Name: 마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 학습하세요 마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스를 경막 주사하여 유방암 모델을 생성하는 방법을. 세포 특이적 유전자 조작과 복잡한 교배 없이 정밀한 종양 연구가 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 국립 보건원 (NIH) 교부금 R01 CA222560및 국방부 획기적인 상 W81XWH-18-1-0037에 의해 지원되었습니다.

여기에 설명된 모든 방법은 브리검 및 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 플록스 마우스의 생성 및 유지 보수
<ol><li>유방암 관련 플록스 조건부 녹아웃(예: Trp53Tm1Brn [Trp53L/L], Brca1Aash [Brca1L/L])또는 조건부 노크인 마우스 라인(예: GT(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)이건) 잭슨 연구소 (JAX) 또는 인간 암 컨소시엄의 NCI 마우스 모델 (MMHCC) 저장소에서. 또한, Cre-mediaed 재결합을 거치는 MEC의 추격을 용이하게 하기 위해, 조건부 크레 리포터 라인은 또한 JAX(예를 들어, GT(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos[R26Y로 지칭된다]로부터 얻을 수 있다. </li>
	<li>R26Y 동형접합체 리포터 마우스또는 R26Y 리포터 대립구를 운반하는 동형접합 마우스를 가진 품종 Trp53L/L 동형접합마우스 및 다른 에 대한 추가 플럭스 조건부 녹아웃 또는 노크-인 대립구 마우스 모델, 헤테로지구스 F1 남성과 여성의 자손을 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>인터크로스 헤테로지쿠스 F1 수컷 및 암컷 마우스는 각 알레르(실험마우스로서)에 대해 동형접합체인 F2 화합물 암컷 마우스뿐만 아니라 R26Y-유일한동형접합여성(대조군 마우스로서)을 얻었다. 아래 나열된 PCR 프라이머 및 사이클링 조건에 기초한 유전자형 F2 마우스는 두 개의 서로 다른 PCR 튜브에 2개의 표준 20 μL PCR 반응(Taq 5X Master Mix 사용)을 설정하여 R26Y 프라이머를 사용하고 다른 하나는 Trp53L과 함께 프라이머. 모든 번식에 성인 마우스 (일반적으로 약 2-4 개월 의 나이)를 사용합니다.<ol>
<li>R26Y의경우, 3분 동안 94°C에서 PCR을 수행한 다음 30초동안 94°C, 30초동안 60°C, 35사이클동안 1분 동안 72°C, 3분 동안 72°C, 14°C에서 유지합니다. 프라이머 사용 (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCC ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG 가트 ATG ATG. 참고: 250 bp의 단일 PCR 대역은 R26Y 동형화이고, 단일 PCR 대역은 500 bp의 단일 PCR 대역은 야생형(WT)을 나타내고, 2개의 PCR 대역(R26Y: 250 bp, WT: 500 bp)은 R26Y 헤테로지고테(그림1A)를나타낸다. Trp53L의경우 94°C에서 3분 동안 PCR을 수행한 다음 30초동안 94°C, 30초동안 60°C, 35사이클동안 1분 동안 72°C, 3분 동안 72°C, 14°C에서 PCR을 유지합니다. 프라이머 (i) p53F2-10 1F 사용: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA 태그 GAG GCA 개그 AC. 참고: 370bp의 단일 PCR 대역은 Trp53L/L 호모자고테를 나타내며, 288bp의 단일 PCR 대역은 Trp53+/+ WT를 나타내고, 두 개의 PCR 대역(WT: 288bp, Trp53L: 370bp)은 Trp53 L을 나타냅니다. /+ 헤테로지고테(그림1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 수술 전 준비
<ol><li>수술 1 일 전에 모든 수술 도구를 오토 클레이브.</li>
	<li>인산완식염수(PBS)에 0.1% 브로모페놀 블루를 준비하고 4°C에 보관합니다. DMEM 배지에서 0.01 M CaCl2 및 브로모페놀 블루를 1:10의 비율로 사용하여 DMEM 배지에서 의 증감 주사에 사용될 Ad-Cre를 희석한다(즉, 주사 혼합물). 참고 : 여기에 사용되는 광고 - Cre는 아이오와 바이러스 벡터 코어의 대학에서 얻은, ~ 1010-1011 pfu / mL의 주식 바이러스 성 가이터와.</li>
