Name: 흑색종 환자 유래 이종이식 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 학습하세요 흑색종 환자 유래 이종이식 모델 구축 및 특성 분석 방법을 통해 암 생물학과 치료 반응을 정확히 재현하는 기술을 익히세요. 이 방법은 내성 극복과 생존율 향상 연구에 활용됩니다.

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저자는 위스타 연구소 동물 시설, 현미경 검사시설, 조직 기술 시설 및 연구 공급 센터에 감사드립니다. 이 연구는 U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), 미리암 박사와 셸던 G. 아델슨 의학 연구 재단, 그리고 흑색종 연구 재단의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

다음 동물 프로토콜은 Wistar 연구소의 인도적 윤리 위원회 및 동물 관리 지침의 지침을 따릅니다.
1. 흑색종 종양 조직 수집
<ol><li>다음 수술 방법 중 하나에 의해 흑색종 환자로부터 종양 조직(계발 된 통로 0)을 수집합니다.<ol>
<li>외과 적 절제 조직의 경우, 4 °C 또는 얼음에서 수송 저장 매체 (RPMI 1640 + 0.1 % 진균 존 + 0.2 % 젠타미신)에서 최소 1 g의 조직 (절제 전이 및 1 차 병변)을 유지하십시오.</li>
		<li>외과 생검 조직의 경우, 4 °C 또는 얼음에서 수송 저장 매체에서 1g 미만의 조직 (종종 피하 [s.c.] 전이 및 림프절 [LN] 전이의 생검을 펀치)로 유지하십시오.</li>
		<li>핵심 생검 조직의 경우, 약 10 mm x 1mm (종종 간 생검)의 실린더 (코어)를 4 °C 또는 얼음에서 5 mL의 수송 저장 매체를 포함하는 15 mL 튜브로 씻어 냅니다.</li>
		<li>미세 바늘 흡인 (FNA) 조직의 경우, 4 °C 또는 얼음에 바늘과 주사기에서 환자에게서 직접 가져온 매우 적은 양의 조직 (크기 1mm 미만)을 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4°C또는 같은 날 얼음에 또는 수술 절제 또는 생검 후 야간 배송으로 운반 저장 매체에 조직을 전달합니다. 전달의 1-2 시간 이내에 조직을 처리하십시오.</li>
</ol>2. 마우스 이식용 종양 조직 처리
<ol><li>외과 절제 또는 외과 생검 조직 처리<ol>
<li>멸균 페트리 접시에 조직을 전송하고 가능한 한 주변 정상 조직에서 종양 조직을 분리.</li>
		<li>가능한 한 나머지 종양에서 괴사 조직 (일반적으로 종양 내 중앙에 위치한 창백한 희끄무레한 조직으로 확인됨)을 제거하십시오.</li>
		<li>메스를 사용하여 초기 종양 덩어리를 수술용 마우스 이식용(~3mm x 3mm)과 거의 동일한 조각으로 세분화합니다(그림 2).</li>
		<li>선택적으로, 충분한 종양 조직을 사용할 수 있는 경우, 하류 분석(RNA 시퀀싱[RNASeq], 전체 엑솜 시퀀싱[WES]등)에 대한 조직을 스냅 동결한다.</li>
		<li>두 개의 메스 블레이드와 크로스 블레이드 기술을 사용하여 종양 조직을 다진하여 종양 슬러리를 만듭니다. 종양 덩어리를 가능한 한 미세하게 잘라 슬러리를 형성하여 수술 용 마우스 이식준비가되었습니다.</li>
		<li>또는 종양 조직이 기계적 해리를 위해 너무 단단한 경우에, 이식 해리 절차를 사용하여 젤 같이 슬러리와 이식 및/또는 주입을 위한 단세포 현탁액을 형성합니다.<ol>
<li>슬러리를 형성하기 위해 가능한 한 미세하게 종양 덩어리를 다진다.</li>
			<li>차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)-/- (Ca++ 및 Mg++없이)와 50 mL 튜브에 슬러리를 넣어; 이어서, 원심분리기 및 펠릿을 220 x g에서 4°C에서 4분 동안.</li>
			<li>10 mL의 따뜻한 신선한 다이제스트 미디어 (200 U / mL 콜라게나제 IV + 5 mM CaCl2 + HBSS에서 50 U / mL DNase)의10 mL에서 슬러리를 다시 일시 중단하십시오.</li>
			<li>튜브를 37°C 수조에 20분 동안 놓고 일회용 파이펫으로 5분마다 힘차게 섞습니다.</li>
			<li>최대 50 mL의 HBSS로 세척하십시오./-; 그런 다음, 4 °C에서 4 분 동안 220 x g에서 원심 분리기를.</li>
			<li>종양 조직 1g당 5 mL의 미리 따뜻화된 TEG(0.025% 트립신 + 40 μg/mL 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N', N',N',N',N',N',N',N',N',N',N'-tetraacetic 산 [EGTA] + 10 μg/mL 폴리비닐 알코올 [PVA])를 추가, 부드럽게 다시 일시 중단 / 흔들어, 혼합하지 않고 2 분 동안 37 °C에서 튜브를 배치합니다.</li>
			<li>40°C에서 트립신과 센츄리에서 트립신과 센트리푸리에 대해 40°F의 페니실린-스트렙토미신을 담금질하기 위해 적어도 1개의 동일한 볼륨의 콜드 스테인링 미디어(1% 소 혈청 알부민 [BSA] + 10 mM 4--1-1-피페라진에설포닉산 [HEPES] + 1x 페니실린-스트렙토미신을 4°F에서 담금하기 위해 C.</li>
			<li>종양 조직 1g당 염색 매체의 10 mL에서 샘플을 재중단하고 마우스 주입을 위한 단일 세포 현탁액을 얻기위해 40 μm 세포 스트레이너를 통해 필터링합니다(그림 2).</li>
			<li>세포 스트레이너 의 상부에 남아있는 슬러리는 또한 외과 마우스 이식을 위해 수집될 수 있다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>C (것)에 광석 생검 조직 처리
