Name: 모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 모 세관 전기 영동-질량 분광법을 위한 부착 세포의 수성 대사 산물 추출 방법을. 이 기술은 암 대사체학 연구에서 생물학적 표지자 발굴과 재현성 있는 데이터 획득에 필수적입니다.

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쇼 나이 지역 산업 진흥 센터의 모든 회원 들에 게 도움을 주셔서 감사 합니다. 이 작품은 야마가타 현과 쓰루 오카 시의 연구 기금, 국립 암 센터 연구 개발 기금 [보조금 번호 28-9]에 의해 부분적으로 지원 되었으며, 일본 과학 진흥 협회 (JSPS)가 카 엔 나는 [교부 수 17K07189] HM.

1. 첫째 날의 세포 배양
참고: 대사 산물 추출에 대 한 각 샘플은 적당 하지만 완전히 confluent (약 2 ~ 5 백만 개의 세포가 포함 되어 있는) 단일 100 mm 조직 배양 접시에서 준비 해야 합니다. 분석에 필요한 요리의 수를 계산 하 고 그에 따라 준비 합니다.
<ol><li>배양 HCC827에서 37 ° c에서 5% CO2의 세포를 rpmi-1640 배지에서 10% 소 태아 혈 청 (FBS)으로 보충 하였다.</li>
	<li>100 mm 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡 기 합니다.</li>
	<li>칼슘과 마그네슘이 없는 인산 완충 식 염 액 (PBS) 용액 2 mL를 사용 하 여 각 접시에 있는 세포를 세척 합니다. PBS 용액이 요리의 표면을 완전히 덮을 수 있도록 각 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>배양 접시에서 세척 완충 액을 흡입 합니다.</li>
	<li>따뜻한 0.25% 트립 신-EDTA 용액을 37 ° c에 넣고 5Ml의 트립 신-EDTA 용액을 5 mL 혈 청 학적 피 펫과 함께 첨가 한다. 트립 신이 요리의 표면을 완전히 덮을 수 있도록 각 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>약 5 분 동안 37 ° c에서 배양 요리를 배양 합니다.</li>
	<li>요리 당 미리 데워 진 완전 성장 배지 4 mL를 추가 하십시오. 여러 번 부드럽게 파이 펫 팅 하 여 배지에서 세포를 소생 시킵니다.</li>
	<li>각 세포 현 탁 액을 별도의 15ml 원추형 튜브로 전송 하 고 5 분 동안 800 × g 에서 원심 분리 합니다.</li>
	<li>미리 데워 진 완전 성장 배지의 2 mL에 각 세포 펠 렛을 소생 시켰다.</li>
	<li>자동 셀 카운터와 0.4% 트리 판 blue 솔루션을 사용 하 여 셀의 총 수와 퍼센트 생존 율을 결정 합니다.<ol>
<li>10 μ l의 세포 현 탁 액과 10 μ l의 0.4% 트리 판 청색 용액을 섞어 줍니다.</li>
		<li>모 세관 작용을 통해 시료의 10 μ l를 세포 계수 챔버로 밀어 넣습니다.</li>
		<li>챔버 슬라이드를 자동 셀 카운터에 삽입 합니다. 전송 된 표시등이 자동으로 켜지 고 계측기가 셀에 자동으로 초점을 맞춥니다.</li>
		<li>캡처 버튼을 눌러 이미지를 캡처하고 결과를 표시 합니다.</li>
		<li>필요한 경우, 원하는 세포 농도를 얻기 위해 성장 배지를 더 추가 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mm 세포 배양 접시 당 약 1 ~ 2.5 백만 세포를 종자. 참고: CE-MS 분석에 의해 결정 된 대사 산물 농도는 생존 가능한 세포의 수에 기초 하 여 정상화 될 것 이다. 세포 계수를 목적으로, 각 그룹에 대해 적어도 하나의 여분의 시드 배양 접시를 준비 할 필요가 있다.</li>
	<li>18 시간 동안 37 ° c에서 5% co2로 배양 접시를 배양 합니다.</li>
</ol>2. 시 약의 제조
<ol><li>상용 내부 표준 용액을 L-메티오닌 설 폰 및 d-장뇌-10 술 폰을 초순 수에 1000를 포함 하 여 희석 한다. 참고: 80 샘플 미만인 경우, 50 mL 용적 플라스 크에 내부 표준 용액 1과 45 mL의 초순 수의 50 μ l를 혼합 한 다음 초순 수로 용액을 최대 50 mL까지 가져온다.</li>
	<li>초순 수 내 세척 완충 액으로 0.05 g/mL만 니 톨 용액을 제조 한다. 참고: 30 개 미만의 샘플에 대해서는 초순 수 500 mL의만 니 톨 25g을 녹여 주세요. 100 mm 배양 접시 당 약 15ml의 워시 버퍼가 필요 하므로 샘플 수에 따라 충분 한 양의 세척 완충 액을 준비 하십시오.</li>
</ol>3. 사전 세척 원심 필터 장치
<ol><li>각 원심 필터 유닛의 필터 컵에 초순 수 250 μ l를 피 펫 한다 ( 재료 표참조). 참고: 샘플 당 2 개의 필터 유닛이 필요 합니다.</li>
	<li>필터 유닛을 단단히 캡 하 고 4°c에서 9100 × g 에서 5 분간 원심 분리기.</li>
	<li>각 여과 액의 부피 확인-첫 번째 짧은 스핀 중에 상당한 여 액이 축적 된 경우, 필터 장치에 결함이 있을 수 있습니다. 이 경우 필터 유닛을 버리고 대신 새 필터 유닛을 사용 하십시오.</li>
	<li>필터 유닛의 뚜껑을 단단히 닫고 4°c에서 30 분 동안 9100 × g 로 다시 원심 분리 하십시오.</li>
	<li>필터 컵에 초순 수가 남아 있지 않은지 확인 하십시오. 각 수집 튜브에서 여과 된 초순 수를 파이 펫으로 제거 하 고 폐기 하십시오. 참고: 필터 컵의 잔류 수를 피 펫과 함께 제거 하면 필터가 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>필터 컵을 컬렉션 튜브로 교체 하십시오. 참고: 건조 시 필터가 손상 될 수 있으므로 1 시간 이내에 원심 필터 유닛을 사용 하십시오.</li>
</ol>4.2 일째 세포 배양
<ol><li>
인큐베이터에서 100 mm의 배양 접시를 꺼내 세요. 참고: 권장 세포 배양 기간은 18 시간입니다.</li>
	<li>각 100 mm 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡 기 한다.</li>
	<li>각 접시에 적절 한 농도의 화합물 또는 약물을 포함 하는 10 mL 세포 배양 배지를 추가 하 여 세포 층을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 참고: 데모용으로,이 실험에서는 PBS에 녹 인 250의 10 μ l (최종 농도 250 μ m)을 추가 했습니다.</li>
	<li>대조 군으로 디 아 미드 또는 PBS의 존재 하에서 30 분 동안 37 ° c에서 배양 접시를 배양 하였다.</li>
	<li>각 100 mm 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡 기 한다.</li>
	<li>각 요리의 가장자리에 5%만 니 톨 용액 2 mL를 부드럽게 추가 하 여 세포 층을 교란 하지 않도록 조심 하 고 접시를 살짝 기울입니다. 주: PBS 또는 식 염 수 용액은 CE-MS 기반 대사체학 분석을 방해 하 고 측정 결과에 악영향을 미치므로 세척 버퍼로 사용해 서는 안 됩니다.</li>
	<li>각 배양 접시에서 세척 완충 액을 흡입 한 다음 접시 당 10 mL의 세척 완충 액을 부드럽게 추가 하 여 세포를 다시 세척 하 고 접시를 약간 기울여 줍니다.</li>
	<li>각 배양 접시의 가장자리에서 세척 완충 액을 완전히 흡 기 시킵니다. 참고: 셀을 흡입 하지 않도록 주의 하면서 가능한 한 많은 세척 완충 액을 흡입 하십시오. 잔류만 니 톨은 CE-MS 분석을 방해할 수 있다; 세포의 포부는 세포의 수를 감소 하 고 따라서 데이터 정규화에서 오류의 원인이 될 것입니다.</li>
</ol>5. 배양 세포에서 대사 산물 추출
<ol><li>배양 접시 당 800 μ l의 99.7% 메탄올을 첨가 하십시오. 각 배양 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 표면 전체를 덮으 십시오. 30 초 동안 상 온에서 접시를 남겨 주세요.</li>
	<li>파이 펫의 끝을 메탄올에 침 지 하 고 위아래로 여러 번 부드럽게 파이 펫 팅 하 여 접시 당 희석 된 내부 표준 용액의 550 μ l을 천천히 추가 하십시오.</li>
	<li>각 배양 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 표면 전체를 덮으 십시오.</li>
	<li>30 초 동안 상 온에서 접시를 남겨 주세요.</li>
</ol>6. 세포 추출 물 한 외 여과
