Name: 하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 하악 및 파타액 땀샘의 유기 유형 배양을 이용한 방사선 치료 효과 평가 방법을. 이 기술은 치료 화합물 선별과 조직 손상 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 애리조나 대학 연구 및 발견의 대학과 건강의 국립 연구소에서 제공 하는 파일럿 기금에 의해 부분적으로 지원 되었다 (R01 DE023534) 키 어스 틴. 암 생물학 연수 교부 금, T32CA009213, 원 유 웡에 대 한 급여를 제공 했다. 저자는 그의 귀중 한 기술 공헌에 대 한 m. 쌀에 감사 하 고 싶습니다.

1. 진동의 제조
<ol><li>완충 트레이, 블레이드 부착, 아가 로스 블록 몰드 및 실험실 필름을 포함 하 여 진동의 분리 가능한 구성품을 70% 에탄올로 분무 한 다음 적어도 30 분 동안 자외선 살 균 합니다.</li>
	<li>얼음이 떨어지는 것을 막기 위해 추가의 실험실 필름을 완충 트레이에 놓고 고정 하십시오.</li>
	<li>얼음 실에 분쇄 된 얼음을 채우고 버퍼 트레이에서 실험실 필름을 제거 하 고 1% 페니실린-streptomycin-앰 피 실린 (PSA)로 보충 되는 100 mL의 얼음 차가운 1x 인산 완충 식 염 액 (PBS) 용액으로 완충 트레이를 채웁니다.</li>
	<li>스테인레스 스틸 면도날을 블레이드 홀더에 넣습니다. 스크루 드라이버를 사용 하 여 블레이드의 각도를 강화/풀고 변경 합니다.</li>
</ol>2. 진동 체를 사용 하 여 아가 로스 블록 및 절편으로 조직 샘플의 제조
<ol><li>집게,가 위 및 페인트 브러시를 포함 하 여 필요한 모든 해 부 및 절편 도구를 오토 클레이 브.</li>
	<li>3% 낮은 융 점 아가 로스를 멸 균 된 1x PBS로 준비 하 고 아가 로스가 용액에 녹을 때까지 전자 레인지에 넣습니다. 용액이 끓이 지 않는지 확인 하 고 병을 주기적으로 소용돌이치 세요. 참고: 저 융 점 오 스를 따뜻한 수조에 보관 하 여 응고 시키는 것을 방지 하십시오. 저 용융 아가 로스는 37 ° c에서 유체 이며 25°c에서 설정 합니다. 그러나, 수 욕은 생리 적 온도에서 조직 주위에 아가 로스를 부 어 하기 위해 40 ° c이 하 이어야 한다.</li>
	<li>침 샘을 분리 하 고 하 부 조직을 2 mL 아이스 콜드 1x PBS에 넣고 1% PSA로 보충 한 후 30 mm의 무 균 배양 접시에 넣습니다.</li>
	<li>멸 균 핀셋을 사용 하 여 1pb+1% PSA 솔루션에서 침 샘을 제거 하 고 임베딩 몰드 하단에 위치 시킵니다. 조직을 커버 하는 액체 3% 낮은 융 점 아가 로스로 금형을 채 웁 니다.</li>
	<li>포 셉을 사용 하 여 조직을 블록의 중간으로 조정 하 고 침 샘을 적절 한 평면에 놓습니다. 하 악 및 파 니 스 땀 샘에 대 한 최적의 횡단면은 수직 평면에 있습니다.</li>
	<li>아가 로스 블록을 얼음에 10 분 동안 넣고 굳 힙 니다.</li>
	<li>조심 스럽게 아가 로스의 바깥 가장자리 주위에 면도날을 실행 하 여 느슨하게 하 고 블록을 1.1 단계에서 UV 멸 균 된 실험실 필름 위로 밀어 넣으십시오.</li>
	<li>면도날을 사용 하 여 타 액 샘이 들어 있는 아가 로스 상자를 잘라냅니다. 단면의 평면이 직선 이며 블록의 반대쪽 (아래로 붙일 서피스)에 평행 인지 확인 합니다. 아가 로스가 조직에 침투 하지 않기 때문에 조직이 잘 지원 될 수 있도록 조직 주위에 너무 많은 아가 로스를 트리밍 하지 마십시오.</li>
	<li>절단 표면에 블록을 부착 하려면 수퍼 접착제를 사용 합니다.</li>
	<li>50 µm 또는 90 µm 두께 0.075 mm/s의 속도 및 100 Hz의 주파수에서의 진동. 주: 가장 높은 주파수와 가장 낮은 블레이드 속도로 진동을 설정 하면 최적의 슬라이스를 제공 합니다.</li>
	<li>무 균 성을 유지 하기 위해 슬라이스 컬렉션 사이에 70%의 에탄올에 브러시를 배치 하 고, 오토 클레이 브, 천연 헤어 브러시를 사용 하 여 잘 1 mL 얼음 차가운 PBS를 포함 하는 24 웰 조직 배양 접시에 섹션을 수집 합니다.</li>
</ol>3. 배양 섹션
<ol><li>마이크로-주걱 및 집게를 오토 클레이 브.</li>