	<li>이소플루란 챔버를 사용하여 암컷 마우스(1.2단계에서 설명한 대로 F2 세대, 나이 3-4주에서 성인까지의 연령)를 마취시키고 눈 연고를 적용한다. 시술 중에 마우스가 산소에서 1%-2.5% 이소플루란을 흡입하도록 하여 마우스를 지속적으로 마취시다. 발가락 핀치를 수행하여 적어도 매 15 분마다 마취의 깊이를 확인하십시오. 필요한 경우 호흡률의 변화가 있는지 마우스를 조심스럽게 모니터링하고 그에 따라 이소플루란의 수준을 조정하십시오.</li>
	<li>5 mg/kg의 복용량에 피하 진통으로 멜 록시 캄을 주입, 외과 적 절차 전에.</li>
	<li>제모 크림의 여러 방울을 적용하여 젖꼭지 수술 부위를 노출; 부드러운 종이 타월을 사용하여 과도한 크림과 느슨한 머리를 제거하십시오. 참고: 수술이 수행될 위치와 는 별개의 영역에서 이 단계를 수행합니다. 젖꼭지가 손상되지 않도록 면도는 권장하지 않습니다. 적시에 화학 제모제를 제거하기 위해주의를 사용. 에이전트를 너무 오래 방치하면 피부에 화학적 화상을 입을 수 있습니다.</li>
	<li>먼저 요오드도프로 수술 부위를 소독하고 70 % 알코올을 마시고 스크럽 이오도프를 최종 적용하십시오. 거즈 스폰지 또는 면 팁 어플리케이터를 사용하여 작업 영역의 중심에서 주변을 향해 원을 그리며 이 작업을 수행합니다. 주기를 3x-4x 반복합니다.</li>
</ol>3. 경내 주사
<ol><li>수술 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용하십시오.</li>
	<li>두 개의 네 번째 인과 MGs 사이에 ~ 1cm의 길이로 피부에절개 부위를 만듭니다 (그림 2). 유방 덕트 나무를 시각화할 수 있도록 정수리 복막에서 피부 플랩 (MG)을 조심스럽게 분리하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 워치메이커의 집게로 젖꼭지를 잡고 미세 해부 가위를 사용하여 근처의 피부를 자르지 않고 외부 젖꼭지를 제거합니다.</li>
	<li>33 G 금속 허브 바늘이 부착된 25 μL 해밀턴 주사기에 Ad-Cre 주입 혼합물의 ~3-5 μL을 적재합니다. 혼합물에 포함된 청색 염료에 기초하여 주사기 내의 주사 혼합물의 부피를 추정한다. 참고: 3-4주 된 암컷의 MGs에 주입할 때 더 작은 부피(예: 3 μL)를 사용하고 수유 여성의 MGs에 주입할 때 더 큰 부피(예: 10 μL)를 사용하십시오.</li>
	<li>미세한 곡선 트위저로 피부 플랩의 가장자리를 부드럽게 잡고 Ad-Cre 주입 혼합물을 젖꼭지에 천천히 주입하고, 한편 유방 덕트 트리에 청색 염료가 퍼지는 것을 모니터링합니다. 덕트 루멘의 손상을 피하기 위해 가능한 한 낮은 주입 속도를 유지하십시오. 참고: 주입된 유체(포함된 브로모페놀 블루 염료에 의해 도시된 바와 같이)는 기질 구획으로 누출되지 않고 덕트 나무 전체에 퍼져 있는 성공적인 자궁 내 주사를 나타낸다.</li>
	<li>주입된 액체의 누출을 방지하기 위해 젖꼭지에서 바늘을 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>MG의 말단 측 (즉, 젖꼭지에서 멀리) 또는 주입된 젖꼭지의 주변 지역을 검사합니다. 팽윤 하는 푸른 염료 (즉, 염료 근처 기질로 확산) 유 방 지방 패드 주입 보다는 성공적인 내 심 출 주사를 나타냅니다.</li>
	<li>상처 클립으로 피부의 외과 적 상처 (3.2 단계에서)를 닫습니다.</li>
</ol>4. 수술 후 치료
<ol><li>마취에서 마우스를 제거하고 복구를위해 깨끗한 케이지 내부의 가열 패드에 놓습니다.</li>
	<li>멜 록시 캄 을 피하 관리 5 mg/kg 다시, 24 수술 후 시간.</li>
	<li>동물의 일반적인 상태를 모니터링하고 5 일 동안 절개 부위에서 감염 징후를 찾습니다.</li>
	<li>상처 클립은 수술 후 ~ 7-10 일 후에 제거됩니다.</li>
</ol>5. 유방 종양의 발달을 감시
<ol><li>유방 종양 발달의 어떤 표시든지를 위한 촉진에 의해 주입된 마우스를 매주 2회 감시하십시오.</li>
	<li>종양이 만져지면 매일 마우스를 모니터링하고 실험 종점에 도달 할 때까지 종양 크기를 측정하십시오(예: 마우스 체중의 10%-15%에 도달) 또는 종양의 상태(예: 궤양성 또는 괴사)에 의해 결정됩니다. 마우스의 일반적인 건강 상태 (예를 들어, 혼수 상태, moribund).</li>
	<li>이산화탄소 질식에 의해 마우스를 안락사시키고, 이차 방법 (예를 들어, 자궁 경부 탈구)이 뒤따른다.</li>
	<li>유방 종양 조직을 분리하고 앞서12일설명한 바와 같이 유세포분석, 면역형광, 또는 발현 프로파일링(예를 들어, RNA 시퀀싱[RNAseq] 또는 마이크로어레이)에 의해 분석한다.</li>
	<li>계보 음성 세포에 대한 게이팅에 의한 유동 세포 분석 수행(Lin-: 계보 마커 CD45 [백혈구 마커]), CD31 [내피 세포 마커], 및 TER119 [적혈구 마커]에 따라 종양내 세포를 분석합니다. YFP, CD24 및 CD29의 표현.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

