Name: 아파티닙 내성 폐 선암 종 PC-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 학습하세요 아파티닙 내성 폐 선암 PC-9 세포주를 단계적 용량 증가법으로 확립하고 특성 분석하는 방법을. 이 기술은 약물 내성 기전 연구와 비소세포폐암 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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고급 암 번역 연구소 회원에게 영어 편집에 대한 그들의 사려 깊은 의견과 편집에 감사드립니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI (교부수 : 16K09590 ~ T.Y.)에 의해 지원되었습니다.

1. 독립형 아파티닙 내성 PC-9 세포주 3개 구축
<ol><li>3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테테라졸륨 브로마이드(MTT) 분석법을 사용하여 PC-9 세포에 대한 초기 아파티닙 노출 농도의 결정
	<ol>
<li>배양 PC-9 세포는 태아 소 혈청(10%), 페니실린(100 U/mL), 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 함유하는 성장 배지에서 세포 배양에서 5% CO2 인큐베이터에서 5% CO2 인큐베이터에서 처리하였다.</li>
		<li>성장 배지에서 4 x 104 세포 / mL에서 PC-9 세포를 다시 일시 중단하고 96 웰 마이크로 플레이트에서 50 μL / well에서 씨앗을 제거하십시오. 세포의 최종 농도는 2.0 x 103 세포/ 50 μL / well입니다. 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
		<li>성장 배지(50 μL)를 함유하는 웰에 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6 및 20 μM의 다양한 농도로 50 μL의 아파티닙 용액을 첨가한다. 아파티닙의 최종 부피 및 농도는 각각 100 μL 및 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 및 10 μM이다.</li>
		<li>37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 96시간 동안 96웰 플레이트를 배양한다.</li>
		<li>염료 용액 15 μL을 각 웰에 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 다음 용해/정지 용액 100μL을 각각 잘 추가하고 5% CO<에서 밤새 배양합니다<< 37 °C에서 c10>2 인큐베이터.</li>
		<li>마이크로 플레이트 리더를 사용하여 570 nm (OD570)에서광학 밀도를 측정하십시오 (재료 표참조). 6-12개의 복제를 준비하고 적어도 3회 실험을 반복한다.</li>
		<li>통계 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 이러한 데이터를 반로그 그래프로 그래픽으로 플롯하고 최대 50%의 응답을 감소시키는 약물 농도인 IC50 값을 계산합니다(재료 표 참조) ).</li>
	</ol></li>
	<li>돌이킬 수 없는 EGFR-TKI, 아파티닙에 PC-9 세포의 지속적인 노출, 3개의 독립적인 10cm 접시에 단계적 투여량 에스컬레이션
	<ol>
<li>배양 PC-9 세포는 성장 배지의 10 mL를 함유하는 p100 접시에. PC-9 세포가 하위-결합 단계에 도달하면, 세포 현탁액 1mL을 3개의 새로운 p100 접시로 옮기고 9 mL의 성장 배지를 사용합니다. 1:10 희석된 PC-9 세포는 3-4일 안에 하위-결합이 되며, 세포 수는 약 4-5 x 105 세포/mL입니다.</li>
		<li>다음 날, 3개의 p100 요리각각에 아파티닙의 IC50 값의 1/10을 추가합니다. 참고: 아파티닙은 DMSO에서 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM 및 5 mMM의 재고 농도로 재구성됩니다. 1 ~10 μL의 아파티닙-액은 필요한 최종 농도에 따라 배양배지의 10 mL에 첨가된다.</li>