	<li>소 태아를 포함 하거나 없이 스톡 진동 배양 배지 만들기 세럼 (FBS): 1% PSA, 5µ g/mL 트랜스 페 린으로 보충 되는 DMEM/F12 미디어, 1.1 µ M 하이드로 코르 티 손, 0.1 µ M 레 틴 산, 5 80 µ 표 피 성장 인자, 5mm L 글루타민, 50 µ 겐 타 마이 신 설 페이트 및 10 µ L/mL 미 량 원소 혼합물. 적절 한 양의 FBS를 추가 하 여 0%, 2.5%, 5.0% 또는 10% 솔루션을 만듭니다.</li>
	<li>절편 하기 전에, 미리 데워 진 매체의 300 μ l를 추가 하 고 직경 12mm, 0.4 µm 기 공 크기 멤브레인을 24 웰 조직 배양 판의 각 웰에 삽입 합니다. 매체는 배양을 위한 액체 공기 인터페이스를 만들기 위해 멤브레인 바닥에 도달 해야 합니다.</li>
	<li>37 ° c에서 마이크로 주걱 및 배양 액을 사용 하 여 멤브레인 인서트의 상단에 침 섹션을 부드럽게가 습 5 % co2 및 95% 공기 분위기 인큐베이터에 놓는다.<ol>
<li>약 300 μ l의 1 차 배양 배지를 웰에 넣고 멤브레인 인서트 (약 40 μ l)에 몇 방울 떨어뜨려 서 또는 필요에 따라 매일 첨가 하십시오. 적절 한 배양은 세포가 최대 30 일 전 생체 내에서 생존 하 고 유지 될 수 있음을 보여주었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 침 샘 섹션의 조사
<ol><li>코발트-60 (또는이에 상응 하는) 조사 기를 사용 하 여 단일 용량의 방사선 (5Gy)으로 섹션을 처리 합니다.<ol>
<li>온도 변동을 방지 하기 위해 지붕이 있는 스티로폼 용기를 사용 하 여 방사선 조사 시설에 운송 섹션을 전송 합니다. 또한, 미디어가 배양 뚜껑에 튀 지 않고 오염을 유도 하지 않도록 실험실 인큐베이터로 반송 하는 동안 주의가 필요 합니다.</li>
		<li>침 샘 섹션을 포함 하는 24 웰 플레이트를 방사선 공급원에서 80 센티미터, 32 "x 32" 방사선 분야의 중심에 배치 합니다. 방사선 량 계산 및 조사 기의 해당 시간은 계측기와 코발트-60 붕괴에 따라 달라 집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섹션 3에 설명 된 대로 이러한 섹션을 계속 모니터링 하 고 배양 합니다.</li>
</ol>5. 생존 염색
<ol><li>오래 된 미디어를 흡 기 하 고 멸 균으로 두 번 슬라이스를 세척, 미리 따뜻하게 1x PBS.</li>
	<li>염색 부분에는 트리 판 블루 염료가 있습니다.<ol>
<li>마이크로 주걱을 사용 하 여 문화에서 유리 슬라이드로 슬라이스를 이동 합니다.</li>
		<li>조직 (10 ~ 20 µ L)을 커버 하기에 충분 한 부피의 진동에 0.4% 트리 판 블루 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>염료가 조직에 침투 하기 위해 트리 판 분 동안 실 온 (RT)에서 슬라이스를 배양 합니다. 생존 하지 않은 세포는 청색으로 얼룩진 것 이며, 생존 가능한 세포는 얼룩 지지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼룩 부분은 칼 세 인, AM 살 세포 염료입니다.<ol>
<li>24 웰 플레이트 (µ L)의 한 우물에서 부분을 커버 하기 위해 충분 한 양의 얼룩을 추가 하십시오.</li>
		<li>염료 침투가 가능 하도록 RT에서 15 분 동안 슬라이스를 배양 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 우물에서 섹션을 제거 하 고 유리 슬라이드에 놓습니다. 마운팅 미디어 1 방울로 슬라이스를 마운트합니다.</li>
		<li>488 nm 및 515 nm의 여기/방출 파장의 형광 현미경에 대 한 이미지 섹션.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 항 체 염색 진동 섹션
참고: 다음은 Ki-67에 특이 적인 일반적인 항 체 염색 프로토콜을 제공 합니다. 그러나,이 프로토콜은 임의의 항 체와 함께 사용 될 수 있다. 별도의 언급이 없는 한 모든 세척은 RT에서 진행 됩니다.
<ol><li>다중 우물 조직 배양 접시에, 미디어를 흡 인 하 고 멸 균 1x PBS로 적어도 2 배를 씻으십시오.</li>
	<li>4°c에서 밤새 4% 파라 포름알데히드 (PFA)를 사용 하 여 섹션을 수정 합니다.</li>