<ol><li>추출 된 용액을 각 배양 접시에서 별도의 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>튜브를 4 ° c에서 2300 × g 에서 5 분간 원심 분리기.</li>
	<li>각 상층 액의 350 μ l를 시료 당 2 개의 원심 필터 유닛으로 전달 합니다. 참고: 각 배양 접시에서 추출 된 용액의 총 700 μ l가 2 개의 필터 튜브 (350 μ l/튜브)로 전달 됩니다.</li>
	<li>필터 튜브를 4 ° c에서 약 2 시간 동안 9100 × g 에서 원심 분리 하 여 필터 컵에 액체가 남지 않습니다.</li>
	<li>필터 컵을 제거 하 고 단단히 수집 튜브의 뚜껑을 닫습니다.</li>
</ol>7. 샘플 증발
<ol><li>원심 증발 기 준비-일반적으로 증발 기, 콜드 트랩 및 진공 펌프로 구성 됩니다.</li>
	<li>원심 증발 기에 수집 튜브를 놓습니다. 참고: 튜브의 뚜껑을 열어 두십시오.</li>
	<li>실 온에서 진공 조건 하에서 추출 된 샘플 용액을 증발 시킵니다. 주: 회전과 압력의 수에 대 한 일반적인 구성은 각각 1500 rpm 및 1000 Pa이 고, 일반적으로 샘플을 완전히 증발 시키기 위해 약 3 시간 소요 됩니다.</li>
	<li>수집 튜브에 액체가 남아 있지 않은지 확인 하 고 튜브 뚜껑을 단단히 닫으십시오.</li>
	<li>대사체학 분석까지 초 저온 (-80 ° c) 깊은 냉동 고에 수집 튜브를 보관 하십시오.</li>
</ol>8. CE-MS에의 한 대사체학 분석
<ol><li>여과 액을 세 륨-MS 분석 직전 초순 수의 50 μ l로 소생 시켰다.</li>
	<li>이전에 설명 된 방법에 의해 CE-ms 분석을 수행12,13 모 세관 전기 영동 시스템을 사용 하 여 비행 시간 질량 분 광 계 시스템은 등 용 매 펌프, ce-ms 어댑터 및 ce-ESI-ms 분무기가 장착 되어 있습니다. 참고: 두 시스템은 시스템 벤더의 소프트웨어로 제어할 수 있으며 용융 실리 카 모 세관 (50 μ m 내경 × 80의 전체 길이)으로 연결 됩니다.<ol>
<li>계측기 및 샘플 바이 알을 설정 하 고 모 세관 카세트를 사용 하 여 모 세관을 준비 하 고 음이온 또는 양이온 분석 모드에 따라 칼 집 액체 및 적절 한 전기 영동 완충 액을 보충 한 다음 전압을 적용 하십시오. 참고: 계측 및 분석 조건에 대해서는12,13에서 자세히 설명 합니다.</li>
		<li>소프트웨어를 열고 데이터 수집 방법 및 샘플 정보를 포함 하는 작업 목록을 준비 합니다.</li>
		<li>테스트 실행을 시작 하 고 신호 강도 및 내부 표준의 피크 모양과 다른 표준 화합물의 최고 분해능과 같은 데이터를 확인 합니다.</li>
		<li>필요한 경우 분석 조건을 미세 조정 합니다.</li>
		<li>샘플 솔루션을 50에서 3 초 동안, 30kv의 전압으로 주입 합니다. 참고: CE-MS는 양극 또는 음이온 모드 중 하나에서 진행 되었습니다. 분 광 계를 설정 하 여 질량 범위 m/z 50 ~ 1000을 스캔 합니다. 상기 모 세관 전압은 4Kv에서 설정 되었다; 질소 가스 (히터 온도 300 ° c)의 유 속. 포지티브 모드에서 fragmentor, 스키 머 및 OCT RFV 전압은 각각 75, 50 및 125 V로 설정 되었습니다. 음이온 모드의 경우, fragmentor, 스키 머 및 OCT RFV 전압은 각각 100, 50 및 200 V로 설정 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스펙트럼 데이터를 분석 합니다.<ol>
<li>M/z, 피크 영역 및 마이그레이션 시간 (MT)을 포함 한 피크 정보를 얻기 위해 자동 통합 소프트웨어를 사용 하 여 질량 스펙트럼 데이터에서 피크를 추출 합니다. 참고:이 방법은 다른14에 자세히 설명 되어 있습니다.</li>
		<li>이 소 지형, 부가 물 이온 및 기타 알려진 대사 산물의 제품 이온에 해당 하는 신호 피크를 배제 합니다.</li>
		<li>M/z 값 및 MTs에 따라 hmt 대사 산물 데이터베이스의 정보로 남은 피크에 주석을 답니다.</li>
		<li>주석이 달린 최고점의 영역을 내부 표준 수준과 샘플 당 셀 수로 정규화 합니다.</li>
		<li>각 대사 산물에 대해 준비 된 표준 곡선을 이용 하 여 배양 된 세포 (pmol/106 세포) 내의 각 대사 산물의 농도를 평가 한다.</li>
		<li>후속 통계 분석 및 생물학적 해석을 위해 정량화 된 대사 산물 농도를 사용 하십시오14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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여기서, 우리는 CE-MS 기반 대사체학 분석을 위해 배양 암 세포 로부터 대사 산물을 준비 하기 위해 널리 접근 가능한 방법론을 설명 한다. 이 프로토콜에서 가장 중요 한 점 중 하나는 측정 된 대사 산물 농도가 생존 가능한 세포 수로 정상화 되기 때문에 암 세포를 적절 하 게 준비 하는 것입니다. 세포 수의 정확한 추정을 위해, 대사체학 분석을 위한 대사 산물의 추출과 병행 하 여 실행 가능한 세포의 수를 세는 실험 군 당 적어도 하나의 추가 배양 접시를 제조할 필요가 있다. 또한, 동일한 수의 세포를 반복 하 고 계산을 위한 접시에 각 접시에 시드 되어야 한다; 앞으로는,이는 스트레스 (예를 들어, 트립 신이 없는) 세포 계수 프로토콜을 이용 하 여 동일한 요리가 생존 가능한 세포를 카운팅 하 고 대사 산물을 추출 하는 데 모두 사용 될 수 있게 합니다. 셀이 요리의 표면에서 분리 되지 않도록 세척 중에 주의를 기울여야 합니다. 세포 부착을 감소 시키는 심각한 세포 독성 시험 및 기타 실험은 세척 과정 중에 세포의 잠재적인 손실로 인 한이 추출 프로토콜에 부적합 할 수 있다.
PBS와 같은 염-기반 버퍼가 대사체학 분석을 방해 하 고 측정에 악영향을 미치기 때문에 세 륨-MS 기반 대사체학 분석을 위해 배양 된 세포에서 대사 산물을 추출 하기 위한 세척 완충 액으로 5%만 니 톨 용액을 사용 하는 것이 중요 합니다.
두 개 또는 세 개의 요리는 개별적으로 각 접시에서 대사 산물을 추출 하 고 샘플을 풀링 하 여 단일 샘플로 결합 될 수 있다; 그러나, 여러 요리를 결합 하는 것은 종종 추출 된 대사 산물 용액에서 잔류만 니 톨을 증가 시킨다. 이것은 또한 CE-MS에의 한 대사체학 분석을 방해할 수 있습니다. 따라서, 하나의 샘플로 여러 요리 나 우물을 사용 하지 않는 것이 좋습니다.
50 및 1000 Da 사이의 분자량을 가진 충전 된 분자의 포괄적 인 측정을 위해 CE를 사용 하는이 대사체학 분석 방법이 개발 되었습니다. 따라서,이 프로토콜은 수성, 저 분자량 화합물의 추출을 위해 최적화 된다. 따라서,이 프로토콜은 단백질 및 핵 산과 같은 지질 또는 거 대 분자와 같은 소수 성 대사 산물을 추출 하는데 적합 하지 않다. 배양 된 세포 샘플의 종합적인 지질 분석 또는 지질학 대 한 수요가 증가 하 고 있기 때문에, 친수성 및 소수 성 대사 산물 모두의 동시 추출을 위한 쉽고 효과적인 프로토콜의 개발이 필요 하다.
대사 산물 추출의 첫 번째 단계 — 흡입 배지 및만 니 톨을 이용한 세 정 세포-세포의 대사 프로 파일의 변화를 최소화 하기 위해 가능한 한 빨리 수행 되어야 한다. 만 니 톨로 세척 한 후 메탄올로 세포를 치료 하는 것은 단백질을 변성 시키는 것으로 가정 하 고 더 나아가 대사 반응을 촉진 하는 효소를 방지 합니다. 그러나 메탄올 처리 후에도 산화 환 원 반응, 일부 탈 탄산 공정 및 싸이 올과 같은 비 효소 화학 반응이 발생할 수 있습니다. 이와 같이,이 프로토콜에 의해 측정 된 이러한 반응에 관여 하는 대사 산물의 어떤 농도 주의 하 여 해석 되어야 한다. 게놈 또는 전사체와는 대조적으로, 대사체는 다양 한 화학적 특성을 가진 분자 들로 이루어져 있습니다. 따라서, 어떤 단일 프로토콜 손실 또는 방해 없이 모든 대사 산물을 추출할 수 있습니다. 이러한 매우 반응성 대사 산물의 보다 정확한 측정을 위해, fractionations 및 유도체 화를 필요로 하는 특정 대사 산물 그룹을 추출 하기 위해 특별히 설계 된 프로토콜이 상담 되어야 합니다. 그러나 여기에 제시 된 프로토콜은 세 륨-MS에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 세포 샘플 로부터 수성 대사 산물의 간단 하 고 빠른 추출을 기술 한다. 이 논문에서는 본 원고의 초점이 다르기 때문에 CE-MS를 상세히 설정 하는 방법을 설명할 수는 없지만, CE를 설정 하는 세부적인 단계를 설명 하기 위해서는 별도의 전용 기사가 필요할 수 있습니다.