	<ol>
<li>5cm 페트리 접시에 조직 수송 튜브에 코어 실린더 조직을 부어.</li>
		<li>여분의 액체를 제거하고, 페트리 접시의 가장자리에 조직을 긁어 내고, 종양 조직을 잘게 다진 다음 종양 조직 위에 HBSS-/-의 ~100-150 μL을 추가하고, HBSS /종양 조직 현탁액을 1 mL 주사기에 신속하게 그립니다.</li>
		<li>1 mL 주사기에 23G 바늘을 부착하고 바늘을 통해 HBSS / 종양 조직 현탁액을 1.5 mL 스핀 튜브로 전달하십시오.</li>
		<li>바늘을 통해 원활 하 게 통과 할 수 있을 때까지 바늘을 계속 주사기에 종양 현탁액을 다시 그립니다.</li>
		<li>마지막으로 종양 현탁액을 주사기로 다시 끌어와서 23G 바늘을 분리합니다.</li>
		<li>27 G 바늘을 부착하고 인공 세포 외 매트릭스의 동일한 부피 (~100-150 μL)를 주사기에 그립니다 (재료 표참조).</li>
		<li>종양/HBSS-/- 현탁액으로 1.5 mL 스핀 튜브에 인공 세포 외 매트릭스의 동일한 볼륨을 천천히 추가하여 거품 형성을 조심스럽게 피하십시오.</li>
		<li>마지막으로 주사기로 다시 그려핵심생검 종양 조직은 이제 마우스 주입을 위한 준비가 되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>FNA 조직 처리
	<ol>
<li>FNA 샘플을 함유한 주사기를 얼음 위에 놓습니다(바늘에 갇혀 있음).</li>
		<li>주사기에서 바늘 (FNA 조직을 함유)을 분리하고 주사기에서 플런저를 제거하고 HBSS의 ~ 150-200 μL을 주사기의 상단에 추가합니다.</li>
		<li>주사기와 바늘 (FNA 조직 포함)에 플런저를 다시 삽입하고 바늘을 통해 HBSS를 밀어 1.5 mL 스핀 튜브로 밀어 넣습니다. 이 단계는 바늘에서 FNA 종양을 제거합니다.</li>
		<li>2.3.3 단계를 동일한 주사기를사용하여 HBSS-/--/FNA 현탁액을 두 번 반복하여 바늘로부터 종양 조직의 회수를 최대화한다.</li>
		<li>HBSS/FNA 현탁액을 함유한 1.5mL 스핀 튜브에 인공 세포외 매트릭스의 동일한 부피(~100-150 μL)를 추가합니다.</li>
		<li>인공 세포 외 매트릭스 /HBSS-/-/FNA 현탁액을 23 G 바늘에 다시 그리고 두 번 반복하여 적절하게 혼합하십시오.</li>
		<li>전체 인공 세포 외 매트릭스 /HBSS-/-/FNA 볼륨을 주사기로 다시 그리고 23G 바늘을 27G 바늘로 교체하고 FNA 샘플을 마우스 주입을 위해 준비했습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 마우스에 종양 이식 및 주입
<ol><li>외과 절제 또는 외과 생검 조직의 이식 참고: 모든 수술 기구는 오토클레이브 또는 사전 멸균 된 일회용 기기의 사용에 의해 멸균되어 있는지 확인하십시오.<ol>
<li>NSG 6-8 주 남성 또는 암컷 마우스의 하부 에서 머리를 면도 약 1.5 cm x 3 cm 영역없이 머리. 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고, 반응성 테스트로 발을 부드럽게 압박하여 확인한다. 건조를 방지하기 위해 눈의 수의사 연고를 사용하십시오.</li>
		<li>마취 기계의 코 콘에 열 패드에 개별 마우스를 놓고, 클로르헨시딘으로 면도 부위를 문질러. 그런 다음 70 % 에탄올을 사용하고 증발할 수 있습니다.</li>
		<li>페트리 접시에 종양 슬러리를 준비하거나 수술 이식을 위해 개별 마운드로 나누어 놓습니다 (즉, 3 개의 마우스에 이식될 경우 3 개의 동일한 마운드로).</li>
		<li>메스 블레이드를 사용하여 마우스 뒷면 중앙에 약 5mm 길이의 절개를 하고 한 쌍의 포셉을 가져 와서 작업자의 반대쪽 절개 측면에 있는 피부를 들어 올립니다.</li>
		<li>다른 손으로 가위를 가지고 부드럽게 작은 가위 컷으로 근막 막을 절단하여 근육 층에서 피부를 분리하여 종양 조직에 대한 "주머니"를 만듭니다.</li>
		<li>메스 블레이드로 하나의 종양 덩어리 또는 종양 슬러리 조직의 하나의 개별 마운드를 선택하고 부드럽게 생성 된 주머니에 조직을 배치합니다.</li>
		<li>주머니에 종양 조직 마운드에 인공 세포 외 매트릭스의 100 μL을 관리.</li>
		<li>두 쌍의 집게를 사용하여 양쪽 끝에 절개를 당겨 상처 가장자리가 서로 가깝게 되도록하고 하나 또는 두 개의 상처 클립을 적용하여 상처를 닫습니다.</li>
		<li>피하 주사 1-5 mg/kg 멜 록시캄 수술 후 쥐에 진통제로.</li>
		<li>코 콘에서 마우스를 꺼내 원래 케이지에 다시 배치, 깨어있는 동안 마우스를 관찰. 완전히 회복될 때까지 케이지로 돌아가지 마십시오.</li>
		<li>약 7일 후에 상처 클립을 제거합니다. 치유가 7 일 후에 완료되지 않으면 상처 클립을 추가로 1 ~ 2 일 동안 그대로 둡니다. 참고 : 외과 적 절제 또는 수술 생검 조직 처리에서 단일 세포 현탁액을 사용하는 경우, 그것은 마우스 주입을위한 인공 세포 외 매트릭스 (1 :1 비율)와 혼합됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FNA 또는 핵심 생검 조직의 주입<ol>
<li>NSG 마우스를 강철 그리드 랙에 놓고 마우스를 꼬리로 단단히 잡고 마우스를 부드럽게 뒤로 당깁니다. 앞다리로 격자를 단단히 잡습니다. 또는, 비 지배적 인 손에 마우스를 억제하고 측면 영역이 표시할 수 있습니다.</li>
		<li>알코올 준비 면봉으로 측면의 피부를 소독하고 마우스 피부 아래에 주사기의 내용체를 천천히 꾸준히 주입하십시오.</li>
		<li>바늘을 당겨 서 다시 케이지에 마우스를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 종양 성장을 모니터링
