Name: 조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 배우세요 폐암 세포에서 miR-143과 miR-506의 세포 주기 및 혈관신생 조절 효과를 분석하는 방법을. 세포 전염, RNA 추출, 정량적 실시간 PCR 기법을 활용하여 마이크로RNA의 항암 치료 가능성을 탐구합니다.

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<ol><li>Schafer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veternary+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review.</a> Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).</li>
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<li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval+of+Palbociclib+in+Combination+with+Fulvestrant+for+the+Treatment+of+Hormone+Receptor-Positive%2C+HER2-Negative+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer.</a> Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).</li>
<li>Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipronged+activity+of+combinatorial+miR-143+and+miR-506+inhibits+Lung+Cancer+cell+cycle+progression+and+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro.</a> Science Repository. 8 (1), 10495(2018).</li>
<li>Inamura, K., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+In+Lung+Cancer%3A+Novel+Biomarkers+and+Potential+Tools+for+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).</li>
<li>Mizuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+expression+signature+of+small+cell+lung+cancer%3A+tumor+suppressors+of+miR-27a-5p+and+miR-34b-3p+and+their+targeted+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes.</a> Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).</li>
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<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+recurrence+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer+using+computer+extracted+nuclear+features+from+digital+H%26E+images%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images.</a> Science Repository. 7 (1), 13543(2017).</li>
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<li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).</li>
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<li>Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Novel+Methods+for+Modulating+Tumor+Blood+Vessels+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment.</a> Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).</li>
<li>Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and the cell cycle.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).</li>
<li>Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+for+highly+parallel+detection+and+quantitation+of+specific+proteins+and+antibodies+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions.</a> Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of protein microarrays.</a> Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Science Repository. 3, 1860(2013).</li>
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저자는 RNA 시퀀싱 데이터 그리고 텍사스 대학 남서 의료 센터, 맥 더 못에 대 한 센터 다음 세대 시퀀싱 코어의 경로 분석에 대 한 그의 도움에 대 한 존 Caskey 루이지애나 주립 대학에서 인정 하 고 싶습니다. RNA 시퀀싱 데이터 분석을 수행. 이 연구는 약 학 대학, 대학교의 루이지애나 몬로 시작, 자금과 국립 보건원 (NIH) 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 통해 의해 지원 되었다.

miRNAs의 식 수준 dysregulation를 인식 하는 암 치료에 대 한 표적으로 한 치료로 서 작동할 수 정상 조직의 대 병. 이 연구 목적 miRNAs 잠재적으로 여러 단계 세포 주기 진행 중단을 결정. 그것은 143 미르와 미르-506 암 세포, 그리고이 조합 미르 치료의 활동을 이해 하는 목적으로 제시 프로토콜의 세포 주기 정지 확인 되었다.
설명된 방법론 miRNAs의 기능에 지배적인 이해를 제공합니다. 공부 하는 miRNAs의도 전에 그들의 능력을 여러 개의 유전자를 대상으로 하 고 따라서 여러 경로 영향을 미칠와 연결 됩니다. 설명된 정량 분석 구체적인 목표는 치료 전에 식별 하는 경우 관심의 특정 유전자의 표정의 식별 수 있습니다. 예를 들어 여기에 주요 초점 CDK1 및 CDK4/6과 세포 주기의 표현 이었다.
따라서, 세포 주기 분석 propidium 요오드 화물 및 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.

Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

세포 주기 mitotic 프로세스1를 통해 DNA와 세포 확산의 중복을 허용 하는 여러 규제 이벤트의 조합 이다.  종속 kinases (CDKs)을 조절 하 고 세포 주기2를 홍보 합니다. 그 중, mitotic CDK (CDK1) 및 interphase CDKs (CDK2, CDK4, 및 CDK6)에 있는 중추적인 역할 세포 주기 진행3. Retinoblastoma 단백질 (Rb)는 CDK4/CDK6 복잡 한 세포 주기 진행4, 허용에 의해 phosphorylated 그리고 CDK1 활성화5성공적인 세포 분열 위해 필수적 이다. 수많은 CDK 억제제를 개발 하 고 지난 몇 년간 CDKs 암 치료에서 표적으로 하기의 가능성을 나타내는 임상 시험에서 평가 되었습니다. 사실, 3 CDK 억제제 유방암의 치료에 대 한 승인 되었습니다 최근6,7,8,,910. 따라서, CDKs, 그리고 특히, CDK1 및 CDK4/6, 암 세포의 진행을 조절에 큰 관심의.
(미르) miRNAs는 작은, 비 코딩 RNAs 모든 인간의 유전자11의 약 30%를 조절 하는 유전자 발현의 post-transcriptional 레 귤 레이 터. 그들의 활동은 변환 억압 또는 메신저 RNAs (mRNAs)12의 저하를 기반으로 합니다. 그들의 생물학 중요성의 설명, 5000 개 이상의 miRNAs 확인 된 하 고 하나의 miRNA 분자 여러 유전자11,13를 통제할 수 있다. 더 중요 한 것은, miRNA 식 다른 질병 및 질병 상태, 암13를 포함 하 여 관련 된 되었습니다. 사실, miRNAs는 되었습니다 특징으로 종양 또는 종양 진압, 홍보 하거나 종양 개발 및 진행14,15억제 능력이 되 고. 병에 걸리는 조직에 miRNAs의 상대 식 질병 진행;를 통제할 수 있다 따라서, 외 인 납품 miRNAs의 치료 가능성이 있다.
폐암은 주요 원인이 암 관련 된 죽음의 그리고 이상의 모든 폐 악성 종양의 60%는 비 작은 세포 폐 암16,17, 20%의 5 년 생존 율과18. 미르-143-3 p와 미르-506-3 p를 사용 하 여 최근 폐 암 세포11에서 세포 주기를 대상으로 평가 했다. 143 미르와 미르-506 CDK1 및 CDK4/CDK6, complementarity 시퀀스 있고 A549 세포에 이러한 두 미르의 효과 분석 했다. 실험 내용은 제시 되며이 문서에서 설명. 유전자 발현, 세포 주기 진행 및 apoptosis 다른 실험적인 디자인 및 transfection 다음 timepoints를 사용 하 여 평가 되었다. 우리는 특정 유전자 발현을 측정 하 microarray 분석 함께 실시간 정량 PCR (RT-정량) 방법을 사용 하 고-세대 RNA 시퀀싱 글로벌 유전자 dysregulation11을 결정 하는 데 사용 되었다. 후자의 방법을 유전자의 수천은 단일 실험 분석에서 분석 될 수 있다 하는 동안 높은 감도와 재현성, 각 유전자의 사본의 관계 되는 풍부를 식별 합니다. 또한, miRNA 처리 때문 apoptotic 분석 수행 및 여기에 설명 되어. 생물 정보학 보충 통로 분석. 여기에 제시 된 프로토콜 사용 됩니다 분석 치료의 조합 미르-143의 잠재력과 미르-506.
이 프로토콜의 주요 목적은 세포, 세포 주기에 중점을 두고 miRNAs의 효력을 식별 하는 것 이다. 다양 한 기술 여기에 제시 된 유전자 표정 분석 (사용 하 여 정량) 정교 하 게 사전 번역 고 소설에서 microarray 분석 등 단백질 수준에 유전자 분석을 위한 기법. 그것은이 보고서는 miRNAs와 함께 작업에 관심이 연구원을 위한 도움이 기대. 또한, 세포 주기의 흐름 cytometric 분석 및 세포의 apoptosis에 대 한 방법론을 제시.