Otto warburg는 암 세포가 포도 당을 차지 하 고 적절 한 산소의 존재 하에 젖 산을 생산 하기 위해 그것을 발효 하는 비정상적인 능력을 습득 관찰-warburg 효과 또는 호 기성 분해로 불리는 현상1,2. 미토 콘 드리 아 호흡 결함은 암 세포에서 호 기성 분해의 기저 기준으로 서 추측 된다3. 실제로, 워 부르 크 효과는 임상 실습4,5에서 널리 이용 되는 fluorodeoxyglucose (fdg)-positron 방출 단층 촬영 (PET)에의 한 종양 이미징의 기초가 된다. 호 기성 분해의 높은 비율은 암의 주요 특징으로 간주 되 고 최근에 잘 알려진 "암의 특징"의 하나로 서 채택 되었습니다, d. 하나 한과 b. 와인 버그에 의해 설명 된 바와 같이. 암 유전자 및 종양 억제 유전자의 체세포 돌연변이-예를 들어 h라스/크 라스/nras, EGFR, braf, MYC, TP53,이 소시 아타 탈 수소 효소 및 푸 마 레이트 타제 (FH ) — 전쟁 부르 크 효과7의 결과로 여겨지는 암 세포의 특정 대사 변화에 연결 되었습니다.
대사체학 분석은 암 세포의 신진 대사 조절을 이해 하는 것 뿐만 아니라 초기 단계의 암 바이오 마커와 화학요법 반응 예측을 파악 하는 데에도 유망한 접근법입니다. 항 암 화합물을 가진 과민 하거나 저항 하는 암 세포의 처리 후에, 그들의 신진 대사 응답의 추적은 암 환자에 있는 특정 항 암 치료의 효 험을 예측 하기 위하여 신진 대사 바이오 마커의 확인을 용이 하 게 합니다8 ,9,10,11. 본 문서에서, 산화 적 스트레스를 유발 하는 디 아 미드로 처리 된 EGFR 돌연변이를 갖는 폐 선 암 으로부터 유래 된 폐암 세포 주-대사체학 분석을 위한 모델로 사용 되었다. 모 세관 전기 영동 질량 분 광 법 (CE-MS)을 사용 하는이 분석 방법의 이점은 질량 범위 m/z 50-100012,13을 사용 하 여 충전 된 대사 산물을 포괄적으로 측정 하는 것입니다. 이 기사의 목적은 초보자에 게 배양 암 세포 및 후속 대사체학 분석에서 수성 대사 산물의 제조를 위한 상세한 단계적 시각 프로토콜을 제공 하는 것입니다, 특히 CE-MS에 의해.