<ol><li>쥐를 매주 한 번 모니터링하여 만져볼 수 있는 종양을 확인합니다.</li>
	<li>일단 종양이 측정 가능한 크기 (대략 50mm 3)에, 종양 치수를 기록하기 위하여 캘리퍼스를 이용하십시오. 다음 수식을 사용하여 종양 체적을 계산합니다: (너비 x 너비 x 길이) / 2.</li>
	<li>종양 부피가 약 1.5 cm3 (약 4-10 주)에 도달하면 종양을 수확하십시오. 종양은 지금 마우스 통로 1 (MP1)에게 불립니다.</li>
</ol>5. 은행 조직, 재착착 및 실험 /특성화를위한 종양 수확
<ol><li>CO2 챔버에서 마우스를 안락사시키고, 생체 신호를 확인하여 사망을 확인한 다음, 버콘 용액에 마우스를 담그고 바이오 캐비닛에서 30s의 피부를 살균합니다.</li>
	<li>구부러진 가위와 수술용 집게를 사용하여 종양 에 인접한 피부를 들어 올리고 수평 절단을 합니다.</li>
	<li>무딘 분리 기술을 사용하여 종양의 양면과 종양 의 피부를 동원하여 종양을 노출시다.</li>
	<li>가위 또는 메스 블레이드를 사용하여 종양을 근막에서 분리하십시오.</li>
	<li>종양을 절제하고 종양을 멸균 된 페트리 접시로 옮기고 종양을 작은 조각으로 자르고 종양에서 괴사 조직을 제거하십시오.</li>
	<li>향후 이식을 위한 은행 종양 조직.<ol>
<li>~ ~ 10mm x 10mm보다 작은 2-3 개의 작은 종양 조각을 가져 와서 ~ 1mm x 1mm보다 작은 조각으로 잘라냅니다.</li>
		<li>모든 다진 조직을 2 mL 극저온 바이알로 옮기고 1 mL의 동결 매체를 추가하십시오 (10 % DMSO + 90 % FBS).</li>
		<li>잘 섞어서 극저온 바이알을 드라이 아이스 위에 미리 냉각된 이소프로판올 계 세포 동결 용기에 넣습니다.</li>
		<li>용기를 하룻밤 동안 -80°C 냉동고에 보관한 다음 극저온 바이알을 액체 질소(LN2)보관에 옮김을 옮니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하류 어세이 (RNASeq, WES 등)에 대한 스냅 동결 조직.<ol>
<li>종양 조직 조각(~3 mm x 3 mm)을 극저온 바이알에 넣고 즉시 LN2에 극저온 바이알을 넣습니다. 바이알을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. PDX 치료 시험
참고: 치료 시험을 위해 필요한 수의 PDX 베어링 마우스를 생성하기에 충분한 종양 조직을 성장시키기 위해서는 2개의 확장 단계가 필요합니다.
<ol><li>LN 2로부터 뱅크드 PDX 조직을 함유하는저온 제거조직을 집어 들고, 종양 조직을 함유하는 동결매체가 막 녹기 시작할 때까지 37°C 수조에 저온을 놓는다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 미리 데운 HBSS-/- 저온의 내용물비, 및 세척 조직.</li>
	<li>펠렛 조직을 1,200 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하여.</li>
	<li>파스퇴르 파이펫으로 진공 흡인에 의해 종양 샘플에서 HBSS-/-를 제거합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에서 PDX 조직을 5cm 또는 10cm 페트리 접시에 넣고 젖은 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>위의 이식 프로토콜을 따라 극저온 바이알로부터 뱅크된 조직을 5NSG 마우스로 이식하여 PDX 종양 확장의 첫 번째 라운드를 수행하였다.</li>
	<li>일단 종양이 ~600-800mm 3에 도달하면, 수확 1-2 종양은 종양 조직 처리를위한 위의 프로토콜로 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다 : 기계적 해리, 콜라게나아제 소화 해리 절차.</li>
	<li>펠릿 세포는 6 mL의HBSS-/-----인공세포외 매트릭스(1:1 비율)에서 재중단하고, 피하 주사 ~50 NSG 마우스, PDX 종양 확장의 두 번째 라운드를 위해 마우스당 100 μL의 세포 혼합물을 가진.</li>
	<li>격주 캘리퍼스로 종양 크기를 측정합니다.</li>
	<li>3-5주에 ~100 mm 3의 종양 크기를 기다린 후 마우스를 그룹으로 무작위화하고 치료를 시작합니다.</li>
	<li>종양 크기가 최대 IACUC 승인 부피에 도달하면 치료를 중단하십시오.</li>
	<li>상기 수확 종양 프로토콜을 따라 파라핀 블록에 대한 스냅 냉동 종양 조각, 종양 조각을 수집한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본원에서 원발성 및 전이성 종양, 핵심 생검 및 FNA로부터 유래된 환자 조직을 가진 흑색종의 PDX 모델을 생성하는 것을 기술했다. NSG 마우스로 직접 이식될 때, 종양은 환자에서 관찰된 것과 유사한 형태학적, 게놈 및 생물학적 특성을 제시한다. 소수의 조직만 조사자가 사용할 수 있는 경우, 종종 FNA에서 발생하는 것처럼 PDX 기술은 DNA, RNA 및 단백질 특성화를 위한 종양 조직의 확장뿐만 아니라 전임상 약물을 허용하는 치료 시험을 허용합니다. 개발.
PDX 생착의 성공에 중요한 것은 물질 조사자의 품질이 시작되는 것입니다. 종양 조직이 섹션 1과 2에서 가능한 한 많이 보존되도록주의를 기울여야합니다. 중요한 것은, PDX 흑색종 모형의 치료에 대한 반응은 기증자 환자의 감도를 더 잘 되잠, 치료 저항을 퇴치하고 개선하기 위하여 향상된 치료 전략을 개발하기 위하여 강력한 전임상 조사를 허용하 응답의 내구성. 대부분의 전이성 흑색종 환자는 치료 (SOC) 치료의 기존 ...