<table><tbody><tr><td>-80 > C Freezer</td><td>VWR</td><td>VWR40086A</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>CELLTREAT Scientific&nbsp;</td><td>50-607-511</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 마이크로웰 플레이트&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>A549 비소세포폐암 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>VWR</td><td>0710-25G</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 2100 바이오분석기</td><td>애질런트 테크놀로지</td>스 <td>G2938c</td><td></td></tr><tr><td>앰비온 소음기 음성 제어 번호 1 siRNA</td><td>앰비온</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>항체 어레이 분석 키트, 2 반응</td><td>Full Moon Bio</td><td>KAS02</td><td></td></tr><tr><td>Brightfield microscope&nbsp; &nbsp;</td><td>마이크로스코프틱&nbsp;</td><td>IV-900</td><td></td></tr><tr><td>명시야 현미경&nbsp; &nbsp;</td><td>New Star Environment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 주기 항체 어레이, 2 슬라이드</td><td>보름달 Bio</td><td>ACC058</td><td></td></tr><tr><td>Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td><td>Labconco</td><td>342391100</td><td></td></tr><tr><td>Cellquest Pro</td><td>BD 생명과학</td><td>단계 5.14; 6.13: 세포 주기&nbsp; 단계에 따른 개체군 분포를 계산하고 분석을 위한 개체군 분포를 계산하는 데 사용됩니다. 세포자멸사&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 실시간 시스템</td><td>BioRad</td><td>CFX96 광학 모듈</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc 터치 이미징 시스템</td><td>BioRad</td><td>Chemidoc 터치 이미징 시스템</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 감소 성장 인자 기저층 매트릭스</td><td>Trevigen</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>FMA050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L 포도당, 피루브산 나트륨 제외, L-글루타민</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Zymo Research</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보조제(ECGS)</td><td>BD Biosciences</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 피펫 Pick-A-Pack 세트</td><td>Eppendrof</td><td>05-403-152</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 절대(200 프루프), 분자 생물학 학년,&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Alfa acar</td><td>L07462</td><td></td></tr><tr><td>F-12K 영양 혼합물(Kaighn's Mod.) L-글루타민, Corning</td><td></td><td>Corning 45000-354</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur 유층계</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청 (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Basix 마이크로 원심분리기 튜브(표준 스냅 캡 포함)</td><td>Fisherbrand Basix</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II 워터 재킷 CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin Solution (5000 U/mL)</td><td>Hospira</td><td>NDC#63739-920-11</td><td></td></tr><tr><td>Horixontal 전기영동 시스템</td><td>벤치탑 실험실 시스템</td><td>BT102</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-143-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH01315</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-506-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH02824</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)</td><td>개인 기증자</td><td>IRB# A15-3891</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td>결과: 생물정보학 경로 분석</td><td></td>에 사용됨</tr><tr><td>Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Invitrogen</td><td>10-977-015</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11-668-027</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염료 10X</td><td>ward's science+</td><td>470024-814</td><td></td></tr><tr><td>Medium M199 (with Earle&prime; s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>현미경 디지털 카메라</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>MU130</td><td></td></tr><tr><td>Modfit LT</td><td>Verity 소프트웨어</td><td>5.15단계: 세포주기 개체군 분포</td><td></td>분석을 위한 대체 소프트웨어</tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop one C</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 10/10</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>B21210</td><td></td></tr><tr><td>Power UP SYBR 녹색 주된 혼합</td><td>적용되는 Biosystems</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>Propidium 요오드화물</td><td>MP Biochemicals LLC</td><td>IC19545825</td><td></td></tr><tr><td>Proscanarray HT Microarray 스캐너</td><td>Perkin elmer</td><td>ASCNPHRG. 우리는 543nm에서 여기 레이저 파장을 사용했습니다.</td><td></td></tr><tr><td>q PCR 광학 접착 커버</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express</td><td>PerkinElmer</td><td>Step 7.33: 마이크로어레이 분석 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube 원심분리기 튜브 15ml</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube 원심분리기 튜브 50ml</td><td>VWR</td><td>470225-004</td><td></td></tr><tr><td>TBS 버퍼, 20x 액체</td><td>VWR</td><td>10791-796</td><td></td></tr><tr><td>온도 제어&nbsp; 원심분리기 말신</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>온도 제어 마이크로 원심분리기 말탄</td><td>Eppendrof</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific BioLite 세포 배양 처리 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce BCA 단백질 분석</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI23225</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0800WL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Range DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>VWR 표준 솔리드 도어 실험실 냉장고</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석

Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

폐 암 (LC)은 전세계 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 다른 암 세포와 마찬가지로, 액정 셀의 기본적인 특성은 관계가 없는 확산 및 세포 분열 이다. 억제 세포 주기 진행을 중단 하 여 확산의 LC를 포함 한 암 치료에 대 한 유망한 접근 되도록 표시 되었습니다.
miRNA 치료제 중요 한 post-transcriptional 유전자 레 귤 레이 터로 등장 하 고 암 치료에 사용 하기 위해 점점 공부 되 고 있다. 최근 작품에서 우리는 두 miRNAs, 143 미르와 미르-506, 세포 주기 진행 조절 하 활용. A549 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 세포 페 했다, 유전자 표현 변경 했다 분석 하 고 치료 때문에 apoptotic 활동 마지막으로 분석 했다.  종속 kinases (CDKs)의 Downregulation 감지 했다 (즉, CDK1, CDK4 그리고 CDK6), 세포 주기 G1/G2/M 및 상전이에 중단 하 고. 경로 분석 다각적인 활동 접근을 endows 치료의 잠재적인 항 혈관 신생 활동을 가리킨다. 여기, 설명 된 혈관 신생의 억제에 의해 세포 주기 억제, apoptosis의 유도 및 내 피 세포에 치료의 효과 관한 miRNA 활동을 식별 하기 위해 사용 하는 방법론입니다. 그것은 여기에 제시 된 방법 미르 치료제와 해당 활동에 미래 연구를 지원 합니다 및 대표적인 데이터 실험 분석 하는 동안 다른 연구자를 안내할 것입니다 기대.