<table><tbody><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II 자동 세포 계수기</td></tr><tr><td>자동 통합 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>버전 B.02.00</td></tr><tr><td>CE 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 7100 CE 시스템</td><td></td></tr><tr><td>CE/MS 어댑터 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>CE-ESI-MS 분무기 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td></tr><tr><td>원심 필터 장치, 5 kDa</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>원추형 멸균 폴리프로필렌 튜브, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>원추형 멸균 폴리프로필렌 튜브, 50ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar 스트라이프, 10ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 스트라이프, 5ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500g</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>양</td>이온 분석을 위한 전기영동 완충기 <td>인간 대사체 기술</td><td>H3301-1001</td> 양<td>이온 분석을 위한</td></tr><tr><td>전기영동 완충기</td><td>인간 대사체 기술</td><td>H3302-1021</td><td>음이온 분석을 위한</td></tr> 태<tr><td>아 소 혈청</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁, 1000 &mu; l</td><td>왓슨</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁, 20 &mu; l</td><td>왓슨</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>필터 팁, 200 &mu; l</td><td>왓슨</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>용융 실리카 모세관</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu; M ID &시간; 총 길이 80cm</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>내부 표준 용액</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>등용매 펌프</td><td>Agilent</td><td>Technologies Agilent 1100 시리즈 등용매 펌프</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1L, LC/MS 등급</td></tr><tr><td>마이크로튜브, 1.5ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>운영 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>버전 B.03.01 for CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>멸균 조직 배양 접시, 100mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Time-of-Flight 질량 분석기</td><td>Agilent 기술</td><td>Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Merck</td><td>Milli-Q 물</td><td>18.2 M&Omega; &#183; cm 순수</td></tr><tr><td>용량 플라스크, 50ml</td><td>이와키</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