	<li>4% PFA를 흡 기 하 고 PBT를 사용 하 여 3 배를 세척 하 고, 0.1% 트리톤 X-100). 참고: 섹션은 4°c에서 1x PBS에 저장 하 고 나중에 염색 할 수 있습니다. 이 원고에서 테스트 한 최대 보관 시간은 3 주 였습니다. 필요한 경우 개별 사용자가 더 긴 저장 시간을 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>0.3% 트리톤 X-100을 사용 하 여 30 분 동안 1 PBS에서의 투과 섹션 참고:이 단계는 특정 항 체 염색 및 투과를 위해 수정 및 최적화 될 수 있습니다.</li>
	<li>의 침투를 차단 합니다.</li>
	<li>1% BSA와 0.1% 트리톤 X 100 (PBT)와 함께 5 분 동안 슬라이스 3x를 씻으십시오.</li>
	<li>1% 정상 염소 세럼 1%로 차단 제로 슬라이스를 차단 합니다.</li>
	<li>PBT로 5 분 동안 슬라이스 3x를 씻으십시오.</li>
	<li>1% BSA에서 500 µ L 항 Ki67 토끼 단 클론 항 체를 1x PBS로 희석 하 여 4°c에서 밤새 슬라이스를 배양 한다. 참고: phalloidin 염색에 대 한, 6.9 단계를 건너 뛰고 특정 phalloidin에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 계속. DNA 반대 얼룩의 경우, 6.15 단계로 건너뜁니다.</li>
	<li>Ki67 토끼 단 클론 항 체를 흡입 합니다.</li>
	<li>1x PBS에서 5 분 동안 슬라이스 6 배를 씻으십시오.</li>
	<li>Ki67 항 체와 호환 되는 형광 공액 2 차 항 체의 500 µ L의 슬라이스를 1.5 h의 RT에서 1% BSA에 1x PBS로 희석 하 여 배양 하 여 빛 으로부터 보호 한다. 주: 사용 되는 이차 항 체에 기초 하 여, 이차 항 체와의 인큐베이션 시간은 개별 사용자에 의해 더욱 최적화 될 수 있다. 또한, 2 차 항 체는 광 감 응 이다. 모든 후속 세척은 어둠 속에서 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>2 차 항 체를 흡 기.</li>
	<li>1x PBS로 5 분 동안 슬라이스를 3 배 씻으십시오.</li>
	<li>탈 이온 수에서 5 분간 슬라이스를 씻으십시오.</li>
	<li>RT에서 20 분 동안 DAPI (1 µ를 사용 하 여 슬라이스를 반염색 합니다.</li>
	<li>슬라이스 (한 번)를 탈 이온 수에서 5 분간 씻으십시오.</li>
	<li>장착 용지의 한 방울 (~ 40 µ L)으로 슬라이스를 마운트합니다. 과잉 기포를 방지 하려면 45 ° 각도로 시작 하 여 슬라이드의 마운팅 미디어에 커버 슬립을 천천히 놓습니다.<ol>
<li>커버 슬립으로 두꺼운 부분을 분쇄 하는 것을 방지 하려면 각 슬라이스를 스페이서와 함께 장착 합니다. 스페이서는 조직 섹션 주위에 있는 정사각형에 진공 그리스의 테두리를 배치 하 여 만들 수 있습니다.</li>
		<li>커버 슬립을 배치할 때 커버 슬립의 가장자리를 진공 그리스로 밀봉 할 수 있습니다. 엄지 손가락으로 커버 슬립의 가장자리를 아래로 눌러 슬라이드에 단단히 부착 합니다. 또는 투명 매니큐어를 사용 하 여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 밀봉 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 이미징 진동 섹션
<ol><li>염색 후 5 일 이내에 염색 된 슬라이드를 이미지 합니다.</li>
	<li>공초점 현미경을 이용 하 여 스테인드 진동 조각의 광학 단면을 얻는다. 공초점 현미경을 사용 하 여 정의 된 스텝 사이즈로 z-스택을 획득 하거나 사용자의 실험 설계에 따라 개별 이미지를 촬영 합니다. 공초점 수집 후 모든 컴퓨터 화면에서 이미지를 검사할 수 있습니다. 참고: 진동 슬라이스 두께 때문에 공초점 현미경 또는 z-스택 기능이 있는 스코프를 사용 하 여 샘플 내 세부 사항을 시각화할 것을 권장 합니다. 이 원고에 사용 된 이미지의 경우 63x 오일 목표가 사용 되었습니다. 그러나이는 개별 사용자 및 사용 된 특정 범위에 따라 조정 되 고 추가로 수정 될 수 있습니다. 가장 작은 광학적으로 확인 가능한 구조에 대해 X 및 Y에서 2.5 픽셀의 추정 된 나이 퀴 스 트 샘플링을 사용 하 여 각 대물 렌즈 및 확대/축소 계수에 권장 되는 픽셀 해상도. 그러나 일부 주석 가들은 2.3 픽셀을 제안 하 고 나머지는 2.8 픽셀을 제안 합니다. 이러한 계산을 수행 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 생물학적 공초점 현미경 안내서 (22 )를 참조 하십시오.</li>
</ol>

