Name: 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포를 이용한 뇌 손상 치료 이식법을 마우스 모델에서. 정밀한 기계적 충격 제어로 재현 가능한 외상성 뇌 손상 모델을 구축하고 회복 과정을 평가하는 방법을 익히세요.

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이 작품은 신경 과학 및 재생 의학 센터 (CNRM, 교부금 번호 G170244014)의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 접착제 제거 파일럿 연구에서 마히마 듀완과 클라라 셀브레데의 도움을 주셔서 감사합니다. Kryslaine Radomski는 예비 뇌 손상 및 세포 이식 수술을 수행했습니다. USU CNRM 전임상 연구 핵심 실험실의 아만다 푸와 로라 터커는 동물 수술 및 행동 테스트에 대한 귀중한 조언을 각각 제공했습니다.

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<li>Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+to+define+mild%2C+moderate%2C+and+severe+traumatic+brain+injury+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model.</a> Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).</li>
<li>Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Male+and+Female+C57BL%2F6J+Mice+on+Motor+and+Cognitive+Tasks+Commonly+Used+in+Pre-Clinical+Traumatic+Brain+Injury+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).</li>
<li>Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+long+is+too+long%3F+The+lack+of+consensus+regarding+the+post-concussion+syndrome+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Injury%22%5BJournal%5D)">How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis.</a> Brain Injury. 29, 798-803 (2015).</li>
<li>Hurst, J. L., West, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+anxiety+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Taming anxiety in laboratory mice.</a> Nature Methods. 7, 825-826 (2010).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+behavioral+testing+after+focal+ischemia+in+the+mouse%3A+functional+recovery+and+the+effects+of+gender%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender.</a> Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).</li>
<li>Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+cortical+lesion+effects+and+treatment+with+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine.</a> Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).</li>
<li>Al-Ali, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mTOR+Substrate+S6+Kinase+1+%28S6K1%29+Is+a+Negative+Regulator+of+Axon+Regeneration+and+a+Potential+Drug+Target+for+Central+Nervous+System+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).</li>
<li>Pleasant, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+neurodegeneration+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model+is+influenced+by+impactor+tip+shape%3A+implications+for+mechanistic+and+therapeutic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).</li>
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실험적인 재생 요법을 테스트하기 위한 모델 시스템으로서 온화한 CCI CCI 모형은 피질에 기계적인 상해 후에 조직 역기능의 기계장치를 조사하기 위한 귀중한 공구입니다. 부상 매개 변수의 튜닝성은 이 모델의 매력적인 특징입니다. 충격의 Z 깊이를 변경, 속도, 또는 거주 시간은 조사자10,25에의해 원하는대로 부상의 심각도를 증가 또는 감소 시킬 수 있습니다. 불착뇌 손상의 온화한 CCI 모형은, 제대로 수행될 때, 겸손한 피질 세포 죽음 및 최소한의 캐비테이션을 일으키는 원인이 되어야 합니다. 두개골 절제술과 두개골 플랩 제거는 세심한주의를 기울여 수행해야합니다. craniectomy 트렌치를 드릴링하는 동안 과도한 하향 힘이 가해지면 가열 및 진동으로 인해 피질 손상을 일으킬 수 있습니다. 두개골 플랩 제거 중 경막미의 기계적 중단은 거의 균일하게 심각한 피질 손상을 예측합니다. 주요 ...