대사체학 분석은 정상 세포에 비해 암 세포의 특정 대사 조절을 이해할 뿐만 아니라 초기 단계의 암 검출 및 화학요법 반응의 예측을 위한 바이오 마커를 파악 하는 유망한 오 믹스 접근법입니다. 암 환자. 대사체학 분석을 위한 균일 한 샘플의 제조는 해결 될 수 있는 중요 한 문제입니다. 여기에서, 우리는 모 세관 전기 영동 질량 분 광 법 (CE-MS)을 사용 하 여 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물을 추출 하기 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제시 합니다. 배양 세포 로부터의 수성 대사 산물은 세포를 배양 및 세척 하 고, 세포를 메탄올로 처리 하 고, 대사 산물을 추출 하 고, CE-MS 분석용 스핀 컬럼을 사용 하 여 단백질 및 거 대 분자를 제거 함으로써 분석 된다. 산화 성 시 약, 디 아민으로 처리 된 폐암 세포 주를 사용 하는 대표적인 결과는 산화 적 스트레스 하에서 세포의 명확 하 게 관찰 가능한 신진 대사 변화를 보여줍니다. 이 문서는 CE-MS에 의해 분석을 위한 세포 라인에서 수확 대사 산물에 새로운 대사체학 연구에 관여 하는 학생 및 조사자에 특히 가치가 있을 것입니다.