MECs의 다른 하위 집단에서 유방 종양을 유도하기위한이 접근법의 성공은 적절한 세포 유형 특이적 프로모터를 선택하는 것뿐만 아니라 (Cre 발현을 유도하기 위해) 뿐만 아니라 자궁 내 주사 절차 자체에 의존합니다. 이 접근의 뒤에 아이디어는 주입된 Ad-Cre 바이러스가 루멘을 가진 은폐한 구조물인 덕트 트리에서 유지된다는 것입니다, 그러므로, 단지 MECs는 바이러스에 드러내고 Ad-Cre에 의해 감염됩니다. 유방 덕트 내의 제한된 루멘 공간으로 인해 각 MG (즉, ~ 3-5 μL)에 주사 혼합물의 소량만 주입하는 것이 중요합니다. 주입된 부피는 또한 마우스의 나이에 따라 조정되어야 한다(즉, 3-4주령 마우스에 주입될 때 더 작은 부피를 사용해야 한다). 주입된 액체의 부피가 주입 및 제한된 덕트 루멘 공간에서의 압력으로 인해 과도할 때, 유체는 기질로 상피 층을 통해 "밀려나게"될 수 있으며, 기질 세포에서 원치 않는 바이러스 감염으로 이어질 수 있습니다.
세포형 특이성...