		<li>afatinib 함유 p100 접시의 세포가 서브-컨벤티션이 되면, 1 mL 파이펫으로 포부로 잘 혼합하고 새로운 p100 접시에 9 mL의 신선한 성장 배지에 세포 현탁액1 mL을 추가합니다. 다음으로, 새로운 문화에 10-20% 더 높은 농도의 아파티닙을 추가하십시오.</li>
		<li>아파티닙 농도를 0.1 nM에서 1 μM으로 증가시켜 10-12개월의 기간 동안 각 단계에서 아파티닙 농도가 10-20% 증가하면서 단계별 투여량 에스컬레이션에 의해 증가한다. 참고: 아파티닙 농도가 IC50 값에 접근할 때, 세포 성장은 매우 느려진다. 세포가 1:9로 분할되는 경우에, 이 세포는 afatinib의 더 높은 농도에 의해 살해되기 때문에, 그(것)들은 증가하지 않을 수 있습니다. 따라서, 더 높은 afanitib 농도에서, 세포는 1:2의 비율로 분할될 수 있다. 가장 저항하는 세포는 3-14일 동안 afatinib 함유 배지에서 성장하였고, 배지는 내성 세포가 통과될 필요가 있을 때까지 변하지 않았다.</li>
		<li>1 μM 아파티닙 함유 성장 배지에서 2-3개월 동안 아파티닙 내성 세포를 배양하였다. 1 μM의 afatinib 농도에서, 10-12 개월이 모델에서 afatinib에 저항을 개발 하는 데 필요한. MTT 분석기를 수행하여 세포가 아파티닙에 내성이 있는지 확인합니다. 독립적으로 확립된 3개의 afatinib 저항 세포주명명된 AFR1, AFR2, 및 AFR3.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 3개의 독립적인 afatinib 저항하는 세포의 특성화
<ol><li>부모 PC-9 세포의 성장 곡선의 결정 및 afatinib 저항 하는 세포의 설립
	<ol>
<li>37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 성장 배지에서 PC-9, AFR1, AFR2 및 AFR3 세포를 배양하였다.</li>
		<li>성장 배지로 5 x 103 세포 / mL에서 세포를 다시 중단하고, 세포의 최종 농도가 500 세포 / 100 μL / well이되도록 96 웰 마이크로 플레이트에 100 μL / well을 넣습니다. 참고: MTT 분석은 0, 1, 2, 3, 5 및 7일에서 OD570 값을 측정하기 위해 수행된다. 매일 6개의 96웰 마이크로플레이트가 필요합니다.</li>
		<li>MTT 분석을 24시간마다 수행한 다음 0, 1, 2, 3, 5 및 7일에 수행합니다. OD570 값을 측정하고 6-12 복제를 준비; 실험을 세 번 이상 반복하고 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 그래픽으로 플로팅합니다(재료 표참조).</li>
	</ol></li>
	<li>실시간 PCR에 의한 EGFR의 게놈 DNA 변조 확인 참고: 아파티닙은 EGFR 티로신 키나아제를 표적으로 하는 소분자 억제제이다. EGFR 발현 상태는 DNA 및 단백질 수준에서 결정된다.<ol>
<li>게놈 DNA는 제조업체의 지시에 따라 DNA 정제 키트(재료 표참조)를 사용하여 분리됩니다. 분광광도계로 분리된 게놈 DNA의 농도를 측정하고 모든 게놈 DNA 샘플을 25 ng/μL로 조정합니다.</li>
		<li>SYBR 그린 마스터 믹스(재료 표참조)를 사용하여 25 ng/μL 스톡의 2 μL에 해당하는 게놈 DNA 50ng을 증폭하고 형광 기반 RT-PCR 검출 시스템을 사용하여 결과를 분석합니다(재료 표참조). 참고: PCR 사이클링 조건은 20초 동안 95°C에서 초기 변성 단계로 시작하여 3초 동안 95°C 변성의 40사이클, 30초동안 60°C 어닐링으로 시작되었습니다. 특정 프라이머 세트는 다음과 같습니다: EGFR F: 5′-CAAGGCCATATGGTCA-3′, R: 5′-CTGGAATGGGGAACA-3′. 정상화 유전자 LINE-1 F: 5′-AAAGCCGCTACATGG-3′, R: 5′-TGCTTTTTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′.</li>