외상성 뇌 손상 (TBI)은 간접적인 기계적 힘 (회전 가속 / 감속 또는 콘트라 쿠데타)으로 인해 뇌에 획득 된 부상에 대한 일반적인 용어입니다. TBI는 세계적인 죽음의 대략 9%의 원인으로 추정되고 1,2년 당 추정된 5천만의 케이스에서 관찰되었습니다. 질병 통제 예방 센터의 2017 년 보고서에 따르면 2013 년에 미국에서 TBI로 인한 총 280 만병원 방문 및 사망자가 3. 많은 온화한 TBCIs는 매년 보고되지 않습니다. 심각한 TBI인식, 운동 기능 및 전반적인 삶의 질의 평생 손상으로 이어질 수 있습니다. 온화한 TBI의 결과, 특히 반복적인 스포츠 관련 TBI는, 그들의 교활한 건강 효력4,5에대해서만 최근에 평가되었습니다 .
전임상 모델링은 TBI에 대한 새로운 기계론적 통찰력과 잠재적인 회복 요법을 개발하는 데 필수적인 요소입니다. TBI의 제어 된 피질 충격 (CCI) 모델은 피질에 기계적 타박상 부상의 오픈 헤드 모델입니다. 충격 매개 변수는 온화한에서 가혹한 6에 구역 수색하는CCI 상해를 생성하기 위하여 수정될 수 있습니다. CCI 부상은 TBI의 다른 닫힌 머리 모델과 같이 확산보다는 초점입니다. CCI는 반대측 피질이 내부 비교기로서 작용할 수 있도록 일방적인 상해를 유도하기 위해 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 1 차적인 체감각 및 모터 지구를 포괄하는 피질의 부분에 온화한 CCI의 특성을 보여줍니다. 이 피질 지역은 수많은 행동 시험이 상해 유도한 적자를 검출할 수 있는감각 운동 행동에 관여를 위해 선택되었습니다 7. TBI를 위한 치료 내정간섭 때문에 행동 개선은 또한 검출될 수 있습니다.
TBI의 특징은 부상당한 지역에서 광범위한 신경 기능 장애입니다. 부상당한 뉴런은 세포 사멸을 겪고, 뉴런 네트워크 연결은8,9. TBI는 내인성 줄기 세포의 모집을 방해, 이는 더 다운 스트림 행동 적자로 이어질10,11.  신경 줄기 세포와 줄기 세포 유래 세포의 이식은 부상당한 뇌의 기능을 복원 할 수있는 가능성으로 탐구되고있다. 손상된 신경 회로를 복원 할 수있는 가능성 외에도 이식 된 세포는 TBI12에서신경 생존 및 기능 회복을 촉진하는 파라크린 효과를 발휘합니다. 다양한 세포 유형이 전임상적으로 이식되어 신경학적 장애13,14,15의모델에서 그들의 회복 잠재력을 평가하였다. 최근 유도만능 줄기세포기술(16)의 대중화는 실험용 수많은 인간 줄기세포주 개발을 용이하게 하고 있다. hiPSC 유래 세포를 가진 전임상 시험은 주어진 세포주의 인간 질병에 대하여 잠재적인 치료 효험을 특성화하는 중요한 첫번째 단계입니다. 이 실험실은 외상성 뇌 손상에서 회복을 돕기 위해 이식 가능한 세포를 추구하여 신경 표현형17에 hiPSCs를 분화하기위한 프로토콜을 개발했습니다.
본 프로토콜의 실험은 성인 마우스의 좌측 체감각 및 운동 피질로 TBI를 유도하기 위해 일방적인 CCI를 사용한다. 온화한 CCI 상해는 기능복구에 hiPSC 파생된 신경 세포 생착의 효력을 추적하기 위하여 이용되는 오른쪽 포발에 있는 지속적인 기능 적자 초래합니다. 이 프로토콜에서 포포 감각 운동 테스트는 Bouet 및 동료18에 의해 확립 된 방법론에서 적응하고 플레밍과 동료19에의해 이전에 입증되었다.  이 프로토콜은 실험적인 뇌 손상, hiPS 세포의 치료 이식, 실험 결과 측정의 행동 및 조직학적 분석을 수행하기 위한 완전한 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

