 연구는 큰 규모의 기능 손실 유전 화면을 사용 하 여 13 개의 트랜스 행 X 염색체 불 활성화 인자 (XCIFs)를 확인 했습니다. ACVR1 및 PDPK1와 같은 XCIFs의 억제는 짧은 헤어핀 RNA 또는 소 분자 억제제를 사용 하 여 배양 된 세포에서 X 염색체 연결 유전자를 재 활성화 합니다. 그러나 생체 내에서 비활성 X 염색체를 재 활성화 시키는 타당성 및 내성이 결정 될 수 있다. 이 목표를 향하여, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형은 1 개의 X 염색체에 xist 의 삭제 때문에 비 랜덤 xci로 생성 되었습니다. 이 모델을 사용 하 여 비활성 X 재 활성화의 정도는 마우스 뇌에서 XCIF 억제제로 처리 된 다음에 양자화 되었다. 최근 발표 된 결과에 따르면, 처음으로 XCIFs의 약리학 적 저해는 살아있는 마우스 뇌의 대뇌 피 질의 뉴런에서의 비활성 X 염색체 로부터 Mecp2 을 재 활성화 시킨다.

Xistδ의 타당성을 입증 하기 위해 : Mecp2/Xist: xi 재 활성화 연구를 위한 Mecp2 마우스 모델, xcif 억제제-xi-연결 된 Mecp2-gfp 의 매개 된 재 활성화는 마우스 배아 섬유 아 세포 (mefs)에서 시험 되었다. 여성 MEFs는 제 3 항 (도 1a)에 기재 된 바와 같은 15.5 Xistδ: Mecp2/xist 에서 분리 되었다. 여성 Xistδ의 유전형: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mefs는 앞서 설명한 바와 같이 유전형 분석 PCR에 의해 확인 되었다 (도 1b), 및 FACS 계 검정 법 (도 1c). MEFs는 7 일 동안 DMSO 또는 2 개의 약물 LDN193189 및 GSK650394 (각각 ...

여기서, 우리는 비-랜덤 X 염색체 불 활성화와 함께 실행 가능한 여성 뮤 린 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 하 고, 즉 임산부-상속 된 X 염색체는 세포의 100%에서 불활성 이다. 우리는 또한 생체 내에서 비활성 X 염색체의 약리학 적 재 활성화의 타당성, 내성 및 안전성을 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