	</ol></li>
	<li>서부 얼룩 분석에 의한 EGFR 수준에 대한 단백질 변경의 영향 평가
	<ol>
<li>24 시간 동안 실험하기 전에 아파티닙으로 세포를 지속적으로 치료하십시오. PC-9, AFR1, AFR2 및 AFR3 세포를 5 mL의 얼음 차가운 PBS로 두 번 씻으하십시오.</li>
		<li>1% 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제의 세포를 라이즈(재료 표참조) 및 인산염 억제제 칵테일 II 및 III(재료 표참조)에서 30분 동안 4°C에서 배양합니다. 100 x g 및 4 °C에서 클리어 된 용해액을 수집합니다.</li>
		<li>비신코닌산 분석법(재료 표참조)을 사용하여 단백질 농도를 결정하고, 4x 샘플 버퍼(500 mM Tris (PH 6.8), 40% 글리세롤, 8% SDS, 20% H2O, 0.02% 브로모펜 블루를 사용하여 모든 단백질 샘플을 0.5 μg/μL로 조정하고 96°C에서 5분간 끓인다.</li>
		<li>동일한 양의 단백질 샘플을 분리하여, 바람직하게는 20-30 μL, 8% SDS 페이지로 단백질을 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인으로 옮김. 참고: 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)은 분자량에 따라 단백질의 분리를 위해 실험실에서 일반적으로 사용됩니다.<ol>
<li>에탄올로 유리 판을 청소하고 유리 판과 스페이서를 조립합니다. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8, 40% 비스 아크릴아미드, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED를 함유하는 8% 폴리 아크릴아미드 젤을 준비합니다. 실온에서 30 분 동안 중합.</li>
			<li>이어서, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 40% 비스-아크릴아미드, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED를 함유하는 스태킹 겔을 준비한다. 스태킹 젤 용액을 추가하고 빗을 삽입하고 실온에서 20-30 분 동안 젤을 중합합니다.</li>
			<li>겔을 전기 동공 장치에 놓고 실행 버퍼 (0.25 M Tris, 1.92 M 글리신 및 1 % SDS)로 탱크를 채웁니다. 동일한 양의 단백질 샘플(20-30 μL)을 로드하고 약 60분 후에 염료 전면이 겔에서 흘러나오면 180 V. 전기 영동을 중지하여 겔을 실행합니다.</li>
			<li>젤을 TBST로 1-2 분 동안 씻은 다음 300 mA의 일정한 전류에서 1.5 시간 동안 반 건조 블로팅 (재료 표참조)으로 PVDF 멤브레인에 단백질을 옮김을 옮니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실온에서 1시간 동안 TBST 용액으로 희석된 무지방 건조우유(재료표 참조)로 멤브레인을 차단한 다음, 안티EGFR, 항포스-EGFR(Y1068), 항-HER2로 멤브레인을 프로브하고, 항-HER3, 항-MET 및 항액틴 항체(TBST에서 1:3,000 희석) (재료 표참조) 4 °C에서 하룻밤.</li>
		<li>10 분 동안 TBST로 멤브레인을 세 번 씻은 다음 실온에서 1-1.5 시간 동안 이차 항체 (TBST에서 희석 된 1 :200)에 멤브레인을 노출시킵니다. 실온에서 TBST로 멤브레인을 5회 세척하고 ECL 용액에 노출시키고(재료 표참조) 필름을 사용하여 신호를 시각화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시퀀싱에 의한 EGFR 돌연변이 분석
	<ol>