암 세포에서 대사 산물 농도는 (pmol/106 세포) 생존 가능한 세포 수로 정규화 되기 때문에, 실험 조건은 조건 사이에 생존 가능한 세포의 수의 변동을 최소화 하도록 주의 하 여 설정 되어야 한다. 예를 들어, 디 아민 처리는 상대적으로 고 농도 (250 μ m)에 있으 나 짧은 시간 동안 모든 세포가 최대한 동등 하 게 성장할 수 있도록 하 여, 분석 가능한 세포 수를 균일화 시킨다. 이러한 실험 조건 하에서 HCC827 세포는 3 시간 동안 동등 하 게 성장 하였다 (그림 1). HCC827 세포에서 PBS 처리 된 세포 (대조) 세포에 비해 디 아 미드 처리 셀에 대 한 CE-MS 분석은 각각 175 및 150 차등 대사 산물을 밝혀 내었다. 이들 중에서, pentose 인산 통로 (PPP)와 상부이 염에서의 여러 중간체 들은 두 세포 주 모두에서 다이 미드 처리 된 조건에서 상당히 높 았으 나, 반면에 몇몇 tricarboxylic 산 (TCA) 사이클 중간체 들은 치료 된 (그림2 와 그림 3).
PPP는 산화 환 원 항상성 유지 및 지방산 생 합성에 사용 되는 감소 된 니코틴 아마 이드 디뉴클레오티드 인산 염 (NADPH)의 형태로 환 원성 등가물을 생성 한다. 디 아 미드 처리 후에, 글 루 콘 산의 수준-산화 된 포도 당은 HCC827 세포에서 12 겹으로 증가 하 고 10 배는 PC에서 9 배입니다; 유사 하 게, 디 아 미드 처리에 이어서, 글루코스 6-인산 염 (G6P)의 수준-인 산화 된 포도 당과 첫번째 헥 소 키나 제 촉매 분해 생성물-또한 HCC827 및 세포에서 각각 6.3 및 3.5 배 증가 하였다 (도 4). 또한, 디 아 미드 처리에 따르면, phosphogluconate의 첫 번째 중간체 인 6-10의 레벨은 PBS 컨트롤에서 볼 수 있는 수준과 비교 하 여 HCC827 셀에서 89 배 증가 하 고 231-접기 세포의 수치를 극적으로 높였습니다 (그림 4). 대조적으로,과 당 6-포스 페이트 (F6P) 및과 당 1, 6-비스 포스 페이트 (F1, 6p)와 같은 다른 분해 중간체의 수준은 디 아민 실험 조건에서 변하지 않았다 (도 4). 총 니코틴 아 미드 디뉴클레오티드 인산 (NADP+) 수준은 디 아 미드 처리와 PBS 제어 조건 (도 4) 사이에서 거의 동등 하였으며, 글루코스가 주로 PPP를 통해 카 울 화 된 것을 시사 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> 그림 1입니다. 디 아민 처리 시 변경 되지 않은 세포 번호. 250 μ m의 디 아민에 대 한 세포 성장 반응은 트리 판 청색 염색을 이용 하 여 측정 하였다. (A) HCC827 세포의 세포 수는1 또는 3 시간 동안 PBS (청색) 또는 디 아 미드 (적색250 μ m)로 처리 하 여 나타낸다. 데이터는 평균 ± 6n=6으로 표시 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> 그림 2입니다. 대사 산물의 대표 MS 봉우리. Electropherograms 주석으로 서 글 루 콘 산, (B) 글루코스 6 인산 염 G6P) 및 (D) 아미드아데 노이드를 세 륨-MS 분석에 의해 얻어진 인산 염 (nadp+)으로 서 주석을 하였다. 각 선은 사용 된 세포 선 (고체, HCC827, 도트, 적색, 디 아민)을 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> 그림 3입니다. 세포내 대사 산물의 대사체 프로필. (A) HCC827의 대사 산물의 접힘 변화 및 디 아 미드로 처리 된 (B) PC-9 세포는 로그2(디 아 미드/PBS)로 나타내 었 다. 총 175 및 150 대사 산물은 각각 HCC827 및 PC-9 세포에서 주석 처리 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> 그림 4입니다. 디 아민 처리 시 PPP의 상향 조절. 디 아민으로 처리 한 후 해당 분해 및 pentose 인산 통로 (PPP) 에 관여 하는 주요 대사 산물의 세포내 농도 (pmol/106 세포)가 표시 됩니다. 대사 산물은 PBS (청색) 또는 디 아민 (적색, 250 μ m)으로 처리 된 HCC827 세포 로부터 30 분 동안 추출 하였다. 글 루 콘 산, 글루코스 6 인산 염 (G6P),과 당 6 인산 염 (F6P)과 같은 대표적인 대사 산물, 6 -phosphogluconate (6Pg) 및 니코틴산 아 미드 디뉴클레오티드 인산 염 (nadp+)이 도시 되어 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

본 기사의 목적은 대사체학 분석, 특히 모 세관 전기 영동-질량 분 광 법을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물을 추출 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 것 이다.

