Name: 녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 학습하세요 Chlamydomonas reinhardtii 단일 샘플에서 엽록소, 지질, 대사물질, 단백질, 전분을 동시 추출하는 다중 오믹스 방법. 이 고처리량 프로토콜은 데이터 변동성을 최소화하고 세포 주기 동안 대사 변화를 포괄적으로 분석합니다.

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<span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">우리는 훌륭한 기술 지원을 위해 Gudrun Wolter와 에엔 마이클리스에게 매우 감사드립니다. Giavalisco 연구소의 모든 회원들에게 도움을 주셔서 감사드립니다. 우리는 L A 히랄디의 교제를위한 연구 및 FAPESP 자금에 대한 막스 플랑크 사회에 감사드립니다

1. 클라미도모나스 린하르티의 사전 문화
<ol><li>TAP 배지의 고체 플레이트에서 에를렌마이어 플라스크로 세포를 HSM 배지12의200 mL로 옮기는 방식으로 클라미도모나스 린하르트티(균주 야생형 CC-1690 mt+)의 사전 배양을 준비한다.</li>
	<li>세포 밀도가 ~ ~ 2 x 106 세포 /mL에 도달 할 때까지 100 μmoles ·m-2·1 연속 광에서 24 °C에서 회전 셰이커에 사전 배양을 성장.</li>
</ol>2. 발효기에서 클라미도모나스 액체 배양의 동기화
참고: 온도, 빛 및 CO 2와 같은이 프로토콜에 제시된 파라미터는 변형률 CC-1690 mt+의 동기화에 특정합니다. 다른 변형률을 사용하여 동기화된 배양을 개발하려면 최적의 조건을 테스트할 필요가 있습니다.
<ol><li>사전 배양을 발효기 시스템으로 전송(맞춤형 발효기 설계의 경우 보충 도 1 참조), 재순환 쿨러에 연결하여 온도를 유지하고, 여과된 CO2(2%, v/v)의 버블링을 사용하여 교반하여 일정한 교반과 발효기의 하단에 자기 교반 막대.</li>
	<li>동기화를 시작하려면 34°C 및 200 μmoles·m/2·1빛 아래 12:12 h의 밝은 어두운 정권에서 발효기를 설정하고 1 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 HSM 배지에 500 mL의 배양을 포함하도록 합니다.</li>
	<li>24 시간 주기의 끝에서, 1 x 106 세포 /mL에 배양을 다시 희석 신선한 HSM 매체와 최소한의 교란을 연동 펌프와 함께 튜브 시스템을 사용 하 여, 먼저 배양의 뚜렷한 금액을 펌프 수 있도록 하 고 그 후 펌프 오토 클레이브 살균 매체. 참고 : 연동 펌프의 대안으로, 접종 주사기를 사용하여 배양을 철회 할 수 있으며, 신선한 배지의 필요한 부피는 멸균 조건하에서 발효기에 직접 첨가 될 수 있습니다.</li>
	<li>접종 4일째에 동기화된 배양을 얻기 위해 2.3단계를3회 반복한다.</li>
	<li>세포의 동기화를 검증하기 위해 2 시간 마다 간격으로 샘플을 수확하고 셀 카운터 및 크기 분석기를 사용하여 세포 밀도 및 세포 부피를 측정합니다(재료 표참조). 세포 밀도에 따라 샘플을 1:10에서 1:100 사이의 샘플을 희석하고 30 - 1900μm 3의 크기 범위에서 측정합니다.</li>
</ol>3. 클라미도모나스 세포 수확
<ol><li>15 mL 원원원심분리튜브에 라벨을 부착하고 액체 질소로 채워진 탈전을 준비한다.</li>
	<li>발효기의 내부 유리 튜브를 통해주사기(50 cm 3)를 사용하여 샘플을 수확한다. 샘플을 10-15 x 106 세포를 포함해야 하는 원유원심분리관에 분배합니다. 각 튜브로 전송된 체적을 기록하고 셀 카운터 및 크기 분석기를 사용하여 각 시점의 셀 밀도와 셀 크기를 측정합니다(재료 표참조).</li>
	<li>4000 x g에서 5 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 그런 다음 상류를 버리고, 펠릿을 액체 질소에 동결시키고 나중에 -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>4. 추출 완충제 및 엽록소, 지질 및 대사 산물 추출 준비
주의: 메탄올(MeOH) 및 MTBE는 가연성이며 장기간 노출 및/또는 접촉시 호흡기, 눈 또는 피부의 자극을 유발할 수 있습니다. 연기 후드에서만 조심스럽게 취급하고 추출 시 적절한 안전 절차 (실험실 코트, 안전 안경, 장갑 등)를 사용하십시오.