이 프로토콜은 살아있는 마우스의 뇌에서 비활성 X 연결 Mecp2 염색체의 재활성화를 테스트하고 정량화하기 위한 비무작위 마우스 모델을 생성하는 데 사용할 수 있다. 이 모델은 DDX3X 증후군과 같은 다른 X 연결 질병 모델에서 Xi 재활성화를 연구하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 나는 산치타 바트나가르의 실험실에서 게시물 문서이고 나는 Zeming Zheng와 절차를 시연 할 것입니다.주미 제지의 바이트 바에 매여 선명절과 스테레오전술 플랫폼에 마취 마우스를 배치하여 시작합니다. 마우스의 머리를 레벨 평면에 유지하면서 코 클램프를 조입니다. 이어바의 높이를 조정하여 외이도의 소들 부분에 도달하여 머리를 고정 상태로 유지합니다.그런 다음 국소 살균 및 70 %에탄올의 번갈아 닦아 머리를 소독합니다. 마우스가 준비되면 멸균 메스를 사용하여 중간 두피에 0.75센티미터의 수평 절개를 합니다. 0.45 밀리미터 버를 사용하여 좌측 피질 반구 의 두 개의 대칭 구멍을 주교하여 처진 봉합사에서 2밀리미터, 정수리 뼈의 대략적인 중간에 있는 람도이드 봉합사를 드릴수 있습니다.10 마이크로리터 주사기를 스테레오테전술 플랫폼에 단단히 부착하고 새로 준비된 화학 억제제 10마이크로리터를 주사기에 적재합니다. 바늘을 두개골에 수직으로 유지하면서 첫 번째 버 구멍으로 바늘을 전진시. 바늘이 두개골을 통과할 때, 스테레오전술 디지털 디스플레이의 좌표를 제로아웃하고 2.5밀리미터깊이에 도달할 때까지 바늘 끝을 전진시다.바늘을 0.5 밀리미터에서 2밀리미터 깊이로 인출하고 1분 동안 용액의 전체 10 마이크로리터 부피를 천천히 주입한다. 모든 억제제가 전달된 후 바늘을 철회하기 전에 뇌에 바늘을 1분 더 남겨 둡니다. 차량을 제어로 사용하여 두 번째 버 구멍에 주입을 반복하고 절개 시 피부를 닫습니다.그런 다음 전체 복구까지 모니터링과 37섭씨 가열 패드에 스테레오전술 장치에서 마우스를 전송합니다. 투여량 식이요법의 끝에서, 해부 패드에 마우스를 고정. 가위와 집게를 사용하여 흉곽 바로 아래 의 정립과 복벽을 통해 측면 절개를합니다.간을 다이어프램에서 조심스럽게 분리하고 흉막의 전체 길이를 따라 다이어프램을 잘라 흉막 구멍을 노출시합니다. 가위를 사용하여 왼쪽 심실의 후부 끝에 절개를 하고 즉시 2 분 동안 PBS의 약 15 밀리리터로 오른쪽 심장 챔버를 주입하십시오. 성공적인 관류는 간 색이 빨간색에서 옅은 분홍색으로 변하게 됩니다.모든 PBS가 전달되면 2 분 동안 PBS에서 약 10 밀리리터4 %의 파라 포름알데히드로 심장을 견딜 수 있습니다. 머리를 수확 한 후 가위를 사용하여 두개골을 노출시키기 위해 두피에 중간 선 절개를합니다. 두개골의 측면 절개를 눈으로 만드는 것을 용이하게하기 위해 가위의 한 끝을 포라멘 매그넘에 놓습니다.두개골의 반대편에 유사한 절개를 가능한 한 피상적으로 가위의 끝을 유지하고 눈과 마우스의 코 위에 두개골의 영역을 잘라. 집게를 사용하여 뇌 반구에서 두개골 뼈를 부드럽게 껍질을 벗기고 주걱을 사용하여 뇌를 상승시킵니다. 조심스럽게 두개골에 뇌를 고정하고 플라스틱 접시에 뇌를 배치 두개골 신경 섬유를 해부.그런 다음 소뇌와 후각 전구를 소비합니다. 뇌 조직의 섹션을 얻으려면, 먼저 하룻밤 4 섭씨에서 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 채워진 15 밀리리터 튜브에서 뇌를 수정합니다. 다음 날 아침, 씻는 시간 당 신선한 PBS에서 섭씨 4도에서 5 분 동안 적어도 세 번 뇌 조직을 헹구는다.마지막 세척 후 가위와 집게로 각 반구의 전면을 제거하고 샘플을 라벨이 부착된 냉동 금형 전면에 배치합니다. 각 조직을 최적의 절삭 온도 매체에 담근 후 액체 질소로 샘플을 영하 80도의 플라스틱 페트리 접시에 고정시 섭씨 80도 까지 수납합니다. Xi재활성화를 결정하기 위해 항원 검색 용액에 5~6마이크로미터 뇌 조직 섹션을 100도 의 섭씨 열 블록에서 5분간 담급니다.인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 실온에서 5분간 세척한 후 4분간 세척한 후 슬라이드를 블로킹 용액에 담급십시오. 실온에서 20분 후, 슬라이드를 세척당 신선한 세척 버퍼로 5분간 3회 세척합니다. 하룻밤 사이에 적절한 1 차 항체로 조직 샘플을 얼룩지게합니다.형광 현미경의 슬라이드를 이미지하여 대조와 밝기를 조정하여 약물 및 차량 치료 마우스 뇌 반구모두에 대한 GFP 양성 세포의 수를 정량화할 수 있도록 합니다. 비무작위 X 염색체 불활성화 연구의 타당성을 입증하기 위해, 여성 형질성 마우스 배아 섬유아세포의 유전자형은 PCR 및 유동 세포측정에 의해 확인되었다. PCR에 의해 평가된 바와 같이, GFP 태그메틸렌 CPG 결합 단백질 2유전자 또는 MECP2의 발현은 약물에 의해 재활성화되었지만 차량 치료는 아니고.비무작위 X 염색체 불활성화 마우스 모델 배아 섬유아세포는 또한 약물 후 핵 GFP를 발현하지만 X 염색체 불활성화 인자 억제제가 다시 활성화되지 않은 X 염색체를 보여주는 차량 치료는 마우스 배아 섬유아세포에서 MECP2를 연결했다. 약물 치료는 약물 주입 된 뇌 반구의 세포의 약 30 %에서 불활성화 X 염색체 MECP2-GFP를 다시 활성화하지만 차량 주입 반구에서 재활성화가 감지되지 않습니다. microtubule-관련 단백질 2 개의 양성 뉴런은 또한 불활성화 된 X 염색체 MECP2-GFP 발현을 나타내는 약물 처리 반구에서 양성이다.약물 요법은 생체 내에서 테스트하기 전에 시험관내 투여량과 치료를 최적화하므로 작은 분자 억제제의 표적 및 효능에 의존하게 될 것이다. 비무작위 마우스 모델은 개별적으로 또는 조합하여 다른 약물을 테스트하는 데 활용할 수 있다. 사실, 우리 와 다른 몇 가지 약물 X 염색체 불 활성화 요인을 확인 했습니다.

