Name: 单轴拉伸应变下活细胞核动力学的高分辨率成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习使用重新设计的聚二甲基硅氧烷基底和定制成像装置，在单轴拉伸应变下对贴壁细胞进行高分辨率活细胞核成像。该方法采用100倍油浸物镜实现亚细胞水平的动态观测。

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所有作者均感谢新加坡国家研究基金会通过新加坡-麻省理工学院科研与技术联盟（SMART）生物系统与微机械（BioSyM）跨学科研究小组提供的资金支持。Jagielska 博士和 Van Vliet 博士还感谢 Saks-Kavanaugh 基金会提供的资金与支持。作者感谢新加坡南洋理工大学的 William Ong 和 Chew Sing Yian 博士为本研究中部分实验提供了大鼠少突胶质前体细胞；同时感谢新加坡国立大学生物力学研究所的 G. V. Shivashankar 博士就核面积波动问题进行的讨论。

1. 用于高分辨率成像的单孔聚二甲基硅氧烷模具设计
注意：用于制造聚二甲基硅氧烷平板的模具设计具有以下特征，以支持使用100倍油浸镜头成像，并确保与定制应变装置的正确匹配（图1A、B）。
<ol>
	<li>保持整体载物板的尺寸，使其能够适配应变装置的夹具。 
	注：此处尺寸为 60 mm × 73 mm。</li>
	<li>设计一个细胞培养腔室或孔，其横向尺寸应显著小于整个载物板的尺寸，以避免在施加应变时聚二甲基硅氧烷（PDMS）载物板未夹持边缘处产生电弧（面外弯曲）效应。 
	注：此处腔室设计为 23 mm × 23 mm 的正方形。</li>
	<li>细胞培养腔室的深度应尽可能小（不超过 80 µm），以便通过置于腔室上方的盖玻片，使用 100 倍油浸物镜进行聚焦，同时深度需足以容纳培养基，并避免接触或挤压细胞。</li>
	<li>将细胞培养腔室置于一个高度为 3 mm 的正方形基座上，使细胞在倒置显微镜系统中更接近物镜，便于聚焦。 
	注：具有上述特征的模具可通过多种技术制造，例如铣削铝材。或者，也可使用激光切割的丙烯酸板、用于细胞腔室的 #0 盖玻片和超级胶水组装母模。该母模用于制作聚二甲基硅氧烷（PDMS）印模，再通过浇铸树脂制备工作模具。</li>
</ol>
2. 单孔聚二甲基硅氧烷板和方形隔室的制备
<ol>
	<li>在一次性杯子中按20:1（重量比）混合聚二甲基硅氧烷基础剂与固化剂。每个模具（用于制作一块聚二甲基硅氧烷板）称取共20 g聚二甲基硅氧烷，每直径150 mm的塑料培养皿（用于制作一批方形隔室）称取150 g聚二甲基硅氧烷。</li>
	<li>将聚二甲基硅氧烷混合物置于-0.8 bar的真空除泡器中30分钟（或直至所有气泡完全去除）。</li>
	<li>将聚二甲基硅氧烷混合物倒入模具（用于制板）或倒入直径150 mm的塑料培养皿（用于制备方形隔室）。</li>
	<li>在此阶段去除任何残留气泡，可通过吹气（用嘴吹）或再次将装有聚二甲基硅氧烷的模具/培养皿置于-0.8 bar真空条件下除泡30分钟。</li>
	<li>将模具/培养皿放置于80 °C烘箱内的水平台面上，加热&#160;2小时。</li>
	<li>小心地从烘箱中取出模具/培养皿，使其冷却至室温。用刀片小心切割边缘后，轻轻剥离出固化的聚二甲基硅氧烷（图1C）。</li>
	<li>在直径150 mm的聚二甲基硅氧烷表面用记号笔绘制2 cm × 2 cm的网格。在每个大方格内再绘制一个1 cm × 1 cm的正方形，四周各留出0.5 cm的边距。使用刀片沿划线仔细切割，得到方形隔室（图2A）。</li>
	<li>通过以下步骤清洗聚二甲基硅氧烷板/方形隔室：先在100%丙酮中孵育4&#160;小时，再在100%乙醇中孵育4&#160;小时，最后在高压灭菌水中孵育4&#160;小时。</li>
	<li>将聚二甲基硅氧烷板/方形隔室放置于直径150 mm塑料培养皿内的石蜡膜背衬纸（非石蜡膜本身，而是其背纸）上（图2C）。</li>
	<li>将聚二甲基硅氧烷板放入80 °C烘箱中干燥4&#160;小时。</li>
	<li>用石蜡膜密封装有聚二甲基硅氧烷板和方形隔室的直径150 mm培养皿，并将其储存在冷室中，待后续使用。</li>
</ol>
3. 聚二甲基硅氧烷板的功能化
<ol>
	<li>移除石蜡膜，取下塑料培养皿的盖子，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）板和方形隔室置于紫外光下照射30分钟。</li>
	<li>对聚二甲基硅氧烷（PDMS）板（细胞培养面朝上）进行等离子体处理（150 W，5分钟），不带方形隔室，以使培养表面具有亲水性。</li>