<ol><li>
추출 버퍼 1
	<ol>
<li>100mL 체적 플라스크에서 MTBE 75mL, 25mL의 MeOH(UHPLC 등급) 및 균질화(3:1, vol/vol)를 추가합니다.</li>
		<li>다음 내부 표준 솔루션 추가: 50 μL의 코르티코스테론 (MeOH에서 1 mg/mL), 50 μL 1,2-디힙타데카노일-SN-글리세로-3-포스포콜린 (17:0 PC) (클로로포름 HPLC 등급에서 1 mg/mL), 25 μL의 암피실린(1 mg/mL 의 00 mL) D-소르비톨-1-13C (물 UHPLC 등급에서 1 mg / mL).</li>
		<li>추출 버퍼를 깨끗한 유리 병에 옮기고 사용 전에 -20°C, 1시간에서 용액을 미리 냉각시. 추출을 위해 갓 준비된 용액을 사용하십시오. 이 용액은 최대 2 주 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
추출 버퍼 2
	<ol>
<li>100mL 체적 플라스크에 75 mL의 물 UHPLC 등급과 25 mL의 MeOH UHPLC 등급을 추가하고 균질화하십시오.</li>
		<li>추출 버퍼를 깨끗한 유리 병으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김. 추출에 신선한 용액을 사용합니다. 이 용액은 몇 주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 엽록소, 지질 및 대사 산물 추출
<ol><li>튜브를 액체 질소에 세포 펠릿 (10-15 x 106 세포 포함)으로 배열합니다.</li>
	<li>미리 냉각 (-20 °C) 추출 버퍼 1의 1 mL로 각 튜브에 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 참고: 점도가 낮은 추출 버퍼의 증발을 방지하려면 이 단계를 신속하게 수행합니다. 추출 버퍼 1을 추가한 후 실온에서 튜브를 유지합니다.</li>
	<li>소용돌이세포가 추출 혼합물 내에서 잘 균질화될 때까지 혼합물을 2 mL 미세원원지 튜브로 aliquot.</li>
	<li>초음파 처리 욕조를 사용하여 배양을 초음파 처리 (재료 표참조)를 얼음 냉각 수로 10 분 동안 초음파 처리하십시오.</li>
	<li>4 °C에서 60 분 동안 1000 rpm에서 궤도 셰이커에 모든 샘플을 인큐베이션.</li>
	<li>상 분리를 유도하려면 추출 버퍼 2의 650 μL을 추가합니다.</li>
	<li>소용돌이는 4 °C에서 5 분 동안 20000 x g에서 원심 분리를 잠시 뒤따랐다. 참고 :이 단계 후, 튜브의 바닥에 액체 상과 고체 펠릿의 분리가있다. 두 액체 단계의 혼합을 피하기 위해 조심스럽게 튜브를 처리하십시오. 상단 MTBE 단계는 지질과 엽록소를 포함, 하부 단계는 극성 및 반극성 대사 산물을 포함하는 동안. 하단의 침전된 펠릿에는 단백질, 전분 및 기타 불용성 분자가 포함되어 있습니다.</li>
</ol>6. 분수 의 알리인용
<ol><li>상부 MTBE 상 (지질)의 500 μL을 라벨이 붙은 1.5 mL 튜브로 옮니다. 진공 농축기(재료 표참조)를 사용하여 시료를 건조시키고 측정될 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	<li>200 μL 파이펫을 사용하여 나머지 MTBE 상을 제거합니다.</li>
	<li>하부 단계(극성 및 반극성 대사산물)의 650 μL을 새로운 표지된 튜브로 옮니다. 진공 농축기(재료 표참조)를 사용하여 시료를 건조시키고 측정될 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	<li>여분의 부피를 파이펫팅하여 나머지 하부 위상을 제거합니다.</li>
	<li>액체 질소에 고체 펠릿을 동결하고 추가 추출 될 때까지 -80 °C에서 저장합니다.</li>
</ol>7. 극성 대사 산물의 결정 (기본 대사 산물)
<ol><li>카보닐 기의 메톡시엠화를 위해 메톡사민-염산염/피리딘 용액에서 극상(단계 6.3)의 건조펠렛을 다시 중단시킨다.</li>
	<li>샘플을 37°C에서 90분 동안 가열합니다.</li>
	<li>앞서13일설명한 바와 같이 37°C에서 30분 동안 N-메틸-N-트리메틸실트리트리플로아미드(MSTFA)로 샘플을 유도한다.</li>
	<li>비행 시간 질량 분석법(GC-TOF-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피를 사용하여 1차 대사 산물을 분석합니다. 사용된 그라데이션 파라미터는 앞서 설명한 프로토콜14에따른 것이다.</li>
</ol>8. 비극성 대사 산물의 결정 (지질)
<ol><li>아세토니트릴:이소프로판올(7:3, v:v)의 혼합물에서 비극상(step 6.1)의 건조된 펠릿을 다시 중단시킨다.</li>
	<li>20000 x g에서 원심분리기를 UPLC 시스템을 사용하여 역단계 C8 컬럼(100 mm×2.1 mm×1.7 μm 입자)에서 분리합니다(재료 표참조). 두 개의 이동상은 1% 1% 암모늄 아세테이트, 0.1% 아세트산(Buffer A), 및 아세토니트릴:이소프로판올(7:3)을 함유한 물 1% 1M 암모늄 아세테이트, 0.1% 아세트산(Buffer B)을 함유하였다.</li>
	<li>앞서 설명한 프로토콜14에따라 그라데이션 매개 변수를 사용합니다.</li>
</ol>9. 엽록소 함량의 결정
<ol><li>MTBE 상(단계 6.1)의 100 μL을 900 μL의 900 μL의 메탄올과 혼합하여 실험샘플뿐만 아니라 블랭크된 방법에 대해서도.</li>
	<li>665 nm 및 652 nm의 파장에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하여 엽록소 a와 엽록소 b를 구별합니다. 참고: 유효한 농도 계산을 위해 흡수 범위는 0.1에서 1 사이여야 합니다. 필요한 경우 샘플을 희석하십시오.</li>
	<li>엽록소 a 및 b 함량을 계산하고, 또한 다음 수식에 따른 총 엽록소 함량을 계산한다. Chla = 16.82A665 – 9.28A652 Chlb = 36.92A652 – 16.54A665 Chla=b = 0.28A665 + 27.64A652 참고 : 수식은 바 - 수녀와 오하드15에의해 설명되었다 .</li>
</ol>10. 단백질 함량의 추출 및 측정, 소화 및 분석
참고: 단백질을 재중단시키기 위해, 펠렛 우레아/티우레아 완충제(6 M 요소, 2 M 티아오레아산프로테아제 및 인산아제 억제제)를 앞서16에기재된 프로토콜의 변형과 함께 사용하였다. 그러나, 선택의 어떤 버퍼 단백질의 재박탁에 사용할 수 있습니다.