<li>EGFR 엑슨 19-21에 대한 특정 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시다. PCR 사이클링 조건은 1 분 동안 94 °C에서 초기 변성 단계로 시작하여 10 초 동안 98 °C에서 30 사이클의 변성, 30 초 동안 55 °C에서 어닐링, 72 °C에서 1 분 동안 연장합니다. 참고: EGFR 엑슨에 대한 특정 프라이머 19: F: 5′-GCAATCTGCGCGCGCC-3′ R: 5′-카타가아아아아아GT가아카타그타그GTG-3′, 엑슨 20: F: F: 5′-CCATGAGTACTTTGAACTC-3′, R: 5′-CATATCCCCATCAAACTTGC-3′, 그리고 엑소 21: F: 5′-ATGAAATGATATTG-3′, R: 5′- GCTCACAGAATGTGG가-3′.</li>
		<li>PCR 정제 키트를 사용하여 증폭된 PCR 제품을 정화하고(재료 표참조) 앰플리온을 순서화합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서, 우리는 3개의 독립적인 afatinib 저항하는 세포주를 설치하는 방법을 기술하고 부모 PC-9 세포에 비교하여 이 세포를 특징으로 합니다. 단계적으로 복용량 에스컬레이션 노출에 의해, 부모 PC-9 세포의 기간 동안 afatinib에 저항을 획득 10-12 개월. 임상적으로, EGFR TKIs에 대한 저항 기전은 이질적이며, 따라서, 아파티닙을 사용하여 초기 처리 후, PC-9 세포를 3개의 독립적인 p100 요리로 나누어 아파티닙에 더 많이 노출시켰다. 처음에는 세포 성장이 현저히 둔화되지 는 않았지만 약물 농도가 IC50 값에 접근함에 따라 세포 증식이 느려졌습니다. 이것은 억제제에 취득한 저항을 가진 세포를 얻기위한 중요한 단계입니다. 증식 셀은 1:10 또는 1:5의 비율로 분할되어 새로운 p100 접시로 옮겨져야 합니다. PC-9 세포가 p100 접시에서 배양되었을 때, 일부 순착이 관찰되었지만 대부분의 세포는 현탁액에서 증가했습니다. 아파티닙의 농도가 증가함에 따라, 세포는 조직 배양 ...

5개의 티로신 키나아제 억제제, 표적표피 성장 인자 수용체(EGFR), 게피티닙, 에로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 및 오시메르티닙을 포함한 현재 EGFR 돌연변이 양성 비소세포 폐 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 암 (NSCLC). 지난 10 년간, 그 같은 환자를 위한 치료는 새로운 잠재적인 EGFR-TKIs의 발견과 극적인 발달을 겪었습니다. 폐 선암종 환자 중 EGFR의 체세포 돌연변이는 아시아인의 약 50 %와 백인 환자의 15 %에서 확인됩니다1. EGFR에서 가장 흔한 돌연변이는 EGFR 엑손(19)2에서EGFR 엑손 21 및 15 염기 쌍(bp) 삭제에서 L858R 점 돌연변이이다. NSCLC를 가진 EGFR 돌연변이 양성 환자에서, EGFR-TKIs는 백금 doublet 화학요법의이전 표준에 비해 반응 비율 및 임상 결과를 향상합니다 3.
Gefitinib 및 에로티닙은 최초로 승인된 소분자 억제제였으며 일반적으로 1세대 EGFR TKIs로 지칭된다. 이러한 EGFR TKIs는 ATP와 경쟁하여 티로신 키나아제 활성을 차단하고 ATP 결합 부위에 가역적으로 결합한다4. 아파티닙은 EGFR의 티로신 키나아제 도메인에 비가역적이고 공유적으로 결합하는 2세대 EGFR TKI이며 범인간 EGFR 패밀리 억제제5로서특징이 있다.
NSCLC를 가진 환자에 있는 이 치료의 극적인 이득에도 불구하고, 취득한 저항은 불가피합니다. 1 세대 및 2 세대 EGFR TKIs에 대한 가장 일반적인 저항 메커니즘은 EGFR exon 20에서 T790M 돌연변이의 출현이며, 이는 종양 샘플 6,7,8의50-70 %에 존재한다. 다른 저항 기전은 우회 신호 (MET, IGF1R 및 HER2), 소세포 폐암으로의 변환, 및 전임상 및 임상적으로 발생하는 상피-중간엽 전이의 유도를 포함한다. EGFR TKIs에 대한 저항 메커니즘은 이기종이다. 전임상 연구에서 새로운 내성 메커니즘을 식별함으로써, 내성을 극복하기 위해 새로운 치료법을 개발할 수 있다. 환자에게 임상적 이점을 극대화하는 최적의 서열 요법은 내성 메커니즘 및 치료 적 표적을 고려해야 한다.