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

이 문서의 목적은 후속 메타볼로메 분석을 위해 배양 된 암세포에서 수성 대사 산물을 추출하기위한 상세하고 단계적 시각적 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 부착 된 세포에서 대사 산물을 추출하기위한 단순성과 신뢰성입니다. 그러나 무엇보다도 모세관 전기 포근 질량 분석법 또는 CEMS를 사용하여 메타볼로메 분석에 최적화되어 있습니다.Metabolomics는 암 환자에 대한 바이오 마커 또는 초기 단계 암을 감지하고 화학 요법 반응을 예측하는 강력한 기술입니다. 우리는 이 데모에서 암세포를 사용합니다. 그러나, 이 기술은 또한 iPS 세포에 있는 섬유아세포와 같은 그밖 부착된 세포에서 대사 산물을 수확하기 위하여 적용될 수 있습니다.대사 산물 농도는 실행 가능한 세포의 수에 따라 정규화됩니다. 문화의 주의 깊은 준비, 이것은 좋은 재현 가능한 데이터를 얻기위한 열쇠입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 아미 마루야마가 될 것입니다.우선, 플레이트 HCC827 및 PC-9 세포는 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지의 10 밀리리터를 포함하는 100mm 접시에 있습니다. 배양에 24시간 동안 인큐베이터에 5%의 이산화탄소와 섭씨 37도를 놓습니다. 인큐베이션 후 100mm 배양 접시를 부드럽게 기울여 세포 배양 매체를 흡인시합니다.칼슘과 마그네슘없이 인산염 완충 식염수 용액의 두 밀리리터를 사용하여 각 접시에 세포를 씻어. PBS 용액이 접시 표면을 완전히 덮도록 각 접시를 부드럽게 흔들어 서 접시를 기울여 세척 버퍼를 흡인시합니다. 따뜻한 0.25%의 트립신-EDTA 용액이 섭씨 37도에 떨어뜨려갑니다.5밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 각 접시에 따뜻한 트립신-EDTA 용액 2밀리리터를 추가합니다. 트립신이 접시의 표면을 완전히 덮을 수 있도록 각 접시를 부드럽게 흔들어 주세요. 문화 요리를 섭씨 37도에서 약 5분간 배양하세요.그런 다음, 각 접시에 미리 따뜻하게 된 완전한 성장 매체의 4 밀리리터를 추가합니다. 그리고 부드럽게 파이펫을 여러 번 반복하여 세포를 배지로 다시 일시 중단합니다. 각 셀 서스펜션을 별도의 15밀리리터 원판 튜브로 전송합니다.원심 분리기는 800배 g로 5분간. 상체를 버리고 미리 따뜻진 완전한 성장 매체의 2 밀리리터에서 각 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 서스펜션의 마이크로리터 10개에 0.4%의 마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로튜브에 넣습니다.모세관 작용을 통해 세포 계수 챔버 슬라이드에 혼합물의 10 마이크로 리터를적. 챔버 슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 삽입하고 캡처 버튼을 눌러 이미지를 캡처하고 셀의 총 수 및 %의 생존 가능성 결과를 표시합니다. 총 세포 수가 밀리리터당 0.5백만 세포 이상이면, 원하는 세포 농도를 얻기 위해 15밀리리터 원내 튜브에 추가 성장 배지를 추가한다.이제 각 100mm 세포 배양 접시에 배양2~5밀리리터를 추가하여 접시당 약 1~2 1/2백만 개의 세포를 시드합니다. 문화 용 요리는 18 시간 동안 섭씨 37도에서 5 %의 이산화탄소를 배양합니다. 첫째, 15밀리리터 체피트릭 플라스크에서 L-메티오닌 설포네 및 D-Camphor-10-sulfonic acid 1, 000배의 초순수수를 포함하는 상업용 내부 표준 솔루션을 희석시하십시오.초순수물에 매니톨을 녹여 세척 버퍼로서 초순수 수역에서 밀리리터 마니톨 용액 당 0.05 그램을 준비하십시오. 그런 다음 각 원심 필터 장치의 필터 컵에 넣고, 파이펫 250 마이크로리터의 초순수수. 필터 유닛을 단단히 밀고 원심분리기를 섭씨 4도에서 100배, 5분간 100회 원심분리기를 캡을 씌우습니다.각 여과의 볼륨을 확인합니다. 첫 번째 짧은 스핀 중에 상당한 여과가 축적된 경우 필터 장치가 결함이 있을 수 있습니다. 필터 장치를 폐기하고 대신 새 필터 장치를 사용합니다.필터 장치의 뚜껑을 단단히 닫고 원심분리기를 섭씨 4도에서 100배, 30분 동안 다시 닫습니다. 필터 컵에 초순수물이 남아 있지 않도록 하고 파이펫으로 각 수집 튜브의 여과된 초순수수를 제거하십시오. 필터 컵을 수집 튜브에 다시 넣고 건조 시 손상을 피하기 위해 1 시간 이내에 원심 필터 장치를 사용합니다.인큐베이터에서 100mm 배양 접시를 꺼내 각 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하십시오. 각 접시에 250 마이크로몰러 디아미드의 유무에 관계없이 PBS 배양 배지 10밀리리터를 추가하여 세포 층을 방해하지 않도록 주의하십시오. 30분 동안 37°C의 문화 요리를 배양합니다.인큐베이션 후, 각 100mm 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡인한다. 접시를 약간 기울이고, 부드럽게 세포를 씻어 각 접시의 가장자리에 5 %의 마니톨 워시 버퍼의 두 밀리리터를 추가, 세포 층을 방해하지 않도록주의. 각 배양 접시에서 세척 버퍼를 흡인하고, 접시를 약간 기울이고 접시 당 세척 버퍼 10 밀리리터를 부드럽게 추가하여 세포를 다시 씻으십시오.그런 다음 각 문화 접시의 가장자리에서 세척 버퍼를 완전히 흡인시합니다. 이제 문화 요리당 99.7%의 메탄올800 마이크로리터를 추가하고 각 문화 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 전체 표면을 덮습니다. 30초 동안 실온에서 요리를 그대로 둡니다.파이펫 끝을 메탄올에 담그고 여러 번 부드럽게 파이펫을 피펫하여 접시당 희석 된 내부 표준 용액 550 마이크로 리터를 천천히 추가하십시오. 각 문화 요리를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 전체 표면을 덮고, 30 초 동안 실온에서 요리를 둡니다. 그런 다음, 추출된 용액을 각 배양 접시에서 별도의 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송한다.튜브를 섭씨 4도에서 2, 300배에서 5분간 원심분리합니다. 각 슈퍼네티의 700마이크로리터를 2개의 원심 필터 단위로 옮기고, 단위당 350마이크로리터를 제공합니다. 필터 튜브는 필터 컵에 액체가 남아 있지 때까지 약 2 시간 동안 섭씨 4도에서 100 배, 100 배 g에서 원심 분리.필터 컵을 제거하고 수집 튜브의 뚜껑을 단단히 닫습니다. 이 연구에서, HCC827 및 PC-9 세포는 3 시간 동안 동등하게 성장했다. CEMS 분석은 두 세포주를 위한 디아미드 처리된 세포와 PBS 처리된 세포 사이 다름을 나타냅니다.이들 중, 펜토제 인산염 통로및 상부 글리코리시스에서 몇몇 중간체는 diamide 처리조건에서 상당히 높았고, 몇몇 트리카박스사이클 중간체는 처리된 조건에서 낮았다. 세포 내 대사 산물의 메타볼리트 프로파일은 HCC827 및 PC-9 세포에서 각각 175 및 150 개의 차동 대사 산물을 각각 밝혔다. 디아미드 처리에 이어, 글루콘산과 산화포도당의 수준은 HCC827 세포에서 12배, PC-9 세포에서 10배 증가했다.유사하게, 제1육소키나제-촉매글리소리시스 제품에서 인산포도당인 포도당 6-인산염의 수준도 HCC827 및 PC-9 세포에서 각각 6.3배 및 3.5배 증가했다. 또한, 펜토스 인산염 통로의 첫 번째 중간인 6-인산글루코네이트의 수준은 HCC827 세포에서 89배, PC-9 세포에서 231배 나증가했다. 대조적으로, 과당 6-인산염과 같은 그밖 당화성 중간체의 수준은 디아미드 실험 조건에서 변경되지 않았습니다.총 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 수준은 디아미드 치료와 PBS 조절 조건 간에 거의 동등했다. PBS 이외의 5%매니톨 용액을 사용하여 세척 셀에 대한 세척 버퍼는 CEMS 분석에 매우 중요하며, 이는 염기반 완충제가 분석을 방해하고 측정에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다. 이 프로토콜은 지질과 같은 소수성 대사 산물을 추출하기에 적합하지 않으므로 보다 포괄적인 메타볼로메 분석을 위해 소수성 대사 산물을 편리하게 추출하기위한 프로토콜을 개발해야합니다.이 기술은 거의 모든 부착 세포에서 대사 산물의 쉬운 추출을 실현하고, 따라서, 암, 줄기 세포, 약리학, 영양 및 화장품 과학과 같은 다양한 연구에 적용 할 수 있습니다.