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타 액 선 연구는 불멸 화 된 2-d 배양 물, 일차 2-d 배양 물, 3 차원 살 균 구 배양 물, 기저 생물학 및 생리학에 대 한 질문을 확인 하기 위해 배아에서의 3 차원 장기 배양을 포함 한 다양 한 문화권 모델을 활용 하 고 있습니다. 이러한 문화 모델 연구 질문의 다양 한 배열에 걸쳐 통찰력 있는 정보를 굴복 하 고 침 연구에서 중요 한 도구를 계속 됩니다. 이러한 배양 모델의 한계는 불멸 화 동안의 p53 활성의 변조, 일차 배양의 일시적인 생존 능력, 분화 및 분 비 단백질의 손실 및 세포 세포, 세포-ECM 및 극성을 평가 하는 무 능력을 포함 한다 성인 조직에서의 상호 작용. 첫 번째 3 차원 유기 형 슬라이스 배양 (진동으로 단면화 된 배양 물) 침 샘에 대 한 방법은 200818에 출판 되었다; 그러나이 기술은 다른 분야에서 빈번 하 게 사용 함에도 불구 하 고이 필드에서 크게 미달 되었습니다. 48 h에 대 한 작업 배양 된이 섹션은 방사선 치료 후 만성 효과에 ...