	<li>立即将方形隔室放置在经等离子体处理的表面上（图2B），手动按压使其暂时粘附在一起。 
	注意：不要对方形隔室进行等离子体处理，否则它们会牢固地粘附在聚二甲基硅氧烷（PDMS）板上，在成像时难以剥离。</li>
	<li>向孔中加入200 µL的100 mM (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，孵育2小时，以在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面引入–NH2基团。配制100 mM溶液时，将234 µL纯(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷溶解于10 mL去离子水中。孵育2小时后，用去离子水洗涤孔3次。</li>
	<li>称取2 mg分子交联剂双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（bissulfosuccinimidyl suberate），溶于700 µL的1 M (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液（pH 8.0）和2.8 mL水中。 
	注意：此操作将得到200 mM (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液中的1 mM双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（bissulfosuccinimidyl suberate）溶液。注意，50 mM浓度的缓冲液同样有效。
	<ol>
		<li>在每个聚二甲基硅氧烷（PDMS）板的孔中加入135 µL上述溶液和15 µL浓度为1 mg/mL的纤连蛋白，室温孵育4小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液洗涤3次。向孔中加入500 µL磷酸盐缓冲液。用石蜡膜覆盖含有聚二甲基硅氧烷（PDMS）的直径150 mm培养皿，并将其储存在冷藏室中，直至后续使用。</li>
</ol>
4. 塑料培养皿和培养瓶的功能化
<ol>
	<li>将塑料培养皿和培养瓶与5 µg/mL的多聚-D-赖氨酸（PDL，溶于无菌水）溶液在37°C孵育1小时。每35 mm直径的培养皿加入1.5 mL该溶液（配体），每60 mm直径的培养皿加入3 mL，每75 cm2培养瓶加入10 mL。</li>
	<li>用无菌水清洗培养皿和培养瓶两次。</li>
	<li>将其置于生物安全柜中干燥1小时（或直至完全干燥），并于4 °C冷藏室中保存，待后续使用。</li>
</ol>
5. 小鼠少突胶质前体细胞的增殖与分化培养基
<ol>
	<li>配制50 mL的100倍浓缩增殖和分化培养基，分装为每管2.5 mL，于-80 °C保存。 
	注意：增殖培养基的成分为：0.1 mg/mL牛血清白蛋白、62 ng/mL孕酮、16 µg/mL亚精胺、5 µg/mL胰岛素、50 µg/mL全转铁蛋白、5 ng/mL硒酸钠、1×青霉素-链霉素、10 ng/mL血小板源性生长因子和10 ng/mL成纤维细胞生长因子，溶于含高糖和丙酮酸的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。其中牛血清白蛋白、孕酮、亚精胺和硒酸钠可配制成100倍浓缩液并储存；而胰岛素、全转铁蛋白和青霉素-链霉素必须在配制1倍工作液时新鲜加入。生长因子需配制成10 µg/mL的储存液，并在每天换液时新鲜加入细胞培养体系中（每毫升培养基加入1 µL）。分化培养基的成分为：0.1 mg/mL牛血清白蛋白、62 ng/mL孕酮、16 µg/mL亚精胺、5 µg/mL胰岛素、50 µg/mL全转铁蛋白、5 ng/mL硒酸钠、1×青霉素-链霉素、400 ng/mL三碘甲腺原氨酸、400 ng/mL L-甲状腺素以及0.5%胎牛血清，溶于含高糖和丙酮酸的DMEM中。三碘甲腺原氨酸和L-甲状腺素可与其他试剂一同配制并作为100倍浓缩液储存。胰岛素、全转铁蛋白和青霉素-链霉素必须在配制1倍工作液时新鲜加入。</li>
	<li>配制50 mL的100倍浓缩增殖培养基时，将510 mg牛血清白蛋白溶于17 mL Dulbecco培养基中，310 µg孕酮溶于31 µL乙醇中，80 mg亚精胺溶于500 µL Dulbecco培养基中，25 µg硒酸钠溶于10 µL Dulbecco培养基中，最后用Dulbecco培养基定容至50 mL。</li>