실시간 정량 Pcr 및 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 유전자 표정 분석
실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 차동 유전자 표정 분석 대상된 유전자 CDK1, CDK4, 및 CDK6의 상당한 downregulation 시연. CDK1 및 CDK4/6 될 G2/M과 g 1/S 전환에 대 한 각각을 표시 했다. 수행된 분석 개별 미르와 미르 조합 활동 사이 직접적인 비교를 허용. 평가 절차에서 어떠한 간섭의 허용 transfecting 에이전트와 함께 출 격 siRNA 사용 하 여 감지 유전자 downregulation를 최소화 했다. 데이터는 양측 스튜던트 t를 사용 하 여 분석 통계 되었다-테스트, 그리고p &lt; 0.05 통계적 (그림 1)으로 간주...

miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

이 방법은 시험관내 폐암 세포에서 2개의 microRNA의 활동을 확인하는 데 필요한 실험실 기술을 이해하고 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 여기서는 기본 실험실 방법론에서 부터 유전자 발현 분석 및 항체 단백질 microRNA와 같은 보다 복잡한 프로토콜에 이르는 기술을 제시하며, 특히 microRNA의 작용의 효과를 식별하는 데 사용됩니다.다음 방법은 폐암 세포에서 세포 주기를 조절에 2 개의 microRNAs, microRNA 143 및 microRNA 506의 효력에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 것입니다. 우리는 세포 전환, RNA 추출, 정량적 실시간 PCR 및 microRNA 분석과 같은 다른 실험실 기술을 제시합니다. 프레젠테이션이 이러한 분석을 성공적으로 완료하는 데 기여하기를 바랍니다.첫째, 배양된 세포를 RNA 및 단백질 추출에 충분한 적절한 플라스크에 앉히고, qPCR 또는 마이크로 어레이 분석을 사용하여 유전자 발현을 수행한다. 그런 다음 10 % FBS와 1 % 페니실린 연쇄 절제술로 보충 된 미디어로 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 각각 100 나노몰라의 농도로 미디어에서 마이크로RNA 143 및 microRNA 506을 희석하여 트랜스페션을 위한 microRNA 샘플을 준비한다.인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 미디어를 제거합니다. 1x PBS로 씻으시다. 처리되지 않은 모든 컨트롤에는 셀이 있는 불완전한 미디어만 포함됩니다.인큐베이터에서 6시간 동안 형질전환 매체로 세포를 배양한다. 6시간 후 미디어를 제거하고 4밀리리터의 신선하고 완전한 미디어로 교체하십시오. 트립시화에 의해 24 시간 48 시간 후에 세포를 수확하십시오.다음으로 각 튜브에 1x PBS로 두 번 세척하고 상복부을 제거합니다. 나중에 RNA 추출을 수행하기 위해, 영하 80도에서 세포를 동결. RNA 추출은 RNA 키트를 사용하여 수행되었으며, 제조업체의 지시에 따라 수행되었다.첫째, 영하 80도에서 튜브를 제거하고 해동할 수 있습니다. 300 마이크로리터의 분해 완충제와 파이펫을 위아래로 추가하여 세포막을 분해합니다. 100% 초순수 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다.그런 다음 잘 섞어서 분리된 열에 놓습니다. 원심 분리기를 제거하고 흐름을 제거합니다. 버퍼를 제거하기 위해 400 마이크로리터의 세척 및 버퍼 및 원심분리기를 추가합니다.각 샘플에 75 마이크로리터 VNA 소화 버퍼와 DNAse 1의 마이크로리터 5개를 추가하고 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 400 마이크로 리터 RNA 준비 버퍼로 샘플을 세척하십시오. 다음으로 RNA 세척 버퍼로 두 번 씻으시다.지금, 열에 핵이없는 물을 추가, 원심 분리기 다음 RNA를 수집. RNA 농도를 측정합니다. 이 단계에서는 RNA 시퀀싱을 위해 2마이크로그램의 RNA 샘플을 전송할 수 있다.열사이클러를 사용하여 텍스트 섹션에 설명된 프로토콜에 따라 cDNA를 준비합니다. DNAse RNA가 없는 물로 앞으로 준비하고 10 마이크로몰러의 농도로 방향을 바울 수 있습니다. 