적절 한 타 액 선 기능은 구강 건강에 필수적 이며 방사선 요법으로 머리와 목 암 치료 다음에 변경 됩니다1. 2017에서, 머리와 목 암의 거의 5만 새로운 케이스는 미국에서 보고 되었다2. 침 샘과 같은 주변 정상 조직에 대 한 방사선 요법의 조직 손상 및 자주 돌이킬 수 없는 효과로 인해, 환자는 종종 심각한 부작용으로 남아 있고 삶의 질을 감소2,3, 4. 방사선 손상으로 인 한 일반적인 합병증은 xerostomia (구강 건조의 주관적인 느낌), 치아 우 식, 씹는 것과 삼 킴, 음성 장애 및 손상 된 경구 마이크로 바이오 메스2 와 같은 증상에서 나타난다 3 , 4.이 현상은 집단적으로 영향 받은 개별에 있는 영양실조 그리고 손상 한 생존에 지도할 수 있습니다5. 이 인구의 침 샘 기능 장애는 잘 문서화 되었지만, 포상 세포에 대 한 손상의 근본적인 기전이 논란이 되었으며, 다른 동물 모델 들 사이에는 약간의 통합이 있다6,7.
침 샘 기능 및 방사선 유발 손상 연구의 현재 방법은 생체 내 모델의 사용을 포함, 불멸의 세포 주, 2 차원 (2-d) 일차 세포 배양 물 및 3 차원 (3-d) 살 리 구 균 배양 물8, 10,11,12. 전통적으로, 불멸의 세포 라인과 2 차원 배양에서 세포 배양 모델은 평평한 표면에 배양 된 단일 층 세포를 포함 하 고 빠르고, 쉽고, 비용 효율적인 실험에 대 한 가치가 있다. 그러나, 인공 세포 배양 조건은 다양 한 조건에 노출 된 세포의 분화 상태 및 생리 적 반응을 변화 시킬 수 있으며, 그 결과는 종종 전체 유기 체 모델14,15로의 번역에 실패 하 게 된다. 또한, 불멸 세포 배양은 DNA 손상16,17에 대 한 침 샘 반응에 중요 한 p53 활성의 변조를 필요로 한다.
3 차원 살 리 구의 배양은 배양 초기 시점에서 줄기 및 전구 세포에 대해 풍부 하 고, 침 샘 세포의이 서브셋 인9,18의 방사선 민감성을 이해 하는데 유용 하였다. 이러한 모든 배양 모델의 중요 한 제한은 세포 외 기질 (ECM) 및 다양 한 층을 통한 세포 세포 상호 작용을 포함 하는 침 샘의 3 차원 구조를 시각화 하는 데 효과가 없으며,이는 타 액 조절에 결정적인 역할을 합니다. 분 비15. 전체적으로 조직의 거동을 포괄 하는 방법에 대 한 필요성이 있지만, 또한 방사선 유발 침 샘의 근본적인 메커니즘을 더 발견 하기 위해 치료의 효과를 연구 하기 위해 실험실 조건 하에서 조작 될 수 있다 장애.
살아있는 조직 절편 및 문화는 이전에 문서화 되었습니다19,20 종종 뇌 조직 상호 작용을 연구 하는 데 사용21. 이전 연구에서, 파 타 액 선 조직은 마우스 로부터 약 50 µm에서 단면화 되었고 최대 48 h까지 배양 하였으며, 생존 율, 세포 사 멸 및 기능을 분석 한 후19를 수행 하였다. Su 외. (2016) 35 µm 또는 50 µm에서 단면화 된 인간 턱 밑 샘 (SMGs)을 14 일 동안 배양 하 여이방법론을 확장 하였다. 제안 된 방법은 30 일 동안 50 µm 및 90 µm 및 배양에 대 한 평가에서 단면화 된 파와 턱 밑 침 샘 모두를 포함 한다는 것에서 전진 합니다. 조직 두께 범위를 절단 하는 능력은 분 비에 대 한 apical-basolateral 극성 및 신경 분포를 포함 하는 세포 프로세스와 관련 된 세포 세포 및 세포-ECM 상호작용을 평가 하는 데 중요 합니다. 더욱이, 침 샘 슬라이스는 배양 중에 조사 되어 방사선 유발 된 타 액 선 손상을 연구 하기 위한이 배양 모델의 타당성을 확인 하였다.
이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 세포 사 멸을 위한, 트리 판 청색 염색, 살아있는 세포 염색 및 면역 조직 염색을 실행 가능한 최대 시간 섹션을 결정 하기 위해 수행 하였다. 공초점 현미경 및 면역 형광 염색은 특정 세포 집단, 형태학 적 구조 및 증식 수준을 평가 하기 위해 활용 되었다. 조직 섹션 배양은 또한이 3-d 모델에서 다양 한 마커에 대 한 방사선의 영향을 확인 하기 위해 이온화 방사선에 노출 되었다. 세포 사 멸 유도, 세포 골격 파괴, 분화 마커의 상실 및 조사 된 전 생체 배양에서의 보상 증식은 생체 내 모델의 이전 연구와 비교 하였다. 이 방법론은 방사선 손상에 따르는 세포 세포 상호 작용의 역할을 조사 하 고 치료 적 개입의 효능을 효율적으로 평가할 수 있는 실험적 모델을 제공 하는 수단을 제공 한다 (유전자 조작 또는 약리학 적 제제 )는 생체 내 모델에 대해 덜 적합할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>단면 절단</td><td>용 Vibratome</td></tr><tr><td>양날 스테인리스 스틸 면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>저용융</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B</td><td>Lonza</td><td>17-745H</td><td>PSA</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>CellTreat</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>록타이트 울트라겔 제어 초강력</td><td>접착제 록타이트</td><td>N/A</td><td>철물점에서 구입</td></tr><tr><td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td><td>Princeton Art & Brush Co</td><td>7400R-2</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이</td><td>트 Fisher Scientific</td><td>ICN1676045</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린</td><td>시그마-알드리치</td><td>T-8158-100mg</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타트민</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>미량 원소</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN1676549</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Fisher Scientific</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 미디어</td><td>Corning</td><td>150-90-CV</td><td></td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트</td><td>Millipore 시그마</td><td>PICM01250</td><td>12mm, 24웰 플레이트용 0.4um 기공 크기</td></tr><tr><td>0.4% Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 세포 이미징 키트(488/570)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R37601</td><td>LIVE 염료 성분만 사용</td></tr><tr><td>Anti-Ki-67 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9129S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>3195S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cleaved Caspase-3 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9661L</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMA 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Anti-amylase 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8273</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 항체</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUBB3 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>5568S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 항체 라벨링 키트</td><td>: Thermo-Fisher</td><td>A20185</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 594, Phalloidin,</td><td>Thermo-Fisher</td>, <td>A12381</td><td></td></tr>, <tr><td>소 혈청, 알부민</td>, <td>Fisher Scientific</td>, <td>BP1600</td><td></td></tr>, <tr><td>Triton X-100</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>21568-2500</td><td></td></tr>, <tr><td>파라포름알데히드, Prills,</td><td>Fisher Scientific</td><td>, 5027632</td><td></td></tr>, <tr><td>New England, 핵 차단제</td><td>Perkin Elmer</td><td>2346249</td><td>더 이상 판매되지 않음</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083S</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Leica SPSII Spectral Confocal</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td>컨포칼 이미징용</td></tr><tr><td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>코발트-60 텔레테라피 기구</td><td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>아맥 박스,</td><td>컨테이너 스토어</td><td>지우기 60140</td><td>아가로스 블록 몰드</td></tr></tbody></table>