전임상 모델은 질병 특성화, 암과 정상 세포에 고유한 실행 가능한 취약성 발견, 악용하는 효과적인 치료법 의 개발을 포함한 번역암 연구의 모든 측면에 매우 중요합니다. 환자의 전반적인 생존을 증가시키기 위해 이러한 취약점. 흑색종 필드에서, 수만개의 세포주 모형은 약 검열을 위해 무겁게 이용되었습니다, 와 함께 >4,000 혼자 우리 단에 의해 기여했습니다 (WMXXX 시리즈). 이러한 세포주 모델은 다양한 형태의 종족 흑색종(즉, 아크랄, 포벨 및 피상적 확산) 및 다양한 유전자형(즉, BRAFV600-돌연변이 체종 및 신경아세포종 RAS 바이러스 성 종양유전자)을 가진 흑색종 환자로부터 유래되었다. NRA Q61R-돌연변이]), 이는 클리닉1,2에존재하는 질병의 스펙트럼에 걸쳐.
명백하게, 흑색종 필드에 있는 가장 성공적인, 표적으로 한 치료 전략은 1) 흑색종의 ~50%에서 BRAF 돌연변이를 확인하는 환자의 종양의 게놈 특성에서 나타났습니다3 그리고 2) 전임상 조사에서 흑색종 세포주 모델을활용 4. BRAF/MEK 억제제 조합은 2014년 미국 식품의약국(FDA)에서 BRAF V600E/K 돌연변이를 활성화시키는 흑색종 항적 환자의 치료를 위해 승인되었으며>75% 응답률5를자랑한다. 이 초기 효험에도 불구하고, 저항은 다방면의 본질적이고 취득한 저항 기계장치 및 종양 내 이질성 때문에 거의 모든 경우에 급속하게 생깁니다. 불행히도, 세포주 모델은 플라스틱 용기에서 2차원 배양으로 재배될 때 대표적인 생물학적 이질성을 되풀이하지 않으며, 이는 조사자가 실험적으로 결정하려고 할 때 임상적으로 예측 잠재력을 가리는 것입니다. 흑색종의 특정 양식 또는 유전자형을 가진 환자에서 효과적일 지도 모르다 치료6. 환자를 가장 잘 모델링하는 방법을 이해하면 조사자가 현재 의 치료 표준 치료에 실패를 유도하는 치료 저항하는 하위 집단을 죽일 수 있는 치료 양식이 더 잘 개발될 수 있습니다.
세포주 모델의 제한된 예측 값에 가장 중요한 것은 세포주 모델이 처음 확립되는 방식입니다. 환자의 종양의 단세포 현탁액이 증식 및 침습적 잠재력의 변화를 포함하여 2 차원, 플라스틱 조직 배양 혈관에서 성장할 때 돌이킬 수없는 변화는 종양 클론 풍경에서 발생하며, 특정의 제거 유전 정보의 변경7. 이러한 흑색종 세포주 모델의 마우스로의 이종이식은 전임상 연구를 위해 생체내에서 가장 빈번히 사용되는 것을 나타낸다; 그러나, 이 전략은 또한 임상적으로 관찰된 복잡한 종양 이질성의 가난한 재발로부터 고통받고 있다. 이 결점극복하기 위하여는, PDX 모형을 포함하여 흑색종의 더 정교한 전임상 모형을 통합에 있는 증가관심사가 증가하고 있습니다. PDX 모델은 30년 동안 활용되어 왔으며, 폐암 환자에서 세포독성 제제에 대한 환자의 반응과 동일한 환자로부터 유래된 PDX 모델의 반응사이의 일치를 입증하는 정액 연구와 함께 8. 최근에는 PDX 모델을 업계와 학술 센터 모두에서 전임상 조사를 위한 도구로 활용하려는 드라이브가 있었습니다. PDX 모델은 인간 환자에서 종양 이질성의 우수한 재항복 때문에, 세포주 이종이식9보다 치료 최적화 노력에 보다 임상적으로관련이 있다. 흑색종에서는, 향상된 질병10의치료 관리를 무디게 하는 거대한 장애물이 있습니다. 임상적으로 관련있는 PDX 모델은 임상 내성을 모델링하고 치료 내성 종양을 치료하기 위해 임상적으로 이용 가능한 제제와 치료 전략을 식별하는 데 사용되어 왔다11,12. 간단히, PDX 모델을 생성하기 위해 여기에 제시된 프로토콜은 NOD/scid/IL2 수용체 널(NSG) 마우스로 1차 또는 전이성 흑색종(생검 또는 수술에 의해 수집)으로부터 신선한 조직의 피하 이식을 요구한다. 방법론적 접근법의 다른 변형은 다른 그룹에서 사용됩니다. 그러나 기본 핵심은13.