<ol><li>다음 농도를 사용하여 단백질 완충액을 준비합니다: 6 M의 요소 및 티우레아 2 M.</li>
	<li>펠릿(6.5단계)을 단백질 완충액 200 μL(10.1)에 용해시켰다.</li>
	<li>샘플을 실온에서 30 분 동안 배양한 다음 20000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>단백질을 포함하는 상급체를 새로운 튜브로 옮김.</li>
	<li>브래드포드 분석17에 의한 단백질 농도를 결정한다.</li>
	<li>50 μg의 단백질인 솔루션을 선택 프로토콜로 소화합니다. 여기서는 다음 프로토콜을 사용합니다.<ol>
<li>5 mMDTT를 사용하여 단백질 샘플 50 μg를 30 분 동안 줄인 다음 어두운 실내 온도에서 30 분 동안 10 mM iodoacetamide를 사용하여 알킬화를 합니다.</li>
		<li>트립신/Lys-C 믹스를 25:1 단백질:프로테아제 비(w/w)에 넣고 37°C에서 3시간 동안 혼합하고 배양합니다.</li>
		<li>50 mM TrisHCl (pH 8)을 사용하여 샘플을 6 겹으로 희석하고 37 °C에서 밤새 인큐베이팅합니다.</li>
		<li>삼중불소산(TFA)을 0.5-1%의 최종 농도에 첨가하여 소화를 종료합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 후, C18 단계 팁을 사용하여 질량 분석 전에 펩티드의 탈염을 수행하고 소화 된 펩티드18을용해.</li>
	<li>가열하지 않고 진공 농축기 (재료 표참조)에 용액 2-5 μL을 남기고 거의 건조에 샘플을 집중시다.</li>
	<li>로딩 버퍼(5% 아세토니트릴, 0.5% 포름산)에서 시료를 재중단하고 나노 UPLC 시스템에 연결된 고분해능 질량 분석기(재료 표참조)를 사용하여 LC-MS/MS에 의한 펩타이드 혼합물을 분석합니다.</li>
	<li>UPLC 시스템을 사용하여 펩타이드를 분리(재료 표참조) 20 cm 역상 하전 표면 하이브리드(CSH) 컬럼(재료 표참조)에서 내경 75 μm 및 입자 크기 1.7 μm.</li>
	<li>시료 4 μL을 로드하고 300 nL/min의 유량으로 90분 그라데이션을 통과합니다.</li>
	<li>그라데이션을 설정합니다. 완충B의 3%(99.9% 아세토니트릴 + 0.1% 포산)로 설정된 이소크라틱 그라데이션이 있는 부분 루프-오프라인 설정을 사용하여 14분 동안 루프가 컬럼을 사용하여 온라인 위치로 이동하기 전에, 그 후 그라데이션은 50분 동안 선형으로 증가되고 20%까지 증가합니다. 버퍼 B에 도달합니다.</li>
	<li>다음 15 분 이내에 버퍼 B의 농도를 30 %로 증가시다. 그런 다음 다음 15 분에서 버퍼 B를 40 %로 증가시킨 후 버퍼 B의 90 %에 도달한 후 400 nL / min에서 열을 청소하고 추가로 10 분 동안 유지하십시오 (자세한 그라데이션은 표 1 참조). 조건)을 참조하십시오.</li>
	<li>마지막으로, 시스템을 300 nL/min의 유량과 1분 이내의 3% 버퍼 B의 농도로 다시 설정합니다. 참고: LCMS/MS 분석 후 확인된 단백질의 전체 목록은 표2에 제시되어 있습니다.</li>
</ol>11. 전분 함량의 추출 및 결정
참고: 총 단백질 및 전분 함량의 측정을 위해, 고체 펠릿은 앞서10에설명된 바와 같이 2단계 절차로 추출되었다.