하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Xerostomia는 방사선 요법으로 치료 되는 머리와 목 암 환자에 있는 삶의 질을 감소 시키는 만성 경구 합병증을 만듭니다. 타 액 선 기능 장애 및 복원의 이해 메커니즘에 대 한 실험적 접근법은 생체 내 모델에 초점을 맞추고 있으며,이는 형질 감염의 치료 후보 및 효율성을 체계적으로 화면 화 하는 무 능력에 의해 장애인 특정 유전자를 조작 하는 기능. 이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 우리는 면역 형광 염색 및 공초점 현미경을 이용 하 여 특정 세포 집단 및 마커가 30 일 배양 기간 동안 존재 하는 시기를 결정 합니다. 또한, 이전에 생체 내 방사선 모델에서 보고 된 세포 마커는 생체 내 조사 되는 배양 물에서 평가 된다. 전진 하는이 방법은 침 샘 기능을 개선 하는 치료제에 대 한 뮤 린 및 인간 타 액 선 조직 반응의 신속한 ex 생체 내 평가를 위한 매력적인 플랫폼입니다.

1 차 2 차원 배양은 소 혈 청 (FBS) 보충 된 배지에서 성장 되 고, 일차 3 차원 살 리 구 배양은 전형적으로 무 혈 청 조건10,11에서 배양 된다. 추가적으로, 침 샘에서의 진동 배양을 활용 한 두 개의 이전 연구는 보충 된 배지 FBS을0% 또는 10%로 배양 하였다. 마우스 턱 밑의 슬라이스는 50 µm의 두께에서 단면화 되어 진동 및 최적 배양 조건을 사용 하 여 일련의 FBS 농도 (0%, 2.5%, 5.0% 및 10%)를 사용 하 여 결정 하였다. 생존 특성을 결정 하기 위해, 밝은 전계 현미경 이미지는 배양 일 1, 4, 7, 14 및 30 사후 절편에서 촬영 하였다 (그림 1). 추가적...