	<li>配制50 mL的100倍浓缩分化培养基时，需额外将2 mg三碘甲腺原氨酸溶于40 µL氢氧化钠溶液中，2 mg L-甲状腺素溶于40 µL氢氧化钠溶液中，然后用Dulbecco培养基定容至50 mL。将溶液经无菌一次性滤器过滤，分装后于-80 °C保存。</li>
	<li>配制250 mL的1倍增殖或分化培养基时，取2.5 mL 100倍浓缩增殖或分化培养基，加入12.5 mg全转铁蛋白、125 µL 10 mg/mL胰岛素溶液和2.5 mL 100倍浓缩青霉素-链霉素溶液，用Dulbecco培养基定容至250 mL，并经无菌一次性滤器过滤。 
	注意：生长因子必须新鲜配制，并直接加入细胞培养体系中，不可加入整批重悬的培养基中。</li>
</ol>
6. 细胞培养
<ol>
	<li>以悬浮于增殖培养基中的少突胶质前体细胞起始。将这些细胞以 35,000 个细胞/cm2 的密度接种至多聚赖氨酸（PDL）包被的塑料表面（培养皿或培养瓶，参见第 4 节）。根据塑料基质的表面积，将增殖培养基的体积调整为每 10 cm2 表面积使用 3 mL；培养基体积过低可能导致因表面张力作用而引起细胞聚团，而体积过高则可能导致培养皿中培养基溢出。</li>
	<li>每天添加生长因子（血小板源性生长因子和纤连蛋白生长因子），维持其浓度为 10 ng/mL，并每隔一天更换一半的增殖培养基。</li>
	<li>在第 3 天，使用温和的细胞解离液（例如 accutase）将细胞从塑料表面解离：吸除培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤 1 次，每 20 cm2 面积加入 1 mL 解离液，将培养皿/培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟，轻轻敲击直至所有细胞脱落（在显微镜下观察确认）。</li>
	<li>使用 200 µL 枪头吹打以将细胞团块分散为单细胞，转移至 50 mL 离心管中，用增殖培养基稀释，以 0.2 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于增殖培养基中，最终体积为 1 mL。使用细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
	<li>用增殖培养基对经纤连蛋白功能化的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）培养板进行洗涤，每次 15 分钟，共洗两次。</li>
	<li>在每块聚二甲基硅氧烷培养板中加入 700 µL 增殖培养基，接种 35,000 个细胞。</li>
	<li>加入 H2B-GFP 质粒构建体，用于绿色荧光蛋白标记组蛋白 H2B。 
	注意：此处每块培养板加入 1.4 µL CellLight H2B-GFP BacMam2 转染混合液（每 50,000 个细胞加入 2 µL）。</li>
	<li>24 小时后，将带有细胞的聚二甲基硅氧烷样品安装至单轴拉伸装置上进行拉伸（如 图 2D 所示）。将所有样品中的培养基更换为分化培养基。</li>
	<li>为对样品施加应变，测量未拉伸状态下细胞腔室的长度（图 3A），并旋转显微镜载物台上的微米螺钉，使细胞腔室长度增加至目标值（例如 10%，参见 图 3B）。将拉伸与未拉伸的聚二甲基硅氧烷样品置于 37 °C 培养箱中孵育，直至成像。</li>
</ol>
7. 成像
<ol>
	<li>打开显微镜。将显微镜培养箱温度设置为 37 °C。</li>
	<li>将要使用的物镜（100x 油镜）转至中心位置，因为之后将无法操作物镜转盘。取下该物镜，并使用物镜环将其重新拧紧（图 4A），以便使物镜更接近细胞。若此处使用油镜，则在此步骤中滴加一滴镜油。</li>
	<li>预先通过 3D 打印或机械加工制备一个塑料或金属支架，该支架需具备两个关键特征——倾斜窗口和台阶（图 4B）。 
	注意：窗口用于支撑厚度为 #0 的玻璃盖玻片，以在拉伸装置处于倒置状态时承载培养基。窗口边缘的斜切设计（图 4D）可使物镜更接近玻璃盖玻片。支架中的台阶结构可使拉伸后的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）进一步下移，更接近物镜。</li>
	<li>在支架顶部表面的窗口周围涂抹真空脂，将一块玻璃盖玻片（厚度 #0，尺寸为 25 mm × 25 mm 或直径 35 mm）固定其上（图 4C），并用胶带将白色塑料窗口固定在显微镜载物台上（图 4D 和 图 5A）。</li>