그것은 모든 후속 실험의 기초이기 때문에, 올바른 부모의 세포줄을 선택하는 것이 필수적이다. 선택 전략은 임상 적 관련성으로 시작됩니다. 화학 요법과 방사선 순진한 세포줄을 선택할 필요가 있습니다. 이전 화학요법 및/또는 방사성 치료는 내성 경로의 변경 및 약물 내성 마커의 발현의 변화를 유도할 수 있다. 본 연구에서, EGFR 엑슨 19에서 15 bp 삭제를 운반하는 PC-9 세포는, afatinib에 취득한 저항의 설치를 위해 이용됩니다. 이 세포주 세포주 환자는 일본 NSCLC 환자에서 유래하였고, 이들은 이전에 화학요법과 방사선을 받지 않았다.
아파티닙은 매일 구두로 투여되기 때문에, 세포가 아파티닙의 존재 내에서 지속적으로 배양되는 체외 내 치료는 임상적으로 관련이 있을 것이다. 실험의 다양한 단계에서 사용되는 약물의 투여량은 선택된 부모 세포주에 대해 최적화되어야 한다. 세포 독성 분석법은 약물의 약물 동력학 정보와 비교되어야하는 적합한 약물 범위를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.
선택 과정 전반에 걸쳐, 세포의 전체 집단은 단일 그룹으로 유지된다; 복제 또는 기타 분리 방법은 사용되지 않습니다. 세포는 먼저 약물의 낮은 수준에 지속적으로 노출됩니다. 이어서, 세포가 약물의 존재 속에서 성장하도록 적응한 후, 약물의 투여량은 약물의 최종 최적 용량으로 서서히 증가한다10,11. 대안적으로, 펄스 약물 투여 또는 돌연변이 발생은 약물 치료(12,13)이전에 수행되는 저항성 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 불행히도 약물 내성이 발병하지 않는 경우는 일반적으로 보고되지 않습니다. 선택 전략은 임상적으로 관련된 저항을 재건하기 위한 암 환자의 조건을 모방하는 것을 목표로 개발됩니다. 때로는 약물 내성의 메커니즘과 관련된 분자 변화를 식별하기 위해 높은 약물 농도가 사용됩니다. 이 모델은 임상적으로 관련성이 낮아집니다.
여기서, 우리는 EGFR 엑손(19)에서 15bp 의 탈착을 수용하는 PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 afatinib 내성 세포주를 확립하는 방법뿐만 아니라 아파티닙 내성 세포주들의 초기 특성화를 설명한다.

<table><tbody><tr><td>afatinib</td><td>Selleck</td><td>S1011</td><td></td></tr><tr><td>항-EGFR 단클론 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>4267S</td><td></td></tr><tr><td>bicinchoninc 산 분석</td><td>시그마</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 처리된 10 cm 접시</td><td>Violamo</td><td>2-8590-03</td><td></td></tr><tr><td>CELL BANKER1&nbsp;</td><td>TakaRa</td><td>CB011</td><td>동결 보존 매체</td></tr><tr><td>CellTiter 96</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G4100</td><td>&nbsp; 비방사성 세포 증식 분석법; 염료 용액 및 용해/정지 용액</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>ECL 용액</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 5700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>형광 기반 RT-PCR 검출 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7 소프트웨어&nbsp;</td><td>그래프패드, Inc.