<table><tbody><tr><td>1 M Hepes</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>100x PenStrep&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 15140163</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS-/- (Ca++ 또는 Mg++ 없음)</td><td>MED</td><td>Cat # MT21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 트립신&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # T4549-100ML</td><td>10 mL 분취액은 &ndash에 보관됩니다. 20oC</td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>Cat# 50-118-0313</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV (2,000 u/mL)</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>고양이 #4189</td>는 <td>Collagenase IV 분말 재고(Worthington #4189, u/mg이 병에 표시되어 있으며 각 로트마다 다름)에서 HBSS-/-로 구성; 1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # C6295-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # D4527</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N' N'-테트라아세트산)</td><td>Merck</td><td>Cat # 324626.25</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td><td>Cat # 16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES</td><td>Cat # 15290-018</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>Cat # BW17518Z</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td><td>Cat # 050031</td><td></td></tr><tr><td>레보비츠의 L15 미디어&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 21083027</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354230</td><td>인공 세포 외 기질</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein</td><td>Cat # 025115</td><td>1-5mg/kg, 진통제</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2-수용체 null (NSG) 마우스</td><td>The Wistar Institute, 동물 시설</td><td></td><td>사육</td></tr><tr><td>PVA(폴리비닐 알코올)</td><td>SIGMA-ALDRICH CORPORATION</td><td>Cat # P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# MT10041CM</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>Cat # 2976-22</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>GALLARD-SCHLESINGER IND</td><td>CAT # 222-01-06</td><td></td></tr><tr><td>상처 클립</td><td>MikRon</td><td>Cat #427631</td><td></td></tr></tbody></table>