<ol><li>세포 펠릿 (단계 6.5)에 80 % (v / v) 에탄올 500 μL을 넣고 80 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>실온에서 10 분 동안 4000 x g의 원심 분리기. 이어서 펠렛을 멸균수 250 μL에 용해시키고 100 mM 나트륨 아세테이트의 250 μL을 첨가합니다.</li>
	<li>99°C에서 3시간 동안 가열하여 전분을 가수분해한다. α-아밀라아제(샘플당 4.2 단위)와 α-아밀로글루코시다아제(샘플당 10단위)의 효소 혼합물을 추가하여 용해된 전분을 밤새 포도당 단량체로 소화합니다. 튜브를 밤새 37°C에서 배양합니다. 참고: 배양 후, 시료는 포도당 측정 전에 며칠 동안 -20°C 또는 -80°C에서 몇 달 동안 동결될 수 있습니다.</li>
	<li>소화 된 추출물을 20000 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상류물을 수집합니다. 5 mM MgCl2,60 mg/mL ATP, 36 mg/mL NADP 및 포도당-6-인산-탈수소 효소(샘플당 1 단위)를 포함하는 HEPES 버퍼(pH 7)의 100 mM에 상판(전분 유래 포도당 단량체 포함)을 용해시고 있습니다.</li>
	<li>전분 함량을 분석하기 위해 먼저 340 nm에서 기준선 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 헥소키나아제(샘플당 1단위)를 첨가하여 반응을 시작합니다. 마지막으로 96 웰 플레이트 리더와 340 nm에서 NADPH + H+ (포도당으로 소화 된 전분의 수준을 나타내는)의 증가를 측정합니다. 참고: 340 nm의 최대값(선형 범위를 초과하지 않아야 1)과 기준선의 차이는 소화된 전분의 포도당 농도와 동일합니다. 포도당 곡선은 mL 당 포도당의 nmol에 있는 포도당 사격량을 결정하기 위하여 만들어져야 합니다.</li>
</ol>

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이 문서에서는, 우리는 10-15 x 106 세포의 단 하나 펠릿에서 포괄적인 지질학, 대사체학, 전분 및 단백질학 분석을 위한 강력하고 높게 적용 가능한 추출 프로토콜을 설명했습니다. 이 방법은 10,14,21,22,23,24,25의 광범위한 세포 및 조직에 대한 여러 연구에서 성공적으로 구현되었습니다. ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. 여기에서, 우리는 클라미도모나스 라인하르트티 (CC-1690 mt+) 문화에서 수확한 단 하나 견본에서 다른 생체 분자의 다중 omics 분석을 위한 단계적인 파이프라인을 제출했습니다.
이 프로토콜은 다양한 생체 분자의 분석을 위해 여러 샘플을 한 번에 처리하기 위한 강력하고 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 그러나 기술적 변화를 최소화하기 위해 여러 가지 중요한 단계를 고려해야 합니다. 첫째, 세포의 수확은 세포의 생물학적 상태를 보존하기 위해 모든 수확 된 샘플에 대한 균일 한 조건을 유지하면서 가능한 한 신속하게 수행해야합니다. 우리는 세포를 수확하기 위해 원심 분리를 사용했지만, 대체 수확 전략은 샘플의 수확에 사용할 수 있습니다. 그러나, 다른 수확 전략이 세포의 대사 상태에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다37 따라서, 일관된 수확 방법은 모든 실험 샘플에 사용되어야한다. 둘째, 엽록소를 함유하는 상부 비극성 상이 건조되는 것을 피하는 것이 중요하며, 이는 용매에서 용해된 엽록소의 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에 샘플의 정규화 인자에 영향을 미칠 수 있다. 마지막으로, 단백질과 전분 펠릿을 얻기 위해 남은 극성 상을 제거하는 동안 주의를 기울여야하며, 전분 및 단백질 함량에 영향을 줄 수있는 펠릿을 방해하지 않도록해야합니다.
이에 따라 제시된 추출 프로토콜은 다중 omics 데이터 분석을 위한 몇 가지 이점을 제공한다. 필요한 샘플 aliquots의 수를 최소화 하는 것 외에도, 그것은 또한 다른 생체 분자에 대 한 수 득실 분석 결과 사이의 변이를 감소. 이것은 1 차적인 대사 산물, 지질 및 단백질 성 데이터에서 얻은 결과의 직접적인 비교를 허용합니다. 마찬가지로, 여러 복합 클래스의 동시 추출은 서로 다른 데이터 세트의 일관되고 균일한 정규화 전략을 허용합니다. 이는 건조또는 신선중량38 또는 셀 번호를 사용하여 정규화가 달성하기 어려운 경우에 특히 적용가능하다.
프로토콜은 복잡한 생물학적 샘플의 일상적인 스크리닝을 위해 구현될 수 있다. 이러한 전체적인 대사체, 지질학 및 단백질 데이터 세트는 신진 대사의 체계적인 변화에 대한 포괄적 인 정보를 제공 할 수 있습니다. 추가적으로, 단백질학 분석에서 얻은 데이터는, 대사 산물과 관련하여 단백질의 정량적(풍부) 및 정성적(수정) 변화에 대한 통찰력을 제공한다. 따라서, 오믹 데이터를 통합하면 생물학적 시스템의 유전적 또는 생물학적 및/또는 생체 학적 교란에 의해 유발 된 변화에 대한 심층적 인 정보를 공개 할 수 있습니다. 따라서, 특정 신진 대사 경로 또는 세포 과정의 분자 변화를 해명. 유사하게, 이러한 높은 처리량 데이터는 대사 공학을 위한 표적의 식별을 허용하고 게놈 규모 대사 모델37,39로부터의 예측을 구체화또는 테스트할 수 있다.