</td><td></td><td>통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 분광 광도계</td><td>열</td><td></td><td>분광 광도계</td></tr><tr><td>무지방 분</td>유 <td>세포 신호 전달 기술</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>펜 연쇄상 구균</td><td>gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 칵테일 2</td><td>시그마</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제 칵테일 3</td><td>시그마</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>Powerscan HT 마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 파워 SYBR 그린 마스터 믹스&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>SYBR 그린 마스터 믹스</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td></td><td>PCR 정제 키트</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>L-글루타민 및 페놀 레드</td></tr><tr><td>TBST 분말</td><td>시그마</td><td>T9039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry 전기영동 전사 셀</td><td>Bio-Rad Semi-Dry</td><td></td><td>T4Ransfer 장치</td></tr><tr><td>96 웰 마이크로플레이트</td><td>Thermo</td><td>130188</td><td></td></tr></tbody></table>

아파티닙 내성 폐 선암 종 pc-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

분자 표적 억제제에 대한 획득된 내성은 암 치료에 심각한 문제이다. 폐암은 대부분의 국가에서 암 관련 죽음의 주요 원인 남아 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)-활성화 돌연변이와 같은"종양발생 드라이버 돌연변이"의 발견, EGFR 티로신 키나아제 억제제(TKIs)의 분자 표적제의 후속 개발(gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, 및 osimertinib) 최근 수십 년 동안 극적으로 변경 된 폐암 치료. 그러나, 이들 약물은 EGFR-활성화 돌연변이를 운반하는 비소세포 폐암(NSCLC)을 가진 환자에서 여전히 효과적이지 않다. 후천성 저항에 이어, NSCLC의 전신 진행은 EGFR 돌연변이 양성 NSCLC를 가진 환자 를 치료하는 데 중요한 장애물로 남아 있다. 여기서, 우리는 EGFR 엑손 19에서 EGFR 쌍 삭제의 EGFR 활성화 돌연변이를 품고 있는 NSCLC PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 획득된 afatinib 내성 세포주를 확립하기 위한 단계적 투여량 에스컬레이션 방법을 제시한다. 3개의 독립적인 afatinib 저항 세포주를 특성화하는 방법은 간략하게 제시된다. EGFR TKIs에 대한 획득된 저항 메커니즘은 이기종이다. 따라서 EGFR-TKIs에 대한 후천성 저항성을 가진 다중 세포주를 검사해야 합니다. 10 12 개월이 단계별 복용량 에스컬레이션 접근 방식을 사용 하 여 획득 된 저항세포를 얻을 필요. 새로운 취득한 저항 기계장치의 발견은 더 효과적이고 안전한 치료 전략의 발달에 기여할 것입니다.

단계적 투여량-에스컬레이션 절차를 사용하여 PC-9 세포로부터 3개의 아파티닙 내성 세포주를 확립하기 위한 스키마는 도1에 나타내고 있다. 도 2는 아파티닙의 농도가 증가함에 따라 부모PC-9 세포의 세포 증식의 감소를 나타내며, 이는 PC-9 세포가 아파티닙 노출에 민감하다는 것을 나타낸다. 도 3은 3개의 세포주중의 아파티닙 내성을 나타낸다. 3개의 afatinib 저항하는 세포주, AFR1, AFR2 및 AFR3의 아무도는, afatinib 노출의 밑에 세포 증식의 억제를 보여주었습니다. 도 4는 PC-9, AFR1, AFR2 및 AFR3 세포에 대한 세포 증식 곡선을 나타낸다. 3개의 afatinib 저항하는 세포주 는 부모 PC-9 세포 보다는 현저하...

폐 선암종 PC-9 세포로부터 아파티닙 내성 세포주를 확립하는 방법이 개발되었고, 내성 세포가 특징지어졌다. 내성 세포는 비소세포 폐암 환자에게 적용되는 표피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제 내성 메커니즘을 조사하는데 사용될 수 있다.