<table><tbody><tr>1 <td>ml 주사기</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>&nbsp; </td><td></td>309659</tr><tr><td>1.7 ml 플립 탑 테스트 튜브</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>10 마이크로리터 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>25G Precision Glide 주사기 바늘</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>&nbsp; </td><td></td>305122</tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td>선택 제품; 지역에 따라 다름</td></tr><tr><td>아세트아미노펜 경구 현탁액</td><td>타이레놀 (어린이용)</td><td></td>물 마취제<td>에서 1 mg/ml로 희석</td></tr><tr><td></td><td>Vetland</td><td>521-11-22</td><td></td></tr><tr><td>동물 취급 천</td><td></td><td></td><td>백화점에서 구매</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue 제품</td><td>NDC-67618-151-32</td><td></td></tr><tr><td>압축 산소</td><td></td><td></td><td>선택 제품; 지역에 따라 다름</td></tr><tr><td>cyclosporine A</td><td>시그마-알드리치</td><td>30024-100mg</td><td></td></tr><tr><td>DAB 염색 키트</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭시드 (DMSO)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>D8418-500ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td> <td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG 항체, HRP conjugated</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-035-151</td><td></td></tr><tr><td>전기 테이프</td><td>3M Corporation</td><td></td><td>백화점에서 구매</td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 피펫, 1 mm OD, 0.58 mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>고속 로터리 마이크로모터 키트</td><td>Foredom Electric Co.&nbsp;</td><td>K.1070 - K.107018</td><td></td></tr><tr><td>이상적인 마이크로 드릴 버 세트 5</td><td>셀 포인트 과학&nbsp;</td><td>60-1000</td><td></td></tr><tr><td>Impact One 스테레오택시 임팩터 CCI용&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>39463920</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>실험실 벤치 타이머</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>MicroData Instruments, Inc.</td><td>PMP-102</td><td>모든 풀러로 충분합니다</td></tr><tr><td>현미경 커버 슬립</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 장착 매체</td><td></td><td></td><td>선택</td></tr><tr><td>거울</td><td></td><td></td><td>백화점에서 구매</td></tr><tr><td>마우스 항 인간 핵 항원 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>마우스 차단 키트</td><td>벡터 실험실</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더 지혈</td><td>미세 과학 도구</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>NDC-61314-631-36</td><td></td></tr><tr><td>안과 용 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 상자</td><td></td><td></td><td>백화점</td></tr><tr><td>플라스틱 실린더</td><td></td>에서 구입<td></td><td>백화점에서 구입</td></tr><tr><td>QSI 전동 주사기 펌프</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>탈착식 바늘 압박 피팅</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>소형 설치류 입체 프레임</td><td>Stoelting</td><td>51925</td><td></td></tr><tr><td>소형 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td></td><td></td>A1110501</tr><tr><td>멸균 알코올 준비 패드</td><td>Fisherbrand</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면봉/Kendall Q-tips</td><td>Tyco Healthcare</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td>멸균 식염수</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-1966-07</td><td></td></tr><tr><td>스톱워치 (2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-56</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold 현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>15-188-48</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 - 곡선 바늘이 있는 5.0 실크</td><td>오아시스</td><td>MV-682</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

외상성 뇌 손상 (TBI)은 전 세계적으로 사망률과 사망률의 주요 원인입니다. TBI로 인한 질병 병리학은 원발성 기계적 모욕에서 사멸 및 염증을 포함한 이차 상해 과정으로 진행됩니다. 동물 모델링은 부상 메커니즘을 해명하고 잠재적인 신경 보호 요법을 평가하기 위한 검색에서 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 초점, 개방 헤드 TBI의 제어 된 피질 충격 (CCI) 모델을 설명합니다. 구체적으로, 온화한 일방적 인 피질 손상을 제조하기위한 매개 변수가 설명되어 있습니다. CCI의 행동 결과는 양측 감각 운동 통합의 접착제 테이프 제거 테스트를 사용하여 분석됩니다. TBI 병리학을 위한 실험적인 치료에 관하여, 이 프로토콜은 또한 두뇌로 배양된 세포를 이식하는 프로세스를 보여줍니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSCs)로부터 유래된 신경 세포 배양은 인간 TBI 환자에서 우수한 기능성 회복을 보여줄 수 있는 잠재력을 위해 선택되었다. 숙주 마우스 뇌 조직에서 hiPSCs의 만성 생존은 변형된 DAB 면역조직화학 적 과정을 사용하여 검출된다.

두개골 절제술 수술은 실험적인 뇌 손상 및 치료 세포 이식을 용이하게합니다 : 뇌 손상및 후속 세포 이식 치료의 제어 된 피질 충격 모델은 오버 레이리 두개골의주의 깊은 제거가 필요합니다. 두개골 절제술은 관심있는 뇌 영역에 조작을 허용하기 위해 두개골의 등받이 표면에서 수행 될 수있다. 그림 1의 다이어그램은 1차 체감각 및 모터 코르티케를 밝히기 위해 5mm 직경의 두개골 절제술 도식을 묘사합니다(그림1A). 두개골 절제술 후 24 시간에서, 두 번째 수술은 피질의 깊은 층으로 인간 iPSC 유래 신경 세포 현탁액을 주입하기 위해 수행되었다 (그림1B). 몇몇 대뇌 부종은 두개골 절제술 다음 날에, 특히 CCI 후에 정상입니다. 그러나, 이 절차의 모든 단계 도중 대뇌 혈관 절...