미세 조류는 천연 제품의 풍부한 소스 (예를 들어, 연료, 인간및 동물 영양, 화장품 및 약리학 물질). 미세조류1,2,3,4에서고부가가치 제품의 생산 효율을 높이기 위해 수많은 연구가 수행되고 있다. 신진 대사의 시스템 수준의 이해는 품질과 천연 제품의 수율을 개선하기위해 필수 조건이다 5,6,7. 기능성 게놈 기술과 향상된 질량 분석 방법의 출현으로 수천 개의 유전자, 전사체, 단백질 및 대사 산물을 동시에 모니터링할 수 있습니다. 그러나, 시간 과정 연구가 수행되는 경우에, 단세포 유기체에서 달성하기 위하여 수시로 수시로 어려운 심층적인 proteomics, lipidomics 및 metabolomics 연구 결과를 위해 다중 견본이 요구됩니다. 더욱이, 매우 복잡한 omics 데이터(즉, 프로테오믹, 지질학 및 대사체학)를 수집하기 위해 다른 프로토콜과 조합하여 상이한 샘플 aliquots의 수집 및 처리는 가변성을 도입하여 데이터의 통합을 만들어 내고, 이는 도전적인 작업을 수행합니다.
클라미도모나스는 세포 과정의 조사를위한 우수한 미생물 시스템뿐만 아니라 세포 주기와 신진 대사의 조정을 연구할 수있는 편리한 모델을 제공합니다. 이에 따라, 클라미도모나스 8의 동기화 배양물의 고분해능 전사체 프로파일링을 사용하여 세포 주기와함께 전사체 발현의 강력한 조정이 나타났다. 분석된 전사체의 약 80%는 24시간 세포 주기8에걸쳐 견고한 주위를 나타내었다. 마찬가지로, 건조 중량, 단백질, 엽록소, 클라미도모나스의 두 가지 상이한 균주의 아미노산 및 지방산은 샘플링이 매 4h 9마다수행된 연구에서 세포 분열과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 최근에는세포주기(10)의특정 단계에 기초하여 세포이동의 대사산물 및 지질역학이 변화하는 것으로 보고되었다. 상이한 생체 분자의 미묘한 변화는 강력한 메틸 테르트-butyl 에테르 (MTBE)를 사용하여 모니터링 할 수 있었다 : 메탄올 : 수성 추출 방법, 이는 포괄적 인 다중 omics 분석을위한 이상적인 출발점을 제공10 , 11.
제시된 프로토콜은 단일 샘플 aliquot에서 지질, 대사 산물, 단백질 및 전분을 동시에 추출하기 위한 재현 가능하고 효율적인 전략10을통해, 시간 해결된 대사체및 지질학적 연구를 위한 가이드 클라미도모나스 문화를 성장시키는 동기적 성장. 강력하고 재현 가능한 대사 및 지질학적 데이터(10)를예시하는 것 외에도, 여기서 동일한 펠릿으로부터 수득된 단백질성 샘플의 품질도 입증된다.

<table><tbody><tr><td>시약 및 표준</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>지질에 대한 내부 표준물</td></tr><tr><td>13C Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605514</td><td>대사산물에 대한 내부 표준, ISOTEC&reg; 안정 동위원소</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9393-5G</td><td>대사 산물에 대한 내부 표준</td></tr>, <tr><td>코르티코스테론</td><td>시그마 알드리치</td><td>27840-500MG</td><td>대사 산물에 대한 내부 표준, HPLC 등급</td></tr><tr><td>메탄올(MeOH)</td><td>Biosolve 화학 물질</td><td>13684102</td><td>ULC-MS 등급</td></tr><tr><td>메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)</td><td>Biosolve 화학 물질</td><td>13890602</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C mix</td><td>Promega</td><td>V5072</td><td>단백질의 효소 분해</td></tr><tr><td>Water</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>23214102</td><td>ULC-MS 등급</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td> 분획 2 ml Safe-lock microcentrifuge <td>tubes에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td>샘플 탈색에 사용</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorius Corporation</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>발효기 시스템</td><td>Glasbl &auml; 세레이 M&uuml; ller, 베를린, 독일</td><td></td><td>맞춤 제작 발효기 800ml 용량</td></tr><tr><td>Q-exactive HF Orbitrap 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td></td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf, 모델 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>역위상 (RP) 브리지드 에틸 하이브리드 (BEH) C8 컬럼 (100 mm&times; 2.1 mm 포함 1.7 &mu; m 직경 입자)</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186002878</td><td></td></tr><tr><td>내경이 75 &mu인 지질 RP CSH(Charged Surface Hybrid) 컬럼(Waters) 분석; m 및 1.7 &mu의 입자 크기; m</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186007477</td><td>단백질 분석</td></tr><tr><td>RP 고강도 실리카 (HSS) T3 컬럼 (100 mm&times; 2.1 mm 포함 1.8 &mu; m 직경 입자)</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186003539</td><td>대사 산물 분석</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>USC 300 TH</td><td>142-0084</td><td>표준 사전 설정 45kHz</td></tr><tr><td>UPLC 시스템에서</td> 초음파 처리 전력 <td>Waters Acquity UPLC 시스템 (Waters, Machester, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>스캔 속도 Maxi Vac 알파 증발기</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>Vortex-Genie 2, 모델 G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter 입자 수 및 크기 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605700</td><td>입자 (세포) 부피 및 수 분석기</td></tr></tbody></table>

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 omics 추출 방법

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

미세 조류는 고부가가치 화합물, 식품 및 연료 생산에 대한 연구의 초점이었습니다. 또한, 그들은 기본적인 세포 과정의 이해를 용이하게 귀중한 광합성 모델입니다. 시스템 전반의 연구를 통해 유기체의 분자 기능에 대한 포괄적이고 심층적인 이해를 가능하게 합니다. 그러나, 더 높은 오차 및 가변성을 소개하는 프로테오믹스, 지질학 및 대사체학 연구 결과를 위해 다중 독립적인 견본 및 프로토콜이 요구됩니다. 녹색 조류 클라미도모나스 라인하르트티의 단일 샘플에서 엽록소, 지질, 대사 산물, 단백질 및 전분을 동시에 추출하기 위한 강력한 높은 처리량 추출 방법이 여기에 제시되어 있습니다. 도시된 실험 설정은 12h/12h 의 빛/어두운 조건을 사용하여 동기화된 클라미도모나스 문화권용입니다. 샘플은 다양한 분석 플랫폼을 사용하여 얻은 대사산물, 지질 및 전분 데이터가 잘 부합한다는 것을 입증하기 위해 24시간 세포 주기에 걸쳐 수집하였다. 또한, 동일한 추출 프로토콜을 사용하여 수집된 단백질 샘플을 사용하여 상세한 프로테오믹스 분석을 수행하여 품질 및 재현성을 평가했습니다. 데이터를 기반으로, 설명 된 방법은 기본 및 응용 연구 모두에 대한 더 큰 자신감으로 다양한 생화확적인 경로와 그 기능에 대한 이해를 사전에 강력하고 재현 가능한 접근 방식을 제공한다는 것을 추론 할 수 있습니다.