3 차원 유기 typic 문화권을 사용 하 여 타 액 선의 형태학 및 기능적인 마커를 시각화 하는 것은 방사선을 따르는 조직 손상의 기계 장치에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 설명 하는 프로토콜은 이온화 방사선에 노출 되기 전에 섹션, 문화, 방사선, 얼룩 및 이미지 50-90 μ m 두께의 타 액 선 섹션에 관한 것 이다.

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

이 프로토콜은 조직 내의 다양한 세포 유형 과 생체 내에서 덜 실현 될 것이다 ex vivo 분자 및 약리학적 조작 사이의 세포 상호 작용을 세포의 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 조직 섹션이 후기 시점에서 평가를 허용하는 배양에서 유지 될 수있는 시간의 연장 된 기간이다. 이 기술은 타액 선 손상을 정정하기 위하여 치료 화합물의 더 빠른 검열을 허용할 것이고 가능성이 이 연구 결과에 사용된 마우스의 수를 감소시킬 것입니다.우리는 중간 시점에서 방사선 요법에 타액 선 반응을 이해하고 특정 간격으로 유전자를 켜고 끄는 이 기술을 사용할 계획입니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 조직 단면과 문화 및 염색 단계 동안 조직 섹션의 손실을 방지. 시술을 시작하기 전에 분리 가능한 진동 성분을 70% 에탄올로 소독한 다음 30분 이상 UV 살균을 합니다.얼음이 떨어지는 것을 방지하기 위해 완충 트레이 위에 실험실 필름을 추가로 고정하고 얼음 챔버를 분쇄 된 얼음으로 채웁니다. 완충 용지에서 실험실 필름을 제거하고 1%페니실린 연쇄상 구균 암피실린 또는 PSA로 보충된 100밀리리터의 얼음-차가운 PBS로 버퍼 트레이를 채웁니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 면도날을 블레이드 홀더에 넣고 스크루드라이버를 사용하여 블레이드 각도를 조절합니다.타액 땀샘을 격리한 후 수확한 조직을 1%PSA로 보충한 2밀리리터의 얼음차가운 PBS를 함유한 멸균 30mm 배양 접시에 넣습니다. 자동 식 포셉을 사용하여 땀샘을 배임 금형의 바닥으로 옮기고 액체 3 % 낮은 융점 아가로즈로 조직을 덮습니다. 집게를 사용하여, 적절한 평면에서 블록의 중간에 조직을 조정하고, 10 분 동안 얼음에 아가로즈 블록을 배치합니다.아가로즈가 경화되면 금형의 바깥쪽 가장자리 주위에 면도날을 조심스럽게 실행하고 블록이 UV 멸균 실험실 필름위로 밀어 내도록 합니다. 면도날을 사용하여 타액선이 들어 있는 아가로즈 박스를 잘라내어 단면의 평면이 블록의 반대쪽과 직선적이고 평행하다는 것을 주의하십시오. 초접착제를 사용하여 절단 표면에 블록을 부착하고 진동에 50 또는 90 마이크로 미터 두께의 섹션을 초당 0.075 밀리미터의 100 헤르츠 주파수에서 가져옵니다.그런 다음 오토클레이브 천연 헤어 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 24 개의 잘 조직 배양 접시에 옮기고 1 밀리리터의 얼음 차가운 PBS를 함유하고 얻어집니다. 모든 단면을 획득하면, 각 항