extraction-aqueous-metabolites-from-cultured-adherent-cells-for

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

대사 체학 실험 결과의 신뢰성은 시료 준비의 효율성과 재현성에 따라 달라집니다. 이후 화합물의 수천까지 분석, 또는 관심의 단지 화합물의 클래스의 옵션을 사용하여 생체 액에서 대사 산물의 추출을 가능하게하는 엄격하고 심도있는 방법입니다 설명.

심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

이 논문은 안정 동위원소 추적, 특정 세포 유형을 분리하기 위한 세포 분류 및 질량 분석법의 조합을 사용하여 여러 세포 유형의 복잡한 군집에서 세포 대사를 연구하는 방법을 설명합니다.

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

하나의 샘플을 사용하여 생물학적 조직에서 지질, 대사 산물 및 단백질을 포괄적으로 추출하기위한 프로토콜이 제시됩니다.

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

우리는 빠른 시내 현장 샘플링의 높은 정밀도와 최소한의 침공에 신진 대사 활동의 스냅샷의 화학 특성을 촉진 하기 위하여 모 세관 기반 마이크로-샘플링를 사용 하 여 개별 셀의 작은 부분을 사용할 수 있는 단계를 설명 배아를 사용자 단일 셀 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 플랫폼을 사용 하 여 라이브.

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

이 프로토콜은 휘발성 염 용액 세척, 급속 액체 질소 담금질, 동결 건조 및 -8°C 저장을 결합하여 단일 세포 질량 분석법(SCMS)을 위한 세포 대사 산물을 보존하는 것을 목표로 합니다. 이는 액체 질소 담금질이 대사 산물 프로필을 유지하는 데 필수적이며, 대사 변화를 방지하기 위해 장기간 냉장 보관을 최소화해야 함을 보여줍니다.

단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

배우세요 모 세관 전기 영동-질량 분광법을 위한 부착 세포의 수성 대사 산물 추출 방법을. 이 기술은 암 대사체학 연구에서 생물학적 표지자 발굴과 재현성 있는 데이터 획득에 필수적입니다.

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

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