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

우리의 프로토콜은 뇌 손상 후 인간 유발 만능 줄기 세포의 치료 효능을 테스트하기위한 포괄적 인 전임상 워크플로우를 보여줍니다. 외상성 뇌 손상의이 모델은 기계적 힘의 매개 변수를 단단히 제어하여 잘 정의 된 부상을 제공함으로써 다재다능함과 재현성을 높입니다. 이러한 절차는 다른 뇌 영역에서 부상 및 회복 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 이식 방법은 많은 세포 유형과 함께 사용할 수 있습니다.두개골 드릴링은 적절한 압력, 속도, 깊이 및 부드러운 움직임을 마스터하기 위해 수동 손재주가 필요하기 때문에 도전적입니다. 모든 사건을 문서화하고 광범위하게 연습하십시오. 일방적인 craniectomy를 수행하려면 마취 된 마우스의 발가락 핀치에 대한 응답부족을 확인하고 입체 프레임에 마우스를 고정하십시오.살균면 면봉과 요오드 기반 용액을 면도두 부위에 적용하여 눈에 항생제 안과 연고를 적용하십시오. 70%에탄올로 요오드를 제거하고, 귀향 수술 커튼으로 동물을 덮습니다. 두피에 1.5~2센티미터의 중간절개를 하고 멸균 면봉을 사용하여 상처를 청소하고 브레그마의 미드라인의 왼쪽 근막을 치웁울 수 있습니다.충격기 프로브를 사용하여 craniectomy 사이트를 식별하고 x를 0과 같게 설정하면 y는 bregma에 대한 제로 입체 기준점과 같습니다. 프로브를 중간선의 왼쪽 2밀리미터로 측면으로 조정합니다. 미세 팁 수술 안전 마커를 사용하여 추정 충격 영역 주위에 직경 5mm 의 원을 랜드 마크.임펙터를 제자리에서 들어 올리고 회전하고 5밀리미터 원을 완성합니다. 5밀리미터 원의 정확도를 확인하기 위해 임펙터를 위치로 간단히 반환합니다. 그런 다음 임펙터를 제자리에서 들어 올리고 회전시키고 라운드 팁 0.6 또는 0.8 mm 버 드릴 비트가 장착된 고속 회전 마이크로 모터 키트 핸드 툴을 사용하여 70 ~ 80 %의 최대 속도로 두개골에 열린 구멍을 만듭니다.이 테두리 내의 5밀리미터 원주 윤곽선을 따라 드릴링하는 동안 두개골에 가벼운 압력을 가하고 집게를 사용하여 생성된 뼈 플랩을 들어 올립니다. 봉합사 라인을 통해 드릴링은 뼈가 중단되고 추가 압력이 필요하므로 추가적인 어려움을 초래할 수 있습니다. 혈관은 가까운 연관에 있을 수 있습니다 및 따라서 출혈 이벤트는 가능성이 높습니다.가벼운 제어 피질 충격 손상을 유도하기 위해 멸균 알코올 준비 패드로 임펙터 프로브를 청소하고 충격기 프로브를 노출된 피질 위로 다시 위치로 이동시합니다. 두라 마터 표면에 닿을 때까지 프로브를 낮추고 z가 0과 같을 때 이 위치를 표시합니다. 피스톤을 철회하고 z로 이동마이너스 1 밀리미터와 피스톤을 배출하여 피질에 영향을 미칩니다.즉시 피스톤을 들어 올리고 팔을 위치에서 옮기고 식염수의 넉넉한 볼륨으로 피질을 관개하고 간단한 중단 된 바늘과 5-0 실크 봉합사를 사용하여 두피 절개를 닫습니다. 그런 다음 스크러프에 피하 주입하여 사이클로스포린 A킬로그램당 10밀리그램을 전달하고 마우스를 완전한 회복까지 모니터링할 수 있는 깨끗한 사전 데운 수술 후 케이지에 넣습니다. 크레니절제술 후 약 24시간 후에 마우스를 다시 스테레오탁틱 프레임에 넣습니다.회향 수술 커튼으로 마우스를 덮습니다. 멸균 식염수로 절개 부위를 세척하여 사이트를 청소하고 봉합사를 풀어주세요. 70% 에탄올에 담근 면봉을 사용하여 절개 부위를 부드럽게 살균하고 미세핀셋과 안과 가위를 사용하여 봉합사를 제거하십시오.그런 다음 풍부한 멸균 식염수로 수술과 크레니 절제술 부위를 관개합니다. 세포 배양 생물 안전 후드에서, 부드럽게 소용돌이 또는 균질 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포의 튜브를 누릅니다. 마이크로피펫을 사용하여 플런저 끝을 통해 약 7.5 마이크로리터의 셀을 해밀턴 주사기에 적재합니다.