	<li>将 z 轴平移台用螺丝固定在显微镜载物台上，并将其移至最高的 z 位置（图 5A）。</li>
	<li>从待成像的拉伸聚二甲基硅氧烷培养板中移取 500 µL 培养基，并将其滴加至白色塑料窗口中的玻璃盖玻片上。</li>
	<li>用无菌镊子小心地将方形培养室从聚二甲基硅氧烷板上分离。</li>
	<li>将拉伸装置保持直立状态（细胞面朝上）置于白色塑料窗口上方，然后小心地将其翻转，使多余的培养基直接滴落在玻璃盖玻片中央（图 5B）（细胞面朝下）。</li>
	<li>使用双面胶带将拉伸装置的底座部分固定在 z 轴平移台上（图 5C、D）。</li>
	<li>通过目镜在明场下观察，缓慢降低拉伸装置（图 5E）（通过降低 z 轴平移台），同时上移物镜以对细胞进行聚焦。
	<ol>
		<li>此步骤需极其缓慢、逐步进行。若拉伸装置对盖玻片压力过大，可能导致细胞受压（引起细胞死亡）；若物镜对盖玻片压力过大，则可能导致盖玻片破裂（造成培养基泄漏并污染物镜）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 x 和 y 方向上扫描聚二甲基硅氧烷板，寻找具有荧光细胞核（在 488 nm 波长激发下的落射荧光下）且细胞形态合适的细胞（在明场下）。</li>
	<li>若显微镜载物台的横向移动对垂直聚焦影响不大，可使用软件中的多点功能选择多个感兴趣区域。有时，聚焦对载物台的任何横向位移极为敏感。在此类情况下，应逐个成像单个细胞。标记每个感兴趣细胞的 x、y 和 z 位置。</li>
	<li>以 488 nm 波长激发记录细胞核的宽场（或开针孔）图像，同时以明场激发记录细胞图像，每帧间隔 30 秒，总时长至少 30 分钟。</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>细胞核波动
	<ol>
		<li>在图像分析软件中打开细胞核图像序列（图6A），并对细胞核的时间序列图像进行阈值处理（例如，在ImageJ中使用Threshold命令，或在MATLAB软件中使用Graythresh命令）。</li>
		<li>获取细胞核面积（以像素为单位）随时间变化的数据，在数据绘图软件中绘制该曲线（图6B），并对数据拟合三阶多项式（图6C）（例如，在Origin软件中使用Analysis | Fitting | Polynomial Fit命令，或在MATLAB软件中使用Polyfit命令）。</li>
		<li>从每个时间点的实际面积（以像素为单位）中减去拟合多项式的值。该校正后的面积称为残差面积。 
		注：此过程可消除由仪器误差引起的趋势性上升或下降，称为去趋势化。
		<ol>
			<li>通过将每个时间点的残差面积除以该时间点拟合多项式的值，计算残差面积的百分比（图6D）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算残差面积时间序列的标准差。该标准差表示细胞核波动的振幅。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据绘图与统计分析
	<ol>
		<li>以每种条件下至少20个细胞核的平均值计算细胞核波动的振幅。</li>
		<li>采用带Bonferroni校正的单因素方差分析（one-way ANOVA）统计检验，判断不同实验条件（例如，施加应变与未施加应变）下波动振幅是否存在显著差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此前已设计出一种用于对贴壁细胞施加细胞外张应力的装置1。在之前的研究中，聚二甲基硅氧烷基底的设计足以满足生化检测以及对拉伸细胞进行低分辨率成像的需求。在本研究中，对该基底进行了重新设计，并引入了一种新型成像构型，可实现高分辨率的亚细胞活细胞成像。该系统具有诸多优势：可在实验室内使用简单组件自行搭建，与商用应变装置相比成本低廉（每台细胞应变装置约500美元），且体积小巧，可放入组织培养孵育箱内，并适配于显微镜。此外，尽管本文所述成像系统采用倒置显微镜配置，但也可方便地调整为正置显微镜配置。
样本制备和成像过程中有几个关键步骤需要注意。首先，在接种细胞前（方案步骤2.8），必须彻底清洁聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）平板和方形腔室，以确保细胞存活（因为未固化的聚二甲基硅氧烷对细胞具有毒性）。其次，由于方形腔室内可容纳的液体培养基体积小于1 mL，若样品在培养箱中放置数天，培养基可能发生蒸发。因此，必须每天检查培养基情况，并在需要时及时补充。此外，可将一个倒置的直径60 mm塑料培养皿覆盖在聚二甲基硅氧烷平板的凸起...