이 방법의 전반적인 목표는 마우스 MG에 Ad-Cre의 경내 주입에 근거를 둔 새로운 유방암 모델링 접근을 개발하는 것입니다. Cre/loxP 재조합 기반 유전 적 접근법은 마우스에서 인간 유방암을 모델링하는 데 널리 사용되어 왔습니다. Cre/loxP 기반 유방암 마우스 모델의 1세대는 MEC 특이적 프로모터(예: 광ME및 기저 MEC의 일부인 MMTV-Cre) 및 기저 MEC의 일부, Wap-Cre 및 발광 선조 및 폐포 광도 MEC, K14-Cre 기저 및 발광 MEC의 일부에 대한 Blg-Cre 1, 2,3,4,5)6, 7명 , 8개 , 9. 그러나, 이러한 Cre 형질전환 선은 Cre 발현의 공간 제어를 가능하게하지만 (즉, MEC의 다른 하위 세트에서), 그들은 Cre 발현 및 Cre / loxP 매개 유전 조작의 시간적 제어를 허용하지 않습니다. Cre/loxP 기반 유방암 마우스 모델의 2세대는 유도성 Cre 활성/발현 접근법을 활용합니다(예를 들어, 타목시펜 투여 시 크레/록스P 재조합을 유도할 수 있는 Cre-에스트로겐 수용체 융합[CreER]의 사용),, 그 결과, 이러한 유전 적 도구는 MECs에서 의 한인 발생 이벤트의 활성화의 공간 적 및 시간적 제어를 모두 허용 (예를 들어, K8-CreER- 및 K5-CreER기반 모델)10,11,12 . 유방암 마우스 모델의 두 세대에서, Cre 또는 CreER 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터로서 (예를 들어, Krt8, Krt5)또한 다른 장기의 상피 세포에서 활성화 될 수있다 (즉, 그들은 세포 유형 특이적이지만 장기 특이적이지 않음) 또는 상피 세포 이외의 세포 유형에서 새는 발현을 가지고 (예를 들어, MMTV,이는 골수 조혈 세포에서 새는 활성을 가지고), 이러한 접근 방식은 다른 기관에서 원치 않는 암의 개발로 이어질 수 있습니다.. 이러한 예기치 않은 암이 영향을받는 마우스에서 치사를 일으키는 경우,이 마우스에서 유방암을 모델링하는 원래의 목적은 금지 될 수있다 (예를 들어, MMTV-Cre-구동 종양 발생 이벤트는 조혈 악성 종양과 마우스의 조기 사망으로 이어질 수 있습니다 , 조혈 세포에서 MMTV 프로모터의 누설로 인해)4.
여기에서 우리는 일시적으로 통제된 방식으로 세포 모형 및 기관 특정 조작을 둘 다 허용하는 마우스에 있는 유방암 모델링 접근을 보고합니다. 이 접근법은 마우스 MGs에 Ad-Cre의 내 삽입을 기반으로 합니다 (따라서 장기별). Cre 발현은 아데노바이러스 벡터에 내장된 상이한 MEC 서브모멘트 특이적 프로모터를 사용하여 제어될 수 있다(예를 들어, 발광 MEC의 경우, 기저 MEC의 경우 Krt8, 따라서 세포 형 특이성을 달성). MGs에 있는 암 유도는 성인 단계에 나이의 3-4 주 (사춘기)에서 시작하여 다른 나이에 마우스로 Ad-Cre의 주입에 의해 일시적으로 통제될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>33게이지 바늘</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>포인트 스타일 3 무딘</td></tr><tr><td>7mm 반사 클립</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스, Ad-K5-Cre</td><td>아이오와 대학교 바이러스 벡터 코어</td><td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>아데노바이러스, Ad-K8-Cre</td><td>아이오와 대학교 바이러스 벡터 코어</td><td>Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>알코올</td><td>피셔</td><td>HC800-1GAL</td><td>70% 사용 준비</td></tr><tr><td>비오틴화 CD31</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 CD45</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD 파밍겐</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>헤어 리무버 로션</td><td>Nair</td><td></td><td>9</td></tr><tr><td>Oz Hamilton 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>0.025 mL</td></tr><tr><td>요오드 포머</td><td>베타딘</td><td></td><td>10% 포비돈-요오드</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>박스터</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2.5%</td></tr><tr><td>Loxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>윤활제 눈 연고</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위</td><td>Pentair</td><td>9M</td><td>워치메이커 집게</td></tr><tr><td>마이크로 해부 핀셋</td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X 마스터 믹스</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 유방 동맥에 cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

유방암은 이기종 질병, 기원의 다른 세포 와 종양 발생 이벤트 사이의 복잡 한 상호 작용 때문일 수 있습니다. 마우스 모델은 이러한 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 많은 마우스 모형이 유방 종양발생에 각종 종양 발생및 기원의 세포의 기여를 공부하기 위하여 개발되었더라도, 이 모형은 수시로 세포 모형 또는 기관 특정이 아니거나 유방 종양 발생의 개시를 유도할 수 없습니다 일시적으로 제어 방식. 여기에서 우리는 마우스 유방 땀샘 (MGs)으로 Cre 발현 아데노 바이러스 (Ad-Cre)의 경막 주사에 근거를 둔 유방암 마우스 모형의 새로운 모형을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. 유선 덕트에 Ad-Cre를 직접 주입하기 때문에이 접근법은 다른 장기에서 원치 않는 암 유도없이 MG 특정입니다. 경막 주사 절차는 MG 발달의 다른 단계에서 마우스에서 수행 될 수있다 (따라서, 그것은 암 유도의 시간적 제어를 허용, ~에서 시작 ~3-4 나이의 주). 세포 형 특이성은 아데노 바이러스 벡터에서 Cre 발현을 유도하기 위해 상이한 세포 형 특이적 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 우리는 발광 및 기저 유방 상피 세포 (MECs)가 각각 케라틴 8 또는 케라틴 5 프로모터의 통제하에 Ad-Cre의 경막 주사를 통해 Cre /loxP 기반 유전자 조작을 위해 단단히 표적으로 할 수 있음을 보여줍니다. 조건부 Cre 리포터(예를 들어, Cre/loxP-유도성 Rosa26-YFP 리포터)를 통합함으로써, 우리는 Ad-Cre에 의해 표적화된 MECs, 및 그로부터 유래된 종양 세포가, 유도 내 주사 후 리포터 양성 세포를 따라 추적될 수 있음을 보여준다.