클라미도모나스 린하르티 CC-1690 문화권 동기화 주어진 프로토콜에 대한 대표적인 결과를 입증하기 위해, 우리는 동기화된 클라미도모나스 레인하르트티 어양양항10으로부터샘플을 수확하고 추출한 후 얻은 다중 오믹스 데이터를 제시한다. 클라미도모나스의 동기화된 배양은 특정 시점에서 균일한 성장 상에 속하는 세포를 포함한다. 클라미도모나스 배양액은 12h/12h 의 빛/암흑 주기, 34°C에서 200 μmol·m-2·s-1및 CO2 농도2%, v/v, 균주 CC-1690 mt+ 10에 대한 최적의 농도로 설명되었다. . 이러한 조건은 이전에 다양한 세포 주기 매개 변수10을사용하여 최적화되고 검증되었습니다. 그림 1은 동기화된 배권의 고유한 시점에서 쿨터 카운터로 측정된 셀 크기 분포를 표시합니다. 세포 부피의 변화는 세포가 빛 상에 걸쳐 크기로 성장함에 따라 관찰 될 수 있으며, 10 h에서 빛 단계의 끝에서 시작되는 딸 세포의 방출이 뒤따릅니다. 일단 모든 딸 세포가 풀어 놓이면, 새로 풀어놓인 딸 세포가 다음 주기 10을 시작하기 위하여 처분될 때 세포 양량에 있는 이동이 관찰될 수 있다 (도 1).
시료 채취, 처리 및 -추출 시료의 신속한 수확은 원심분리를 사용하여 수행되고 상상액을 폐기한 후, 펠릿은 추출될 때까지 -80°C에서 보관될 수 있다. 전술한 바와 같이(단계 5), MTBE 추출 결과는 3개의 뚜렷한 단계로 나타났다: a) 유기상은 엽록소 수치뿐만 아니라 지질을 측정하기 위해 사용되었고(정규화 인자), b) 극성 상은 GCMS에 대사산물을 측정하기 위해 수집되었고, c) 펠릿을 사용하였다. 전분 함량과 단백질을 측정할 수 있습니다. 그림2에 다른 단계와 고용분포에 대한 개요가 나와 있습니다.
극성 및 비극성 대사 산물 극성 분획의 GCMS 분석에 기초하여, 65개의 대사산물이 아미노산, 핵산, 당분해의 중간체, 글루코네오제네시스, 트리카르복실산 주기, 펜토오스 인산 통로 및 폴리아민을포함하는 비고(그림 3A)를 포함하였다. 지질을 함유하는 중성단계의 LCMS 분석은 다양한 지질군, 즉 포스파티딜리체롤, 포스파티딜레탄올라민, 설포퀴노보실 디아실글리세롤을 포함하는 204개의 뚜렷한 지질 종의 확인으로 이어졌으며, 모노갈락토실디아실글리세롤, 디갈락토실디아실글리체롤, 디아실틸트리메틸호세린, 지방산, 디아실글리세라이드 및 트리아실글리세라이드. 세포 주기에 걸쳐 대사 산물 및 지질에 있는 글로벌 교대를 구상하기 위하여는, 주요 성분 분석 (PCA)가 이용되었습니다. PCA는 대사체학과 지질학적 데이터 모두에 대해 빛과 어두운 위상의 분리를 표시합니다. 더욱이, 반주기적(부분적으로 열린 원)은 두 데이터 모두에 대해 발견될 수 있다(도3C,D). 원형 패턴의 부분적인 갭은 세포 주기의 24시간에서 샘플이 0.25시간 후에 빛에 노출된 후 세포 주기의 시작 부분에서 수집된 샘플과 는 대조적으로 어두운 하에서 수집되었다는 사실에 기인한다(그림3C) ,D).