a-non-random-mouse-model-for-pharmacological-reactivation-mecp2-on

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

이 문서는 GPCR 이종 형성을 요구하는 행동 분석을 테스트 할 마우스 정면 피질로 바이러스 벡터를 주입하는 방법을 설명합니다.

키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

우리 보고 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 반딧불 luciferase murine 셀 라인에서 x 염색체 비활성화의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위한 다음 세대 시퀀싱 기반 프로토콜 및 hygromycin 저항 유전자는 메 틸 CpG 바인딩 단백질 2 (융합 MeCP2) 비활동 성 X 염색체에 유전자입니다.

풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

신경 유도의 측정 neurodegeneration의 마우스 모델을 평가 하는 유용한 도구 이지만 그것은 자주 hindlimbs에 좌 골 신경을 자극에 적용 됩니다. 여기, 복합 근육 활동 전위 (CMAP) vivo에서 상 완 신경 총에 의해 innervated 마우스 forelimb 근육에서 측정 하는 기술을 설명 합니다.

Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)은 내인성 및 외인성 적용 MeCP2 단백질 변이체의 정량적 검출을위한 새로운 접근법으로, 광범위한 작업 범위에 걸쳐 낮은 인트라 및 분석 오류로 높은 정량적, 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 여기서, MeCP2-ECLIA에 대한 프로토콜을 96웰 형식으로 설명한다.

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

설치류 모델은 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련된 핵심 행동을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 기사에서는 생쥐에서 ASD의 핵심 기능을 모델링하기 위한 두 가지 행동 테스트, 즉 반복적인 행동을 평가하는 셀프 그루밍(self-grooming)과 사회적 장애를 문서화하는 3개의 챔버 사회적 상호 작용 테스트(three-chamber social interaction test)에 대해 설명합니다.

생쥐의 자폐증과 유사한 행동을 평가하기 위한 전략

학습하세요 비활성 X 염색체에 Mecp2 약리학적 재활성화를 위한 비랜덤 마우스 모델 생성 방법을. 이 기법은 Rett 증후군 등 X 연관 유전 질환 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

더 많은 동영상 탐색