R26Y 및 Trp53L 대두에 대한 대표적인 PCR 지질형 검사 결과는 도1에 나타내고 있다.
원칙적으로, 모든 10개의 MGs는 모두 경감 내 주사 절차를 실시할 수 있지만, 실질적으로, 두 개의 제4 인큐니탈 MG는 일반적으로주입을 위해 선택되며, 이는 그들의 접근성및 더 큰 MG 크기(도 2)로 인해 선택된다. 수술 중, 소독되고 깔끔한 작업 영역을 유지하고 멸균 도구로 절차를 수행하는 것이중요합니다 (그림 3). 자궁 내 주사 동안, 주사 혼합물에 청색 염료(예를 들어, 브로모페놀 블루)를 포함시키는 것은 전체 덕트 트리내로 Ad-Cre의 성공...

이 프로토콜의 목표는 마우스 유방 땀샘으로 Cre 발현 아데노바이러스의 자궁 내 주입에 기초한 새로운 유방암 모델링 접근을 기술하는 것입니다. 이 접근은 세포 모형 및 기관 특정 조작을 시간적으로 통제한 방식으로 oncogenic 사건을 둘 다 허용합니다.

마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

이 프로토콜은 연구원이 유방 상피 세포의 다른 하위 집합에서 인간 적인 유방암 발달을 다시 상백하기 위하여 마우스 모형의 새로운 모형을 생성하는 것을 도울 것입니다. 이 기술은 연구원이 광범위한 마우스 사육을 위한 필요 없이 세포 모형 특정 방식으로 발달 단계 조직에 있는 유방암 마우스 모형을 생성할 수 있게 합니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플로크스 마우스를 생성, 유지 관리 및 마취합니다.수술이 수행될 영역과 는 별개의 영역으로 마우스를 가져오십시오. 발가락 핀치를 수행 하 여 마취를 확인 한 후, 수술 절차에 대 한 준비를 킬로그램 당 5 밀리 그램의 복용량에서 실체로 멜록시캄을 주입. 제모 크림 몇 방울을 적용하여 젖꼭지 수술 부위를 노출하십시오.부드러운 종이 타월을 사용하여 과도한 크림과 느슨한 머리카락을 제거하십시오. 면도는 젖꼭지의 손상을 피하기 위해 권장되지 않습니다. 먼저 70 %의 알코올다음으로 요오도프로 수술 부위를 소독하고 스크럽 요도의 최종 적용으로 끝납니다.거즈 스폰지 또는 면에 기울어진 어플리케이터를 사용하여 작업 영역의 중심에서 주변으로 원을 그리며 이 작업을 수행하십시오. 주기를 3~4회 반복합니다. 외과 적 수술 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다.두 네 번째 잉게인 유방 땀샘 사이의 약 1 센티미터길이로 피부에 절개 부위를 만듭니다. 유방 덕트 트리를 시각적으로 정수리 복막에서 피부 플랩을 조심스럽게 분리합니다. 조심스럽게 마이크로 절제 가위를 사용하여 근처의 피부를 절단하지 않고 외부 젖꼭지를 제거하기 위해 워치 메이커의 집게로 젖꼭지를 잡아.33 게이지 금속 허브 바늘이 부착된 25 마이크로리터 해밀턴 주사기에 크레아데노바이러스 주입 혼합물의 약 3~5마이크로리터를 적재한다. 혼합물에 포함된 청색 염료에 기초하여 주사기내의 주사 혼합물의 부피를 추정한다. 미세한 곡선 트위저로 피부 플랩의 가장자리를 부드럽게 잡고 유방 덕트 트리에 푸른 염료의 확산을 모니터링하면서 Cre-adenovirus 주입 혼합물을 젖꼭지에 천천히 주입합니다.덕트 루멘의 손상을 피하기 위해 가능한 한 느리게 주입 속도를 유지합니다. 성공적인 내트라덕트 주입은 스트로마 구획으로 누출되지 않고 전체 덕트 트리 전체에 퍼지는 주입 된 유체에 의해 표시됩니다. 주입된 액체의 누출을 피하기 위해 젖꼭지에서 바늘을 부드럽게 철회합니다.매명선의 탈면 또는 주입된 젖꼭지의 주변 부위를 검사