플런저 끝이 아래로 향하고 있는 120도 각도로 주사기를 잡고, 서스펜션과 플런저 팁 사이에 기포를 도입하지 않도록 주의하여 플런저를 삽입합니다. 개스킷 어셈블리를 파이펫 바늘에 부착하고 바늘을 주사기에 부착합니다. 플런저를 밀어 세포 서스펜션을 파이펫 바늘로 이동하고 주사기를 스테레오탁스 주사기 펌프에 부착합니다.주사 펌프 조립이 제대로 작동하는지 확인하기 위해 플런저를 진행하고 주사를 위한 좌표로 바늘을 이동합니다. 바늘 끝을 bregma에 정렬하고 x 및 y 좌표를 0으로 설정합니다. 두개골 위에 바늘 끝을 2 밀리미터 측면으로 이동하고 1 밀리미터 후방을 뺀 후면을 bregma로 이동하고 바늘 끝을 dura mater 표면에 만드시면 됩니다.바늘을 약간 올린 다음 바늘이 접촉한 위치에서 두라 마터에 작은 절개를 합니다. 스테레오탁좌를 0과 같도록 설정하고 플런저를 밀어 세포 현탁액이 뇌에 바늘을 도입하기 전에 적절하게 흐르는지 확인합니다. 깊은 피질의 회색 물질 /백색 물질 경계에 접목을 배치하기 위해 영하 1.4 밀리미터와 동일한 z의 깊이에 뇌에 바늘을 소개합니다.주사기 펌프를 시작하여 15분 동안 셀 서스펜션을 주입합니다. 긴 작업 거리 현미경을 사용하여 세포 수분을 유지하기 위해 주입 중에 멸균 식염수로 수술 부위를 관개하는 세포 현탁액 유출을 모니터링합니다. 모든 세포가 전달되면 천천히 이식 바늘을 철회하고 새로운 봉합사와 절개를 닫기 전에 추가 식염수로 수술 부위를 관개하십시오.그런 다음 입증 된 대로 수술 후 치료를 제공합니다. 접착제 테이프 제거 테스트를 위해 먼저 작은 면도기 칼을 사용하여 노란색과 빨간색 전기 테이프 조각을 부드러운 유리 표면에 3 mm 5mm 스트립으로 자른다. 시험 전에 적어도 30분 동안 마우스를 행동 시험실로 가져와서 핸들링 천을 사용하여 마우스가 몸과 머리에서 포장을 멀리 붙일 수 있도록 목과 뒷면의 스크러프에 의해 마우스를 억제합니다.핀셋을 사용하여 각 포완의 발바닥 표면에 접착제 스트립을 배치하고 섬세하고 일관된 손가락 압력을 사용하여 스트립을 발에 고정시하십시오. 마우스를 플라스틱 실린더에 빠르게 넣고 마우스에 플라스틱 테스트 상자에 네 개의 발이 모두 있을 때 두 개의 스톱워치를 시작합니다. 그런 다음 두 개의 스톱워치를 사용하여 왼쪽 발 알림, 왼쪽 발 제거, 오른쪽 발 알림 및 오른쪽 발 제거에 대한 대기 시간을 기록합니다.이 파일럿 실험에서, 앞다리 기능은 광신도, 제어 된 피질 충격 손상 및 순진한 마우스에서 비교되었다. 수술을 받은 마우스는 수술 직후 1~3일 동안 접착제 자극을 통지하기 위해 일시적인 증가 지연 을 나타내고 수술 후 일시적인 결핍을 눈금포에서 제거하였다. 그러나, 통제된 피질 충격을 겪은 마우스는 수술 후 28일에서 순진한 마우스에 비해 부상에 대한 전경 에 대한 모터 성능에 상당한 적자를 나타냈다.인간 핵 항원에 대한 마우스 뇌 섹션의 면역 염색은 인간의 세포 이식이 SHAM 손상 및 제어 된 피질 영향 뇌의 호스트 조직과 명확하게 구별 될 수 있음을 보여줍니다. 배양된 인간 세포를 취급할 때 그리고 설치류 또는 면역 억제약과 접촉하는 주사기 바늘을 취급할 때 표준 실험실 안전 절차를 관찰해야 합니다. 뇌 조직 섹션은 이식편이 숙주 조직 상해 반응에 어떻게 영향을 미치는지 아는 것이 중요하기 때문에 신경 염증 성 마커의 발현을 위해 분석 될 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.우리는 부상 후 행동 결과에 미묘한 섹스 차이를 발견 놀랐다. 우리는 지금 성이 두뇌 상해에 신경 면역 반응에 있는 역할을 하는지 여부를 조사하고 있습니다. 꾸준한 손, 인내, 연습은 좋은 두개골 절제술 기술을 개발하는 데 중요합니다.부적절한 craniectomy에서 부수적 인 손상은 세포 이식을 목표로하려는 영역을 손상시킬 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