机体内的细胞和组织会受到各种力学信号的作用，包括拉伸应变。然而，这些力学信号对神经细胞生物学特性的影响尚未得到充分研究和深入理解。在中枢神经系统中，力学应变的来源包括发育过程中的生长1,2,3,4、生理过程（如脊髓弯曲、血液和脑脊液搏动）以及病理状态（如创伤、轴突肿胀、胶质瘢痕或肿瘤生长）5,6,7,8。研究拉伸应变如何影响少突胶质细胞的分化及其后续对轴突的髓鞘化过程具有重要意义，因为这一过程在脊椎动物的中枢神经系统中至关重要。以往的研究9,10利用定制的拉伸装置和弹性多孔培养板表明，静态单轴拉伸可通过基因表达的整体变化促进少突胶质细胞的分化10。为了进一步阐明这些细胞中力学应变转导的机制，有必要对先前的实验装置进行重新设计，以便在拉伸条件下对活细胞的核动态进行高分辨率荧光成像。本文介绍了一种单孔聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）培养板的开发，并重新设计了成像构型，使能够在拉伸条件下使用100倍油浸物镜对活细胞进行延时成像。为消除聚二甲基硅氧烷在光路中的不利光学效应，细胞并非通过聚二甲基硅氧烷板进行成像，而是将培养装置倒置，通过覆盖细胞腔室的盖玻片进行成像。利用这种新的成像设计，记录了数百个高分辨率的延时影像，这些影像来自完整贴壁细胞中单个细胞核，其中染色质通过组蛋白H2B与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）融合标记。这些影像表明，拉伸应变可诱导染色质结构和动态发生改变，这些改变与少突胶质细胞分化的进程一致。
在施加应变条件下进行活细胞成像在技术上具有挑战性，需要设计与显微镜系统兼容的装置。本文所述的定制设计为商用解决方案提供了一种低成本的替代方案。该装置的尺寸使其可安装于显微镜载物台上，并在施加应变的同时实现高空间分辨率的活细胞成像。成像系统设计为可通过盖玻片、而非通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）板层进行成像，从而利用100倍油镜实现最高清晰度的观察；而大多数应变条件下的成像系统通常需透过PDMS层成像，会降低图像质量。该装置连同装载细胞的培养板可方便地存放于培养箱中。本装置旨在对支持贴壁细胞培养的基底施加单轴应变，并可在数天内维持稳定且均匀的应变。本文所述的装置可用于在应变条件下对多种贴壁细胞类型进行高分辨率成像，因而适用于细胞力学生物学多个领域的力传导研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;原代细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>从新生大鼠中分离的原代少突胶质前体细胞&lt;br/&gt;由新加坡南洋理工大学S. Y. Chew博士实验室提供</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM高&amp;nbsp;糖</td><td>Gibco</td><td>11996-065-500ml</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Gibco</td><td>15070-063-100ml</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-608-50ug</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-776-10ug</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基储备液组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P8783-1G</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸</td><td>Sigma</td><td>T6397-100MG</td><td></td></tr><tr><td>甲状腺素</td><td>Sigma</td><td>T1775-100MG</td><td></td></tr><tr><td>全转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>模具与PDMS平板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS - Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>模具 - 液态塑料</td><td>Smooth-On</td><td>Smooth Cast 310 - 试用装</td><td></td></tr><tr><td>基底包被</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141-2MG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组蛋白染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellLight H2B-GFP BacMam</td><td>Molecular Probes</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;表面功能化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>A3648-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BS3</td><td>Covachem</td><td>13306-100mg</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液 pH 8.0</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63578-AK-250ml</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞解离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501-100ml</td><td></td></tr></tbody></table>