modeling-breast-cancer-via-an-intraductal-injection-cre-expressing

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 기사에서는 유방 지방 패드에 유방암 세포를 주입하여 암컷 마우스에서 유방암 모델을 확립하는 방법에 대해 설명합니다. 예제 프로토콜은 orthotopic 주입을 보여줍니다.

유방 뚱뚱한 패드에 orthotopic 주입: 생쥐에 있는 유방암 확립

이 비디오는 마우스 유선의 관으로 주입 혼합물을 전달하는 관내 주사 기술에 대해 설명합니다.

Intraductal Injection: 마우스 유선의 관으로 주입 혼합물을 전달하기

마우스 유방 동맥에 수성 시약의 비 침습성 췌관 전달을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 특히 유방 덕트를 대상으로 유 방 땀 샘의 젖꼭지로 지역화 주입을 활용합니다. 이 기술은 siRNA를, 화학 요법 제와 작은 분자를 포함한 화합물의 다양한 적응할 수있다.

마우스 유선 화 된 약물 전달을위한 췌관 주입

임상 적으로 전이성 유방암에서 유방 유관 시스템 결과에 아데노 바이러스 크레와 잠재 돌연변이의 활성화. YFP 발기인의 설립은 말초 전이성 종양 세포의 추적을 할 수 있습니다. 이 모델은 잠재 전이, 항 종양 면역, 유방암을 치료하는 새로운 면역 요법을 디자인을 공부하는 데 유용합니다.

유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시

암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

여기, 우리는 간단 하 고, 침략, 그리고 쉽게 처리 방법, 더 적은에서 유 방 지방 패드에 유방암 세포를 이식 하는 프로토콜을 제시 하 고이 마우스 orthotopic 유 방 암 모델 적절 한 유 방 지방 패드 환경으로 사용할 수 있습니다의 다양 한 측면을 조사 하 암입니다.

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

환자 유래 제노이식(PDX) 모델과 이식 가능한 유전자 조작 마우스 모델은 인체 질환을 충실히 재구성하고 기본 및 번역 형 유방암 연구를 위한 선호 모델입니다. 여기서, 종양 생물학을 연구하고 약물 반응을 평가하기 위해 유방 지방 패드로 유방 종양 단편을 정형전으로 이식하는 방법이 설명된다.

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

생체 내 이미징 및 유방암 예방을 위한 마우스 유방 덕트 트리에 대한 에탄올 계 성 절제용용 시약의 내분사 주입 방법이 설명되어 있다. 젖꼭지 개구부에 직접 주사하면 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 유방 상피 세포를 대상으로 할 수 있습니다.

마우스 모델에서 유방암의 예방 및 지역 치료를 위한 에탄올 기반 담약 솔루션의 내배송 및 X선 시각화

유방암의 영상 유도 예방 치료를 위해 쥐 유방 유관 나무에 화학적 절제 용액을 전달하는 절차가 설명됩니다. 유방 상피 세포는 유두 개구부에 직접 캐뉼레이션과 70 % 에탄올 기반 절제 용액의 덕트 내 주입을 통해 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 표적화 될 수 있습니다.

쥐 모델에서 유방암 예방을 위한 관내 에탄올 기반 절제 치료의 X선 시각화

본 프로토콜은 유방 상피 세포에 관심 유전자를 전달하기 위해 젖꼭지를 통한 바이러스 벡터의 관내 주입을 설명합니다.

생체 내 유방 관내 주입을 통한 마우스 유방 상피 세포로의 유전자 전달

학습하세요 마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스를 경막 주사하여 유방암 모델을 생성하는 방법을. 세포 특이적 유전자 조작과 복잡한 교배 없이 정밀한 종양 연구가 가능합니다.

마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링

더 많은 동영상 탐색