단백질 및 전분 분석 MTBE 추출의 결과로 얻어진 단백질 펠릿의 품질을 조사하기 위해, 6개의 샘플을 프로테오믹 분석에 사용하였다. 50 μg의 단백질/샘플을 소화하여 얻은 프로테오믹스 데이터의 품질은, 전산 품질 관리 도구-PROTeomics 품질 관리(PTXQC)19를사용하여 조사되었으며, 이는 단백질화학 데이터의 재현성과 고품질을 나타냅니다. 모든 복제(추가 그림1). 단백질의 분자 기능 적 범위는 REVIGO20을사용하여 검사되었습니다. 확인된 2463개의 단백질의 기능적 농축에 대한 개요(표 2참조)는 도 4A에제시되어 있다. 단백질 추출 후 남은 펠릿은 다양한 복제체 들 사이에서 낮은 표준 편차로 나타난 바와 같이전분의 재현 가능한 정량화를 위해 사용되었다(도 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig1.jpg"> 그림 1: 클라미도모나스 reinhardtii에서세포 주기의 상이한 단계에 걸쳐 세포 부피의 변화의 예시예. 셀 볼륨을 나타내는 x축은 셀 번호를 나타내는 y축동안이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig2.jpg"> 도 2: 다중 omics 추출 셀 펠릿 동안 상이한 단계의 고용에 대한 예견된 워크플로우. 그림은 Juppner, J. 외에서 재사용되었습니다. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig3.jpg"> 도 3: 기재된 프로토콜을 사용하여 확인된 대사산물 및 지질의 대표적인 예. (A) GCMS 분석에 의해 확인된 대사산물 클래스. (B) LCMS 분석에 의해 확인된 상이한 클래스에 속하는 지질 종. (C) 24시간 세포 주기에 걸쳐 대사산물 수준의 원리 성분 분석. (D) 24시간 세포 주기에 걸쳐 지질의 원리 성분 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59547/59547fig4.jpg"> 도 4: 단백질 및 전분 데이터의 대표적인 예. A) LCMS 분석을 사용하여 확인된 단백질의 분자 기능적 농축, REVIGO 20 B)를 사용하여 그려진 트리맵 프로토콜의 재현성을 나타내는 대표적인 전분 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/59547fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 1: 클라미도모나스 배양물의 온도 및 폭기 제어 동기 성장을 위한 발효기 시스템의 맞춤형 설계. 그림은 Juppner, J. 외에서 재사용되었습니다. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S1.eps">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 프로테오믹스 데이터 품질에 대한 대표적인 결과. 히트맵은 계산 PTXQC 도구19를사용하여 플롯 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/S2.eps">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시간(최소)</td>
			<td>버퍼 B에서 버퍼 A까지 %</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0~15분</td>
			<td>0 ~3%의 선형 그라데이션</td>
			<td>완충제 A: UPLC 등급 의 물에서 0.1% 포산</td>
		</tr>
<tr>
<td>약 15~75분</td>
			<td>선형 그라데이션3%에서 30%로</td>
			<td>완충제 B: 60% UPLC 등급 아세토니트릴에서 0.1% 포르믹산</td>
		</tr>
<tr>
<td>75~90분</td>
			<td>선형 그라데이션 30%에서 40%</td>
			<td>유량 300 nL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>90 ~94분</td>
			<td>40%에서 90%까지의 선형 그라데이션</td>
			<td>사출 량 4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>약 94~104분</td>
			<td>90 %와 세척 열</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>105~120분</td>
			<td>3%에서 15분 동안 열의 균형을 조정합니다.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 펩티드 샘플의 액체 크로마토그래피, 그라데이션 파라미터.
표 2: LCMS/MS 분석 후 확인된 단백질 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59547/Table_2.xlsx">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

다중 생체 분자의 시스템 전반의 분석은 생물학적 과정에 대한 기능적 및 기계적 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 따라서, 광범위한 프로토콜은 동기화된 클라미도모나스 배양으로부터 수확된 단일 샘플로부터 지질, 대사산물, 단백질 및 전분의 높은 처리량 추출에 대해 설명된다.