radiation-treatment-organotypic-cultures-from-submandibular-parotid

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스 침샘에서 줄기 세포의 격리를 위해 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 효소와 소화 기계를 고용하고, 줄기 세포의 특징과 세포를 포함하는 salispheres의 절연을 수 있습니다.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는...

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

두경부 방사선 요법의 주요 부작용인 타액선 기능 저하로 환자의 삶의 질을 떨어뜨립니다. 동물 모델에서 새로운 치료법의 효능을 입증하는 것은 임상 전환 전에 전제 조건입니다. 이 프로토콜은 쥐의 턱밑샘에 대한 후향 투여 및 국소 방사선 조사에 대해 설명합니다.

타액 기능 저하의 쥐 모델에서 Retroductal 턱밑 글 랜드 점적 및 현지화 된 분획 조사

우리는 수술 노출 하 고 안정화 murine submandibular 침 샘 intravital 이미징 똑바로 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 머리와 목 지역 쥐 및 다른 작은 설치류의 다른 전 동맥에 쉽게 적응 합니다.

똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비

Submandibular 동맥을 지역 약물 전달 및 새로운 치료제의 개발에 대 한 이해 침 샘 생물학에서입니다. 선물이 배달 정확성과 실험의 재현성을 향상 시키는 업데이트 및 상세한 retroductal 주입 프로토콜. 여기에 소개 하는 응용 프로그램은 고분자 나노 입자의 배달.

Retroductal 나노 Murine Submandibular 동맥에 주입

선물이 murine tracheostomy 등 3 개의 주요 침 샘의 침 컬렉션을 수행 하는 자세한 접근.

Pilocarpine 자극 다음 통해 murine 침 기능 평가 분류 한 방사선

마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

우리는 1 차적인 인간 타액 선 파생된 상피 세포를 격리하고 기양하는 방법을 제시합니다. 이들 세포는 침상 피유래의 유전자 발현 패턴을 나타내며 엥겔브레스-홀름-군단 종양 세포에서 유래한 지하 막 매트릭스 또는 처리된 배양 요리의 단층으로서 살리스피어로 성장될 수 있다.

침또는 단층으로 시험관 내 성장을 위한 인간 타액 선에서 타액 상피 세포의 격리

면역형광 이미징은 복잡하고 시간에 따라 달라지는 생물학적 과정을 단 한 번의 스냅샷으로 관찰할 수 있는 능력에 제약을 받습니다. 이 연구는 정밀하게 절단된 쥐의 턱밑샘 절편에 대해 수행된 실시간 이미징 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 접근법을 통해 항상성 중 세포-세포 상호 작용과 재생 및 복구 과정을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

와튼의 덕트를 통해 마우스 턱밑 침샘의 cannulation을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 본 실험은 trypan 푸른 솔루션은이 기법을 효과적으로 타겟 선에 혼합을 제공하는 방법을 보여줍니다하고, 침샘의 재생을위한 잠재적인 약물 임상 / 세포 치료 등이 새로운 접근 방법의 신뢰성을 제안하는 다이로 사용됩니다.

와튼의 덕트를 통해 마우스 턱밑 침샘의 Cannulation

배우세요 하악 및 파타액 땀샘의 유기 유형 배양을 이용한 방사선 치료 효과 평가 방법을. 이 기술은 치료 화합물 선별과 조직 손상 메커니즘 연구에 활용됩니다.

하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

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