출처: Furmanski, O., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료적 이식을 통한 마우스 뇌 손상의 제어된 피질 충격 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오에서는 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포를 심부 피질의 회백질-백질 경계에 입위적으로 주입합니다. 이식된 세포는 조직에 통합되어 손상된 뇌의 기능 회복과 회로 복구를 촉진합니다.

외상성 뇌손상이 있는 마우스에 신경 세포 현탁액의 정위 이식

이 영상은 쥐의 두개골 개방 외상성 뇌 손상을 유도하는 과정을 보여주며, 두개골을 뚫고 구멍을 뚫고 뼈 피판을 제거하여 뇌 피질을 노출시키고 높은 압력을 가하여 외상을 유발하는 절차를 보여줍니다. 그런 다음 상처를 봉합하여 후속 실험을 위해 마우스 모델을 준비합니다.

임팩터 프로브를 사용하여 외상성 뇌 손상 마우스 모델 생성

출처: Shahror, RA et. al., 외상성 뇌손상 쥐 모델에서 비강내 전달 후 MRI를 사용하여 초상자성 산화철 표지 중간엽 줄기 세포 추적. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 마우스 모델에서 비강내 중간엽 줄기 세포(MSC) 전달을 보여줍니다. 중간엽 줄기세포는 비강 조직에 흡수되어 사이토카인 신호를 통해 뇌로 이동하며 손상 부위에서 신경영양 인자를 분비하여 신경 복구를 위한 신경 치료 가능성을 제공합니다.

외상성 뇌손상의 마우스 모델에서 비강내 중간엽 줄기 세포 전달

출처: Parajuli, B., et.al. 비침습적 경비강 경로를 통한 면역 적격 마우스 뇌에 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 미세아교세포의 이식. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 유도 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG) 세포를 마우스 뇌로 경비강 이식하는 방법을 보여줍니다. 히알루로니다아제는 미세아교세포가 고갈된 마우스의 콧구멍에 적용되어 투과성을 향상시킵니다. iPSMG 현탁액을 비강 내로 투여하고 마우스를 회복시킵니다. 성장 인자가 풍부한 배지는 뇌 조직에서 iPSMG 생존을 지원하기 위해 정기적으로 투여됩니다.

유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포를 마우스 뇌로 경비강 이식

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

여기에서 우리는 초기 출생 후 마우스의 피질로 이식된 피질 interneuron 선조의 활동을 조작하기 위하여 화학유전학 공구를 이용하기 위하여 디자인된 프로토콜을 제시합니다.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

우리는 마우스 뇌에서 루시페라아제-녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 이중 리포터 벡터로 형질도입된 인간 신경 전구 세포의 사다리꼴 이식을 기술한다. 이식 후, 루시퍼라아제 신호는 형광 현미경을 사용하여 뇌 절편에서 확인된 생체 내 생체 발광 및 GFP 발현 이식된 세포를 사용하여 반복적으로 측정된다.

Intracerebral 이식 및 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생체 발광 추적

여기에 제시된 프로토콜은 면역적격 마우스에서 경비강 경로를 통해 유도된 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 뇌로 이식하는 것을 허용한다. iPSMG의 유지를 위한 세포의 제조 및 경비강 이식 및 사이토카인 혼합물의 투여를 위한 방법이 제시된다.

비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 내 이식과 결합된 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양을 설명하며, 이는 인간 신경퇴행성 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료법을 추가로 테스트하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다.

인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양

신경 프로그래밍에 의해 생성 된 인간 다 능성 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런의 이식은 신경 발달 장애에 대한 잠재적 인 치료 접근법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런 전구체의 생성 및 신생아 마우스의 뇌에 이식하여 이식 된 뉴런의 장기 조사 및 치료 잠재력 평가를 가능하게합니다.

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

여기에서는 표지된 신경 세포를 인간 대뇌 오가노이드에 이식하고 추적하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

신경 세포 이식의 인간 대뇌 오가노이드 모델

학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포를 이용한 뇌 손상 치료 이식법을 마우스 모델에서. 정밀한 기계적 충격 제어로 재현 가능한 외상성 뇌 손상 모델을 구축하고 회복 과정을 평가하는 방법을 익히세요.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

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