샘플 수에 따라 검출될 각 유전자에 대한 마스터 믹스를 준비한다.각 cDNA 샘플에 대해, 반응 량은 텍스트에 기재된 표에 따른것이다. 각 샘플을 각 우물에 놓습니다. qPCR의 경우 샘플을 추적하기 위해 96 개의 웰 플레이트 레이아웃으로 Excel 문서를 준비하는 것이 좋습니다.각 샘플 및 분석 된 유전자에 대해, 삼중, 또는 적어도 중복에 자신의 반응을 수행. 투명하고 광학적으로 투명한 플라스틱 실러로 플라스틱 플레이트를 밀봉하십시오. 이것은 거짓 신호를 생성 할 수 있기 때문에 손가락으로 얇고 플라스틱 층을 만지지 마십시오.모든 시약을 우물 바닥에 섞기 위해 플레이트를 빠르게 회전시합니다. 다음으로, 정량적 실시간 PCR 기계를 사용하여 샘플 플레이트를 실행합니다. qPCR 기계에서 생성된 CT 값을 얻고 상대적인 유전자 발현을 분석합니다.이 비디오의 이전 섹션에 설명된 바와 같이 세포를 변형시. 트립시니화를 위해 각 샘플에서 15 밀리리터 멸균 튜브에서 세포를 수확합니다. 다음으로, 세포를 1x PBS로 두 번 씻고, 751G에서 원심분리를 5분 동안 세척한 다음, 상퍼를 제거합니다.파이펫을 통해 200 마이크로 리터 얼음 차가운 1 x PBS를 추가하여 팔레트를 다시 일시 중단하고 깨집니다. 튜브를 부드럽게 돌리면서 튜브를 부드럽게 돌리면서 70%의 얼음 차가운 에탄올 2밀리리터를 튜브에 넣고 튜브를 부드럽게 돌립니다. 실내 온도에서 30 분 동안 튜브를 인큐베이션하고 1 시간 동안 섭씨 4도에 배치하십시오.4섭씨와 원심분리기에서 튜브를 제거합니다. 2ml의 얼음 차가운 PBS와 소용돌이를 추가한 다음 원심분리로 상체를 제거합니다. 프로피듐 요오드와 리보누칼리스 A를 포함하는 1x PBS의 500 마이크로리터를 각각 각 샘플에 밀리리터당 50 및 200 마이크로그램을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.샘플을 적절한 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호하고 유동 세포계에서 실행합니다. 본 실험은 microRNA 치료에 의해 변화된 모든 세포 주기 통로 단백질의 발현을 확인하는 것이다. 경질 단면도에 기술된 절차에 따라 단백질 샘플을 수집하고 BCA 분석으로 정량화한다.실온에 가지고 수분을 제거하기 위해 실험 1 시간 전에 영하 4도에서 슬라이드를 제거합니다. 단백질 샘플 70마이크로그램을 취하고 제조업체의 지침에 따라 샘플 슬라이드를 준비하며, 이는 텍스트 섹션에서 단계별로 설명됩니다. 여기에 주의, 매우 순수한 deionized 물로 슬라이드의 적절한 세척은 슬라이드의 배경을 줄이는 데 도움이 될 것입니다으로, 또 다른 중요한 단계입니다.또한 이 실험에서는 최종 단계까지 샘플 슬라이드를 건조시키지 않는 것이 매우 중요합니다. 마지막으로 마이크로 어레이 머신을 사용하여 슬라이드를 스캔하고 데이터를 분석합니다. 마이크로RNA 처리 된 샘플의 qPCR 분석은 CDK1, CDK4 및 CDK6의 유전자 발현을 결정하기 위해 일어났다.이 유전자는 정상 및 암세포의 세포 주기를 조절하고 종양 진행을 억제하기위한 수단으로 표적으로 삼았습니다. 데이터는 microRNA 143 및 506를 가진 처리 때문에 이 유전자의 다운규제 효력을 보여주었습니다. 유동 세포측정에서 세포주기 분포 데이터는 G0 및 G1 단계의 인구 증가를 입증하고, microRNA 143 및 506의 편협 처리의 효과로 인해 S 상에서 인구 감소를 입증했다.세포 주기의 특정 마이크로 어레이 분석은 대략 60개의 유전자의 단백질 발현 변경을 검출했습니다. 대표열지도는 CDK2, Helen 1 및 3, RE2F1과 같은 세포 주기 및 증식의 진행에 필요한 다중 유전자의 단백질 수준에서 하향 조절을 나타냈다. 대조적으로, 그들의 성장한 억제 효력에 의해 일반적으로 인식되는 단백질은 강화조정되었습니다.결과는 반정적이며 추가 분석이 필요하지만 마이크로 어레이 분석은 경로의 활동에 대한 간략한 개요를 제공합니다. 우리는 이 비디오를 본 후에 세포에서 microRNA 활동의 식별에 도움이 될 것입니다 근본적인, 뿐만 아니라 복잡한, 실험실 실험을 수행 할 수있을 것입니다 믿습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