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

已知细胞外机械应变可引发细胞表型响应，并在多种组织系统中具有生理相关性。为了通过生化检测在体外捕获施加的细胞外张应力对细胞群体的影响，此前已设计出一种装置，该装置结构简单、易于制备，且体积足够小，可放入组织培养孵育箱内，也可置于显微镜载物台上。然而，先前设计的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底不支持通过油浸物镜进行高分辨率亚细胞成像。本研究描述了一种重新设计的聚二甲基硅氧烷基底几何结构以及一种定制的成像系统，二者结合可在施加应变的同时实现活细胞的高分辨率亚细胞成像。该基底可与先前设计的同一装置配合使用，因此除支持高分辨率光学成像外，仍具备上述所有优点。通过在基底中引入网格结构，可进一步优化聚二甲基硅氧烷基底的设计，便于在施加应变前后追踪同一细胞。代表性结果展示了利用本文所述方法获取的受应变细胞中荧光标记细胞核的高分辨率延时成像。这些细胞核动态数据为张应力促进少突胶质前体细胞分化的机制提供了深入见解。&#160;

最近的研究旨在探究拉伸应变对少突胶质细胞的影响10，结果表明，10% 的单轴拉伸应变可通过全局基因表达的变化促进少突胶质细胞前体细胞的分化。这些基因表达变化背后的机制可通过成像亚细胞参数来探究，例如细胞骨架结构、转录因子定位、细胞核动态以及染色质结构。然而，此前使用的聚二甲基硅氧烷基底的几何形状无法实现高分辨率的单细胞成像。如本研究所述，重新设计的聚二甲基硅氧烷基底几何结构与成像装置可最大限度地缩短细胞与物镜之间的距离，从而能够使用100倍油浸物镜捕获荧光标记的细胞核的时间序列图像（图6A）。
细胞核投影面积的波动程度取决于细胞的分化状态11,12。少突胶质前体细胞与终末分化少突胶质细胞的细胞核波动性比较显示，后者波动性显著降低（...