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

축적 된 증거는 분자 및 생물학적 특성이 인간 환자에서 생체 내에서 대 전통적인 2 차원 조직 배양 혈관에서 성장 흑색종 세포에서 다르다는 것을 시사한다. 이것은 생리적인 조건의 부재에 있는 시험관에서 강력하게 증가할 수 있는 흑색종 세포의 클론 인구의 병목 현상 선택 때문입니다. 또한, 2차원 조직 배양에서의 치료에 대한 반응은 전체적으로 흑색종 환자의 치료에 대한 반응을 충실하게 반영하지 못하며, 대부분의 임상 시험에서 치료 조합의 효능을 보여주지 못하는 것으로 나타났다. 체 외. 마우스로 흑색종 세포의 이종이식은 2차원 조직 배양 실험에서 결석한 생체내 문맥을 제공하지만, 생착에 사용되는 흑색종 세포는 이미 밑에 성장할 수 있는 세포를 위한 병목 현상 선택을 겪었습니다 세포주가 확립되었을 때 2차원 조건. 병목 현상의 결과로 발생하는 돌이킬 수없는 변경은 성장 및 침략 특성의 변화뿐만 아니라 특정 하위 집단의 손실을 포함합니다. 따라서 생체 내에서 인간의 상태를 더 잘 재현하는 모델은 전이성 흑색종을 가진 환자의 전반적인 생존을 효과적으로 증가시키는 치료 전략을 더 잘 예측할 수 있다. 환자 유래 이종이식(PDX) 기술은 인간 환자로부터 마우스 수용자로 종양 세포를 직접 이식하는 것을 수반한다. 이러한 방식으로, 종양 세포는 생체 내에서 생리적 스트레스 하에서 일관되게 성장하며, 종양이 인간 환자에 있을 때 존재하는 분자 및 생물학적 특성을 보존하는 2차원 병목 현상을 겪지 않습니다. 주목할만한, 전이의 장기 사이트에서 파생 된 PDX 모델 (즉, 뇌) 유사한 전이 용량을 표시, 치료 순진한 환자와 치료에 후천성 저항 환자에서 파생 된 PDX 모델 동안 (즉, BRAF / MEK 억제제 치료) 디스플레이 치료에 유사한 감도.

흑색종 PDX 모형을 위한 종양 조직은 다양한 다른 근원에서 올 수 있고 또한 개별적인 모형의 성장 역학 및 PDX 조직의 원하는 사용 당 가공될 수 있습니다. PDX 모델을 확립할 때 우선순위는 향후 사용을 위해 은행에 충분한 물질을가지고 있고 특성화를 위한 DNA를 가지는 것이다(그림 1).
일단 충분한 물질이 뱅크화되면, 종양 조직은 공식적인 치료 연구를 수행하기에 충분한 종양을 성장시키는 3가지 주요 방법 중 하나로 확장될 수 있다(도2A). 본원에 기재된 각각의 방법은 PDXs로부터종양의 확장을 허용할 것이다(도2B). 효소 소화 (콜라게나아제 IV)를 사용하여 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 만드는 것은 더 빠른 종양 성장을 허용 할 수 있으며, 하나...

환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 흑색종 분자 및 생물학적 특징을 보다 강력하게 회귀하고 기존의 플라스틱 조직 배양 계 세포 에 비해 치료 반응의 더 예측이다. 여기서는 새로운 PDX 모델 의 확립과 기존 PDX 모델의 특성화/실험에 대한 표준 운영 프로토콜에 대해 설명합니다.