아파티닙 내성 폐 선암 종 PC-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

새로운 획득한 저항 기계장치의 연구 결과는 내성 암 내성 및 절제성 암을 가진 환자에 있는 더 효과적이고 안전한 치료 전략의 발달에 기여할 것입니다. 불행히도 약물 내성이 발달하지 못한 경우는 일반적으로 보고되지 않습니다. 이 단계적 투여량 에스컬레이션 방법은 획득 저항 세포를 얻기위한 가장 신뢰할 수있는 기술로 간주됩니다.적절한 아파티닙 저항 농도를 결정하기 위해, 배양 PC-9 세포는 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 10센티미터 세포 배양 처리 접시에서 성장 배지에서. 성장 중간 농도의 밀리리터 당 4 배-10-4 세포에서 PC-9 세포를 다시 중단하고, 96 웰 마이크로 플레이트에서 잘 세포 현탁액의 50 마이크로 리터에 세포를 시트. 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션 을 한 후, 50 마이크로리터의 아파티니브 용액을 잘 처리하고, 6개의 표시 농도의 복제에서, 컬 배양 인큐베이터에서 96시간 배양 후, MTT 염료 15마이크로리터를 각각 잘 첨가한다.세포 배양 인큐베이터에서 4시간 후, 각 웰에 100마이크로리터의 용용성/스톱 용액을 추가하고 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이터로 되돌리십시오. 다음 날에는 마이크로플레이트 판독기에서 570나노미터의 광학 밀도를 측정합니다. 지속적인 아파티닙 노출을 위해, 세포가 수렴에 도달할 때까지 성장 배지의 10 밀리리터를 포함하는 P-100 접시에 있는 배양 PC-9 세포.초기 배양식당 9밀리리터의 3개의 새로운 P-100 접시로 하위 배양을 옮기고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 다음 날 아침, 3개의 배양 요리의 각 세트에 afatinib의 반 최대 억제 농도의 0.1 나노 몰라, 또는 1/10을 추가합니다. 아파티닙 처리 된 세포가 하위 conconfluent될 때, 철저하게 배양을 혼합하기 위해 1 밀리리터 파이펫을 사용하고, 새로운 P-100 요리에서 신선한 성장 매체의 9 밀리리터에 각 접시에서 세포의 1 밀리리터를 전송합니다.새로운 배양에 10%에서 20% 더 높은 농도의 아파티닙농도를 추가하여, 배양이 10~12개월 동안 수렴에 도달할 때마다 단계적 용량 에스컬레이션에 의한 아파티닙 농도를 증가시다. 1개의 micromolar의 afatinib 농도가 도달하면, 세포가 아파티닙 저항을 개발했다는 것을 확인하기 위하여 입증된 대로 MTT 분석기를 수행합니다. 세포주에 대한 성장 곡선을 결정하기 위해, 배양 부모 PC-9 및 세포 배양 인큐베이터에서 성장 배지에서 3개의 아파티닙 내성 세포주 24시간.각 배양에서 세포를 성장 중간 농도의 밀리리터당 5배-10-3세포로 재보중단하고, 96웰 마이크로플레이트에서 각 세포 집단의 12 100마이크로리터 복제를 시트한다. 그런 다음 0일, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 동안 MTT 분석을 시연한 대로 수행하고 적절한 통계 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결과를 플롯합니다. 표피 성장 인자 수용체 또는 EGFR 게놈 DNA 발현의 변화를 규명하기 위해, 역전사 폴리머라제 사슬 분석에 의하여, 제조업체의 지시에 따라 DNA 정화 키트를 사용하여 관심 있는 세포 배양으로부터 게놈 DNA를 분리한다.분광계에서 격리된 게놈 DNA의 25나노그램 마이크로리터 농도의 농도를 측정합니다. 그런 다음 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 50 나노그램의 게놈 DNA를 증폭시키고 형광계 역실사 중 폴리머라제 중합체 연쇄 반응 검출 시스템을 사용하여 결과를 분석한다. EGFR 게놈 DNA 발현의 체질을 시퀀싱하여 식별하려면 EGFR 엑슨 19 에서 21까지 특정 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시한다.