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。

已知细胞外机械应变可引发细胞表型反应，并在多种组织系统中具有生理相关性。为捕捉……

我们此前已设计了一种用于对贴壁细胞施加机械应变的装置。在本研究中，我们重新设计了基底的几何结构，并对装置进行了定制化改进，以实现对这些应变细胞的高分辨率成像。该细胞拉伸系统的主要优势在于，能够对处于应变状态的细胞进行100倍放大下的高分辨率亚细胞成像。由我实验室的研究助理Vicki演示基底的制备过程。首先，参照随附的文字方案设计一个单孔聚二甲基硅氧烷模具。接着，在一次性杯子中将20份聚二甲基硅氧烷基料与1份固化剂混合均匀。混合后，将聚二甲基硅氧烷混合物置于0.8 bar的真空除泡器中30分钟，以去除混合物中的气泡。然后将聚二甲基硅氧烷混合物倒入模具和培养皿中。此阶段再次于0.8 bar真空条件下脱气30分钟，以除去残留的气泡。脱气完成后，在水平台上将样品于 80 摄氏度烘烤两小时。接着，小心地将样品从烘箱中取出，使其冷却至室温。用刀片切去边缘，然后轻轻剥离出固化的聚二甲基硅氧烷。在直径为150毫米的聚二甲基硅氧烷上，用记号笔绘制一个2厘米×2厘米的网格。在每个方格内，绘制一个1厘米×1厘米的小方格，四周保留0.5厘米的边距。使用刀片沿线条仔细切割，得到方形隔室。接下来，将样品依次在100%丙酮中孵育4小时，再在100%乙醇中孵育4小时，随后在高压灭菌水中孵育4小时，以进行清洗。将清洗后的样品置于直径150毫米的塑料培养皿内铺有石蜡膜背衬纸的表面上，并在80°C烘箱中干燥4小时。完成后，用石蜡膜密封培养皿，并将样品置于冷藏室中保存，直至后续使用。准备前体细胞，并将其悬浮于增殖培养基中。以每平方厘米35,000个细胞的密度将这些细胞接种至多聚赖氨酸（PDL）包被的塑料表面。根据表面积，每10平方厘米加入3毫升增殖培养基，调整培养液体积。培养基体积过少可能导致细胞聚集，这是由于表面张力作用所致；而培养皿中培养基过多则可能导致液体溢出。接种后第三天，收集细胞并使用血细胞计数板进行计数。随后，将35,000个细胞接种至每个含700 µL增殖培养基的聚二甲基硅氧烷（PDMS）板中。接着，按照制造商的说明，加入质粒构建体，用绿色荧光蛋白标记细胞的组蛋白 H2B 复合物。24 小时后，将带有细胞的聚二甲基硅氧烷样品安装到单轴拉伸装置上。然后，将所有样品中的培养基更换为诱导分化培养基。测量未受应变的细胞腔室长度，并转动显微镜载物台微调螺丝，将细胞腔室长度增加至所需的应变程度。将拉伸和未拉伸的聚二甲基硅氧烷样品置于37摄氏度培养箱中，直至成像。通过将显微镜培养箱温度设定为37摄氏度，准备用于活细胞成像的显微镜培养系统。接下来，将100倍油镜物镜移至中心位置，因为后续将无法再调整物镜转盘。物镜到位后，先将其卸下，然后与一个物镜环重新旋紧安装，以便使物镜更接近细胞。随后，在物镜上滴加一滴镜油。使用定制打印的样品槽，在窗口边缘涂抹真空脂，并将一片厚度为零的玻璃盖玻片放置在样品槽的顶面。用胶带将塑料窗口固定在显微镜载物台上。接着，将Z轴平移台旋紧在显微镜载物台上，并将其移至最高的Z位置。从待成像的拉伸聚二甲基硅氧烷板中移除 500 微升培养基，并将此培养基加入白色塑料窗孔内的玻璃盖玻片上。然后，使用一对无菌镊子小心地将方形腔室从聚二甲基硅氧烷板上分离。将拉伸装置保持直立，使细胞朝上，位于白色塑料窗孔上方，再小心翻转拉伸装置，使多余的培养基直接滴落在玻璃盖玻片中央，此时细胞朝下。使用双面胶带将应变装置的底部固定在Z轴平移台上。在明场下通过目镜观察，非常缓慢地降低应变装置，同时提升物镜以对细胞进行聚焦。此聚焦过程应缓慢进行，交替降低Z轴平移台和升高物镜。如果Z轴平移台下降过多，细胞可能会受压而死亡。如果将物镜抬得过高，则可能压碎玻璃盖玻片，导致培养基泄漏。使用488纳米激发光进行落射荧光观察，同时在X和Y方向扫描聚二甲基硅氧烷（PDMS）板，以寻找具有荧光细胞核的细胞。同时，在明场下观察样本时，确保细胞具有适当的形态。使用488纳米波长激发，以每帧30秒的间隔，对细胞核进行宽场或针孔全开成像，同时对细胞进行明场激发成像，总时长至少30分钟。本视频中展示的聚二甲基硅氧烷基底的重新设计几何结构以及成像装置，可最大限度缩短细胞与物镜之间的距离。这使得能够使用100倍油浸物镜对荧光标记的细胞核进行延时成像。为测量细胞核的波动，首先绘制细胞核面积随时间变化的曲线，然后使用三阶多项式对数据进行去趋势处理。最后，绘制残差波动图并计算残差波动的标准差。少突胶质前体细胞在化学诱导分化后（有或无10%拉伸应变）的细胞核波动结果显示：仅使用化学诱导时，细胞核波动幅度在48小时显著降低，但在24小时无显著变化；而化学诱导结合10%拉伸应变时，细胞核波动幅度在24小时即显著降低，并在48小时维持该水平，未进一步下降。需要牢记的最重要一点是，所选物镜的工作距离应等于或大于细胞腔室的深度加上盖玻片的厚度。可对基底进行重新设计，加入网格结构，以便在施加应变前后对同一细胞进行成像，因为前后对比类型的数据集能够减少来自实验误差的噪声。利用此成像装置，可在施加机械应变后的数秒内，对贴壁活细胞内的多种亚细胞现象（如蛋白质定位或细胞组分的动态变化）进行成像。