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

PDX는 암 실험 전 임상 연구에 혁명을 일으켰습니다. 우리는 지금 실험실에서, 환자에서 무슨 일이 일어나고 있는지 모방할 수 있습니다. 그리고 지금 우리는 저항을 극복하는 방법과 장기적으로, 우리는 환자의 생존을 증가시킬 수있는 방법에 대해 작업 할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 민샤오입니다. 시작하려면 이전에 수집된 흑색종 조직을 멸균 페트리 접시로 옮긴다. 외과 가위, 메스 블레이드 및 집게와 함께 작업, 먼저 가능한 한 정상적인 조직에서 정상적인 조직을 제거합니다.그리고 종양 내중앙에 위치한 창백한 백색 이같은 조직에 의해 확인된 괴사 조직을 제거합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 초기 종양 덩어리를 수술 마우스 이식을 위해 거의 동일한 조각으로 세분화하십시오. 종양 조직이 기계적 해리에 너무 어려운 경우 메스를 사용하여 종양 덩어리를 가능한 한 미세하게 다진하여 슬러리를 형성하십시오.칼슘과 마그네슘 이온없이 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액으로 슬러리를 50 밀리리터 튜브로 옮춥니까. 섭씨 4도에서 4분간 220배 g의 원심분리기. 상체를 제거 한 후, 종양 조직의 1 그램 당 따뜻하고 신선한 소화 매체의 10 밀리리터에서 슬러리를 다시 중단합니다.튜브를 섭씨 37도의 수조에 20분간 놓고 5분마다 일회용 파이펫과 힘차게 섞습니다. 최대 50밀리리터의 HBSS를 사용하여 슬러리를 씻고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 4분간 220배 g로 씻어낸 다음 상무제를 제거합니다. 종양 조직의 1 그램 당 사전 따뜻하게 TEG 버퍼의 다섯 밀리리터를 추가 부드럽게 다시 중단 흔들어, 혼합하지 않고 2 분 동안 37섭씨에 튜브를 배치합니다.트립신을 담금질하려면 섭씨 4도에서 4분간 220배의 차가운 염색 매체와 원심분리기의 동일한 볼륨을 최소 한 권 이상 추가합니다. 상체를 제거한 후 종양 조직 1그램당 10밀리리터의 염색 매체를 추가하고, 위아래로 배관하여 펠릿을 다시 중단한다. 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 필터링하여 마우스 주입을 위한 단일 셀 서스펜션을 얻습니다.외과 적 절제 또는 외과 생검 조직을 이식하기 위해 NSG 6 ~ 8 주 된 마취 마우스의 허리에서 모발을 먼저 면도하여 약 1.5 센티미터에서 3 센티미터 부위를 머리카락없이 남깁니다. 종양 덩어리를 준비하고 페트리의 종양 슬러리를 외과 이식을 위해 개별 고분으로 나눕니다. 메스 블레이드를 사용하여 마우스 뒤쪽중앙에 약 5밀리미터 길이의 절개를 합니다.한 쌍의 집게로 작업자 맞은편에 있는 절개 쪽의 피부에 생명을 불어넣습니다. 반면에 가위를 사용하면 작은 가위 절단으로 근막을 부드럽게 절단하여 근육을 분리하여 종양 조직을 위한 포켓을 만듭니다. 메스 블레이드를 사용하여 종양 척 1척과 종양 슬러리 조직의 개별 마운드를 집어 들고 조직을 만든 주머니에 부드럽게 넣습니다.그런 다음 주머니에 종양 조직 마운드에 인공 세포 외 매트릭스 100 마이크로 리터를 추가합니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 양 끝에 절개를 당겨 상처 가장자리가 가까이 다가옵니다. 그런 다음 상처 클립을 하나 또는 두 개 바르게 발라 상처를 닫습니다.피하 진통제의 킬로그램 당 1 ~ 5 밀리 그램을 주입. 치유가 완전히 되면 약 7 일 후에 상처 클립을 제거하십시오. 만져볼 수 있는 종양을 확인하기 위해 매주 한 번 마우스를 모니터링합니다.종양이 원하는 볼륨에 도달하면 외과 용 집게를 사용하여 안락사 마우스의 종양에 인접한 피부를 들어 올리고 곡선 가위를 사용하여 수평 절단을하십시오. 무딘 분리 기술을 사용하여 종양의 양면과 종양 위에 피부를 동원하여 종양을 노출시합니다. 가위와 메스 블레이드를 사용하여 종양을 근막에서 분리합니다.종양을 잘라 멸균 페트리 접시로 옮기. 종양을 작은 조각으로 자르고 종양에서 괴사 조직을 제거하십시오. 향후 이식을 위해 종양 조직을 뱅크하기 위해 2~3개의 작은 종양 조각을 가지고 1밀리미터보다 작은 조각으로 잘라냅니다.모든 다진 조직을 2밀리리터 극저온 사악한 것으로 옮기. 냉동 용지 1 밀리리터를 넣고 잘 섞습니다. 유리병을 미리 냉각된 isopropanol 기반 세포 동결 용기에 넣고 밤새 영하 80도의 냉동고에 용기를 보관한 다음 바이알을 액체 질소 저장장치로 옮춥니다.하류 분해를 위한 동결 조직을 스냅하려면 종양 조직 조각을 극저온 유리병에 넣고 극저온 사악을 액체 질소에 즉시 넣고 바이알을 영하 80도 냉동고에 보관하십시오. 종양 조직을 성장시키는 세 가지 다른 방법을 비교했을 때, 효소 소화의 사용과 종양 세포의 단일 세포 현탁액이 가장 성공적이었다. 더 빠른 종양 성장을 허용하는 것 외에도, 종양 척 및 슬러리 방법은 5 에서 10 마우스로 만 확장 될 수있는 반면, 1개의 초기 종양이 10 에서 20 마우스로 확장되기에 충분했습니다.흑색종 환자 유래 xenograft 모형은 수시로 치료에 있을 때 환자가 표시한 약 감도를 반영합니다. 처음 BRAF 억제제에 반응하지만 궁극적으로 재발한 흑색종 환자로부터 유래된 이노크이식은 BRAF 단백질 억제제에 대한 초기 민감도, MEK 키나아제 억제제에 대한 초기 감도를 보였지만 종양은 궁극적으로 재발했다. 그것은 은행PDX 조직을 준비 할 때주의하는 것이 중요합니다, 이것은 미래의 PDX 확장에서 성공을 보장 할 것입니다, 치료 시험, 뿐만 아니라 특성화.PDX 물질, 단세포 RNA 염기서열 분석, 전체 외음질 염기서열 분석 및 프로테오믹 특성화를 통해 실험실이 치료 저항을 해부하기 위해 활용하는 많은 방법 중 하나입니다. PDX 기술은 연구원이 플라스틱에서 자란 전통적인 암 모형에 대하여 인간 적인 환자에 있는 종양 생물학을 더 잘 재구성하는 종양 세포를 사용하여 치료 저항을 조사할 수 있습니다. 이러한 이점을 통해 보다 예측적인 통찰력을 얻을 수 있습니다.연구원은 인간 적인 환자에서 파생 된 종양 조직을 취급할 때 항상 주의하고 생물 안전 수준 2개의 예방 조치를 이용해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 인간 유래 흑색종 세포를 면역이 저하된 마우스의 옆구리에 피하로 이식합니다. PDX 모델을 사용하면 생체 내  조건에서 관찰된 종양 이질성과 흑색종 공격성을 더 잘 요약할 수 있는 흑색종 세포의 전임상 조사를 수행할 수 있습니다.