대상 아이디 라이브러리 miRNA 목표를 식별하는 데 사용 복제된 cDNA의 플라스미드 기반의 게놈 전체 모음입니다. 여기는 이용 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

이 비디오는 miRNA 형질 주입된 폐암 세포에서 RNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법은 세포주기 및 혈관 신생을 중단하는 조합 miRNA 치료 활성을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

RNA 추출 분석: miRNA 형질주입된 폐암 세포에서 RNA를 추출하는 방법

miRNA 또는 microRNA는 세포주기 진행의 핵심 조절자입니다. 이 동영상은 miRNA가 세포주기 조절에 미치는 영향을 연구하기 위해 miRNA로 transfection된 폐암 세포의 유세포 분석 기반 세포주기 분석을 설명합니다. 세포주기 진행을 중단시킴으로써 증식을 억제하는 것은 암 치료를 위한 유망한 접근법이 될 수 있는 잠재력을 보여주었습니다.

세포주기 분석: miRNA transfected 폐암 세포의 세포주기 조절을 연구하기 위한 접근법

이 비디오는 특정 유전자 발현을 측정하기 위해 항체 마이크로어레이를 사용하여 miRNA 형질 주입된 폐암 세포의 단백질 발현을 연구하는 기술을 설명합니다. 특색지어진 프로토콜에서는 세포 주기 및 혈관 신생을 중단하는 데 있어 조합 miRNA 치료의 활성 식별을 위해 항체 마이크로어레이를 수행합니다.

항체 마이크로어레이: miRNA 처리된 폐암 세포의 단백질 발현을 연구하는 기술

이 비디오는 정소성 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 치료제로서 miRNA 억제제의 생체 내 전달을 보여줍니다. 합성 miRNA 억제제 또는 antagomiR의 종양 내 투여는 내인성 miRNA와 결합하고 억제할 수 있도록 하여 mRNA 상향 조절 및 종양 성장 억제를 유발합니다.

miRNA 억제제를 사용한 종양내 치료 모델링: 쥐 모델에서 종양 성장에 대한 miRNA 억제제의 효과를 분석하는 방법

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

이 프로토콜은 프로브 기반 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석, 3' 번역되지 않은 영역(3' UTR) 클로닝 및 루시퍼라제 분석제를 사용하여 관심 있는 miRNA의 표적 유전자를 확인하고 miRNA의 기능을 이해합니다.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

여기서 설명된 것은 생물학적으로 상승적인 miRNAs및 그들의 조립체를 짧은 트랜스게네인으로 특성화하기 위한 프로토콜이며, 이는 유전자 치료 애플리케이션을 위한 동시 과발현을 허용한다.

교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

배우세요 폐암 세포에서 miR-143과 miR-506의 세포 주기 및 혈관신생 조절 효과를 분석하는 방법을. 세포 전염, RNA 추출, 정량적 실시간 PCR 기법을 활용하여 마이크로RNA의 항암 치료 가능성을 탐구합니다.

조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석

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