high-resolution-imaging-nuclear-dynamics-live-cells-under-uniaxial

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

单轴拉伸应变下活细胞核动力学的高分辨率成像

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。...

探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。...

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

在本实验方案中，我们描述了一种使用微移液管的方法，可直接对活细胞中的细胞核施加可控的力。该检测方法可用于研究活体贴壁细胞中细胞核的力学特性。...

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

骨骼肌分化是一个高度动态的过程，尤其依赖于细胞核的定位。本文介绍了一种通过活细胞成像技术在成肌细胞分化及肌管形成过程中追踪细胞核运动的方法，并通过自动追踪获取的信息对细胞核动态进行定量表征。...

利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。...

利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。...

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

本文介绍了一种多功能等双轴拉伸装置，该装置由气动驱动，且兼容高分辨率显微镜成像。...

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

本文介绍了一种新型装置，该装置能够在支持细胞于刚度可调且蛋白基质可定制的基底上培养的同时，向细胞施加各向同性和单轴应变波形。这一结构简单且经济的实验平台使研究人员能够在基础研究和与疾病相关的环境中探究机械信号如何调控细胞功能。...

一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥...

发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

学习使用重新设计的聚二甲基硅氧烷基底和定制成像装置，在单轴拉伸应变下对贴壁细胞进行高分辨率活细胞核成像。该方法采用100倍油浸物镜实现亚细胞水平的动态观测。

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

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