그런 다음 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 증폭된 PCR 제품을 정화하고 앰플리턴을 시퀀싱합니다. 서양 얼룩 분석에 의한 표피 성장 인자 수용체 단백질 발현의 변화를 식별하려면 24시간 동안 아파티닙으로 세포를 치료한다. 24시간 후, 세척당 배양당 5밀리리터의 얼음-차가운 PBS로 세포 배양을 2회 세척합니다.방사선 면역 강수량 분석 버퍼에서 세포를 lyse, 1 %의 프로테아제 억제제 칵테일과 인산 염 억제제 칵테일 2 및 3 섭씨 4도에서 30 분 보충. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 용액을 수집합니다. 용액 샘플의 단백질 농도를 결정하기 위해 bicinchoninic acid 분석기를 사용합니다.단백질 샘플을 마이크로리터 농도당 0.5 또는 마이크로그램 1개, 4-X 샘플 버퍼로 조정하고 샘플을 섭씨 96도에서 5분간 끓입니다. 시료의 서쪽 블롯 분석을 위해 에탄올 세척 유리 플레이트와 스페이서를 조립하고 적절한 실험 용 보충제로 8 % 폴리 아크릴 라미드 젤로 금형을적재합니다. 겔이 중합되는 동안, 적절한 금형에 스태킹 젤 용액을 추가하고 빗을 삽입하고 스태킹 젤이 실온에서 20~30분 동안 중합되도록 합니다.두 젤이 중합되면 전기 전구 장치에 배치하고 탱크를 실행 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 각 단백질 샘플의 20-30 마이크로리터 부피를 각 우물에 적재하고 180볼트에서 젤을 실행합니다. 약 60분 후에 전기전도를 멈추고, 염료 전면이 젤에서 흘러 나오면, 트웬으로 보충된 삼중 완충식식염으로 젤을 1~2분 간 세척합니다.단백질을 폴리비닐리덴 불소 막에 반건조 블로팅으로 1시간 1/2시간 동안 300밀리암페어의 일정한 전류로 전달한다. 실온에서 1시간 동안 트리스 버퍼식식염수와 트위엔 용액으로 희석된 5% 무지방 건조 우유로 멤브레인을 차단합니다. 다음으로, 하룻밤 사이에 4도에서 관심있는 적절한 항체로 멤브레인을 조사하십시오.다음 날 아침, 실온에서 1~1/2시간 동안 적절한 이차 항체에 멤브레인을 노출하기 전에 세척당 신선한 트리스 버퍼링 식염수 3개를 세척하여 멤브레인을 세척합니다. 그런 다음 세척당 신선한 트리스 버퍼식식염수로 멤브레인을 5번 세척하고 필름을 사용하여 신호 시각화를 위한 향상된 화학 발광 용액에 멤브레인을 노출시킵니다. 여기서, 아파티닙의 농도 증가에 대응하여 부모 PC-9 세포의 세포 증식에서 관찰되는 감소가 도시되고, PC-9 세포가 아파티닙 노출에 민감하다는 것을 확인한다.그러나, 3개의 아파티닙 저항하는 세포주 중 어느 것도 아파티닙 노출 하에서 세포 증식의 억제를 보여주지 않는다. Afatinib 내성 세포주 부모 PC-9 세포보다 크게 느린 성장 곡선을 나타낸다. 아파티닙 내성 세포는 부모 PC-9 세포보다 EGFR 게놈 DNA 및 EGFR 단백질 발현의 상당히 높은 수준을 표현한다.EGFR 시퀀싱은 PC-9 세포가 EGFR 엑슨(19)에서 15개의 염기 쌍 삭제, 그리고 엑슨(20)의 야생형 EGFR을 나타낸다는 것을 보여준다. 아파티닙 내성 1세포와 2개의 세포주 세포는, 그러나, 야생형 EGFR 엑온 19의 증폭을 나타낸다. 아파티닙 내성 세포주 3세포는 PC-9 세포와 같이 EGFR 엑슨 19에서 동일한 15개의 염기쌍 삭제를 함유하고 있으나, T790M의 포인트 돌연변이는 EGFR 엑슨 20에서 관찰된다.억제제 농도가 IC-50 값에 가까우면 세포 성장이 매우 느려질 수 있습니다. 세포가 점진적으로 확산되기 때문에 문화에 대해 논의하지 마십시오. 이러한 전략은 암 환자가 획득 한 저항 메커니즘을 평가하고 안전하고 효과적인 치료 전략을 개발하기 위해 임상 관련 저항을 개발하는 조건을 모방하기 위해 개발되었다.

establishment-characterization-three-afatinib-resistant-lung

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

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