환자 유래 이종이식 모델링: 흑색종 마우스 모델을 생성하는 기술

이 비디오는 흑색종 보유 기증자 제브라피시 모델에서 면역이 저하된 수혜자 캐스퍼 제브라피시로 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다. 수용 물고기의 종양 생착 및 증식을 시각화하는 데 도움이 됩니다.

피하 이식 분석: 기증자에서 수혜자에게 흑색종 세포를 이식하는 방법 제브라피시 모델

전이는 암의 독성에 지대한 영향을 미치며 사망의 약 90%를 차지합니다.  우리는 이 임상 현상에 대한 치료제의 효능을 결정하는 데 유용한 마우스의 전이성 흑색종 모델에 대한 프로토콜을 보고합니다.

동계 쥐 흑색 종 세포의 주입은 폐에서 그들의 전이성 잠재력을 확인하는 방법

여기, 우리이 두 아키텍처는 3D organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 생성 하는 프로토콜을 제시 하 고 다세포 복잡 한 기관/종양에 vivo에 의 하지만 같은 시간에 수용 체계적인 실험 내정간섭입니다.

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

정형외과 성 인간 간 전이성 포도막 흑색종 이종이식 마우스 모델은 배양된 인간 포도정 흑색종 세포주를 가진 환자 유래 종양 덩어리 및 바늘 주입 기술을 이용한 외과 정형외과 이식 기술을 사용하여 만들어졌습니다.

면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

우리는 정맥 기형의 뮤린 xenograft 모형을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 본 모델은 하이퍼 활성화 TIE2 및/또는 PIK3CA 유전자 돌연변이를 포함하는 환자 유래 내피 세포의 피하 주입을 기반으로 한다. Xenograft 병변은 VM 환자 조직의 조직 병리학적 특징을 밀접하게 재구성합니다.

정맥 기형에 대한 환자 유래 제노이식 모델

중추신경계 전이 PDX 모델은 인간 전이의 표현형 및 분자적 특성을 나타내므로 전임상 연구를 위한 우수한 모델입니다. 여기에서는 PDX 모델을 설정하는 방법과 전임상 연구에 가장 적합한 접종 경로를 설명합니다.

중추신경계 전이의 환자 유래 이종이식 모델의 확립 및 활용

본 프로토콜은 비비만 당뇨병(NOD)-scid 인터루킨-2 감마사슬 수용체(NSG) 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 설명합니다. 이식을 위한 인간 피부의 준비, 이식을 위한 마우스의 준비, 분할 두께의 인간 피부의 이식 및 이식 후 회복 절차에 대한 자세한 설명이 보고서에 포함되어 있습니다.

생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종이식 피부 모델

본 프로토콜은 인간 골육종 조직을 이용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명한다.

인간 골육종 조직을 이용한 환자 유래 이종이식 마우스 모델 구축

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

학습하세요 흑색종 환자 유래 이종이식 모델 구축 및 특성 분석 방법을 통해 암 생물학과 치료 반응을 정확히 재현하는 기술을 익히세요. 이 방법은 내성 극복과 생존율 향상 연구에 활용됩니다.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

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