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

시스템 전반의 연구는 생물학적 기능에 대한 심층적인 이해를 위해 매우 중요합니다. 그러나 다양한 omics 플랫폼에는 여러 개의 독립적인 샘플이 필요하며 데이터에 높은 양의 가변성을 도입합니다. 이 방법은 모델 녹색 조류, 클라미도모나스 라인하르트티의 단일 샘플에서 엽록소, 지질, 대사 산물, 단백질 및 전분의 동시 추출을 위한 견고하고 높은 처리량 전략을 제공합니다.엽록소, 지질 및 대사 산물 추출의 경우 수확된 클라미도모나스 세포 펠릿의 튜브를 액체 질소에 배치합니다. 각 튜브의 펠릿을 20도 추출 버퍼 1밀리리터로 재차 놓습니다. 낮은 점도 추출 버퍼의 증발을 피하기 위해, 세포가 추출 혼합물 내에서 균질화 될 때까지 튜브를 신속하게 소용돌이시키고 용액을 두 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 알리쿼트합니다.10분 동안 1, 000회전의 궤도 셰이커에서 10분 동안 얼음 차가운 물에 있는 초음파 욕조에서 문화를 초음파 처리하여 섭씨 4도에서 60분 동안 분당 000회전합니다. 인큐베이션이 끝나면 650마이크로리터의 추출 버퍼 2를 추가하고 원심분리 전에 시료를 잠시 소용돌이시다. 분획을 알리인용하려면 상부 MTBE 지질 단계의 500 마이크로리터를 라벨이 부착된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오.200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 지질 상을 제거하고 낮은 극지 및 반극성 대사 산물 단계의 650 마이크로리터를 새로운 표지된 튜브로 옮춥시다. 남은 하위를 제거하고 80도 저장을 위해 액체 질소에 고체 펠릿을 동결시키기 위해 초과 부피를 흡인한다. 극성 대사 산물 결정의 경우, 카보닐 군의 메톡시미화를 위한 메톡사민 염산염 피리딘 용액에서 극지상의 말린 펠릿을 재중단하고 90분 동안 30°C에서 시료를 가열한다.인큐베이션의 끝에서, 표준 프로토콜에 따라 섭씨 37도에서 30 분 동안 n-메틸-n-trifluoracetamide로 샘플을 파생시. 가스 크로마토그래피를 비행 시간 질량 분석법에 결합하여 1차 대사산물을 분석합니다. 비극성 대사 산물 결정의 경우, 원심분리에 의한 펠릿을 원심분리량에 의해 펠릿에 부피 아세토닐릴에 7~3부량의 혼합물로 비극성 상의 말린 펠릿을 재연한다.그런 다음 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템에서 역상 C8 컬럼의 샘플을 분리합니다. 엽록소 함량 측정을 위해 MTBE 상의 마이크로리터 100개와 900마이크로리터900 마이크로리터를 90%의 메탄올과 혼합하여 블랭크 방법과 실험용 시료를 사용한다. 그런 다음 655 및 652 나노미터 파장에서 흡광도계를 측정하여 엽록소 와 엽록소 b를 구별하고 엽록소 a 및 b 함량 및 총 엽록소 함량을 계산합니다.단백질 추출을 위해, 단백질 완충제의 200 마이크로 리터에 하부 펠릿을 용해하고 30 분 동안 실온에서 샘플을 배양. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리시 시료를 원심분리하고 단백질 함유 상체를 새로운 튜브로 전달한다. 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.단백질을 소화하기 위해, 5 밀리머 디티오스레이톨에서 샘플 15 마이크로그램을 30분 간 줄이고, 실온에서 30분 동안 10밀리알라 요오도아세타미드를 흡입하여 빛으로부터 보호합니다. 알킬레이션의 끝에서 트립신/Lys-C 용액을 25 대 1의 단백질로 혼합하여 비율을 프로테아제하고 37°C에서 3시간 동안 시료를 배양합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 50 밀리몰러 트라이 Hcl에서 6배 희석합니다.다음날 아침, 소화 후 0.5~1%의 최종 농도로 삼불화산으로 소화를 종료하고, 시료를 건조에 가깝게 농축하여 가열 없이 진공 농축기에 2~5마이크로리터를 남깁니다. 로딩 버퍼에서 샘플을 다시 일시 중지합니다. 나노 초압 액체 크로마토그래피 시스템에 연결된 고해상도 질량 분광계를 사용하여 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법에 의해 펩티드 혼합물을 분석한다.펩티드를 분리하려면 4개의 마이크로리터의 시료를 20센티미터 역위상 하전 표면 하이브리드 컬럼에 적재하고 내지름 75마이크로미터와 입자 크기는 1.7마이크로미터이다. 루프가 열과 함께 온라인 위치로 이동하기 전에 14분 동안 유지되는 버퍼 B의 3%로 설정된 등방성 그라데이션으로 부분 루프 오프라인 설정을 사용하여 20%버퍼 B에 도달할 때까지 그라데이션이 50분 동안 선형으로 증가합니다. 세포부피의 변화는 세포가 광상 전반에 걸쳐 크기가 커짐에 따라 관찰될 수 있으며, 그 다음에는 10시간으로부터 광상 끝에서 시작되는 딸 세포의 방출이 뒤따릅니다.일단 모든 딸 세포가 풀어 놓이면, 새로 방출된 딸 세포가 다음 주기를 시작하기 위하여 처분되기 때문에 세포 부피의 교대를 관찰할 수 있습니다. 극지 분획의 가스 크로마토그래피 질량 분광분석 분석에 기초하여, 이 대표적인 실험에서는 65개의 대사산물이 주석을 지었다. 지질 함유 중성 상에 대한 액체 크로마토그래피 질량 분석은 다양한 지질 클래스를 포함하는 204개의 뚜렷한 지질 종의 식별으로 이어졌다.주요 성분 분석은 세포 주기 전반에 걸쳐 대사 산물과 지질의 글로벌 변화를 시각화하는 데 사용할 수 있으며, 암타볼로믹스와 지질 데이터 모두에 대해 관찰된 반순환 상뿐만 아니라 빛과 어두운 위상을 분리한다. 여기서, 2, 463의 기능적 농축에 대한 개요가 증원된 단백질을 나타내고 있다. 단백질 추출 후 나머지 펠릿은 다양한 복제 중 낮은 표준 편차에 의해 표시된 전분의 재현 가능한 정량화에 사용될 수 있다.상부 엽록소 유기 상의 건조를 피하는 것이 중요합니다, 이것은 용매에 있는 엽록소의 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 견본에 대한 정규화 인자에 영향을 미칩니다. 추출된 분자 종의 생화학적 특성화를 위해 다양한 분석 적 절차를 구현할 수 있다.

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