Name: 뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 유동 세포 분석을 통해 뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포와 MLL-AF9 구동 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종을 검출하는 방법을. 이 기술은 유전자 조작이 ROS 수준에 미치는 영향을 평가하여 급성 골수성 백혈병 치료 전략에 대한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 폭스 체이스 암 센터 이사회 (DDM), 혈액학 학자 상 (SMS), 미국 암 학회 RSG (SMS) 및 국방부 (수상 번호: W81XWH-18-1-0472)에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 절차는 폭스 체이스 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜 워크플로는 그림 1에 나와 있는 대로 4부분으로 나뉘며 필요한 시약은 재료 표에나열되어 있습니다.
1. 골수 (BM) 격리
참고: MLL-AF9 백혈병 마우스는 앞서11일기재한 바와 같이 생성되었다.
<ol><li>앞서 설명한 바와 같이,12,13,14,15,야생형 C57.Bl6 마우스(CD45.2 정성 마커를 발현)와 C57로부터 회수한다. MLL-AF9 발현 백혈병 세포로 이식된 Bl6-SJL 마우스(CD45.1 동시 마커)(CD45.2+). 참고: BM은12,13을 분쇄하거나 뼈14,15를플러시하여 마우스에서 회복 할 수 있습니다. 여기에 제시된 실험을 위해, BM은 플러싱을 통해 건강한 및 백혈병 마우스 둘 다에서 회복되었다.</li>
</ol>2. 미토콘드리아 ROS 형광염료 염색
<ol><li>일단 단핵 골수 세포가 건강한 및/또는 백혈병 마우스에서 회복되면, Trypan Blue로 세포의 별칭을 얼룩지게 하고 총 BM 세포의 시작 수를 결정하기 위해 혈세포계를 사용하여 계산합니다.</li>
	<li>세포를 300 x g에서 5 분 동안 흡인하고 F-PBS (2 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙 토마이신 칵테일로 보충 된 PBS)에서 펠릿을 2 x 106 세포 / mL의 농도로 다시 중단시요.</li>
	<li>다음과 같이 표시된 9개의 단색 제어 튜브로 튜브당 세포 현탁액의 Aliquot 200 μL: 얼룩 없음, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (건강한 HSPC전용), CD45.2-APC (백혈병 세포전용), CD34-FITC, 미토콘드리아 ROS 염료 및 라이브/죽은 세포 얼룩. 참고: (선택 사항) 미토콘드리아 ROS의 유도에 대한 양성 대조군은 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 20 μL에서 200 μL에서 2 x 105 세포를 메나디온 나트륨 비설핏(MSB)으로 처리함으로써 제조될 수 있다. 미토콘드리아 ROS의 MSB 매개 유도를 역전시키는 제2 대조군은 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 MSB 플러스 100 μM 플러스 100 μM N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 2x10 5 세포에서 2 x 105 세포를 처리함으로써 제조될 수 있다.</li>
	<li>5 분 동안 300 x g에서 튜브 (실험 튜브) 및 원심 분리기에 남아있는 세포를 알리쿼트.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 라이브/데드 셀 얼룩으로 F-PBS의 셀을 다시 일시 중단합니다. 30 분 동안 얼음에 배양. 단색 제어 튜브에 살아있는 / 죽은 얼룩을 추가해야합니다.</li>
	<li>실온(RT) F-PBS 1.0mL를 살아있는/죽은 염료로 얼룩진 단일 색상 및 실험 용 튜브에 추가합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.</li>
	<li>50 μg의 미토콘드리아 ROS 염료를 13 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 재중단하여 5 mM 스톡 용액을 얻었다.</li>
	<li>미라파밀(50 μM)의 유무에 관계없이 RT F-PBS에서 미토콘드리아 ROS 염료를 5 μM의 최종 농도로 희석한다.</li>
	<li>살아있는/ 죽은 세포 얼룩의 세척을 흡인합니다. 각 실험 튜브뿐만 아니라 미토콘드리아 ROS 염료 단색 제어 튜브에 베라파밀을 함유하는 미토콘드리아 ROS 염료 얼룩 200 μL을 첨가한다.</li>
	<li>소용돌이를 혼합하고 어둠 속에서 37°C에서 10분 동안 배양한다.</li>
	<li>미토콘드리아 ROS 염색 단색 제어 및 실험 튜브에 RT F-PBS 1.0 mL을 추가합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.</li>
	<li>상한체에서 흡인하고 RT F-PBS의 추가 1.0 mL로 세포를 세척합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.</li>
</ol>3. 계보 항체 염색
<ol><li>표 1에열거된 항체 칵테일을 준비한다. 참고: 이러한 항체 칵테일은 이전에14,15,16으로최적화되었습니다.</li>
	<li>건강한 BM을 함유하는 실험튜브의 최종 미토콘드리아 ROS 염료 세척으로부터 상판을 흡인하고 각 튜브에 #1 항체 칵테일의 200 μL을 첨가한다. 혼합 하는 소용돌이. 또한 단색 제어 튜브를 준비합니다. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.</li>
	<li>백혈병 BM을 포함하는 실험 튜브의 최종 미토콘드리아 ROS 염료 세척으로부터 상판을 흡인하고 각 튜브에 #2 항체 칵테일의 200 μL을 첨가한다. 혼합 하는 소용돌이. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.</li>
	<li>1.0 mL의 차가운 F-PBS와 RT에서 300 x g에서 원심 분리기 5 분으로 씻으소서.</li>
	<li>차가운 F-PBS의 500 μL에서 세포를 재중단하고 응집체를 배제하기 위해 40 μm 필터를 사용하여 유동 세포계 튜브에서 세포를 필터링합니다.</li>
</ol>4. 유세포 분석 수집 및 분석
참고: 몇몇 조혈 줄기 및 전구체 부세트는 장기 조혈 줄기 세포와 같은 희소합니다. 따라서, 이상적으로는 다양한 HSPC 서브세트에서 미토콘드리아 ROS의 충분한 분석을 위해 유세포분석 수집 동안 각 실험관에 대해 3-5백만 개의 이벤트를 수집해야 한다.
<ol><li>무얼룩 제어 튜브를 사용하여 분석된 셀 집단의 크기와 복잡성에 따라 전방(FSC-A) 및 측면(SSC-A) 산란플롯을 설정합니다.</li>
	<li>유세포계를 보정하기 위해 얼룩 없음 및 단색 제어 튜브를 사용합니다.</li>
	<li>전방 및 측면 산란 플롯에서 외부 파편을 게이트 아웃(그림 2A, B,왼쪽에서 첫 번째 패널).</li>
	<li>전방 판별기(그림2A, B,왼쪽에서 두 번째 패널)와 같은 이중 판별체를 사용하여 더블을 게이트아웃합니다.</li>
	<li>도 2A,B에서 제안된 게이팅 전략을 따라 살아있는 세포, 계보 저세포 및 다양한 HSPC 및 백혈병 서브세트를 선택한다.</li>
	<li>관심 있는 각 집단에 대해, 히스토그램 플롯에서 TRPE 채널(x축)의 중간 형광 강도(MFI)를 분석하여 미토콘드리아 ROS 신호의 차이를 평가하였다(그림3A-C,좌측 패널). 미토콘드리아 ROS의 수준은 산란플롯에서 특정 계보 마커 대 미토콘드리아 ROS 염색을 비교하여 단일 세포 수준에서 평가될 수 있다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

ROS의 검출을 위해 개발된 형광 염료는 현미경 검사법또는 살아있는 세포에서 유세포분석법22에의해 고정된 세포에서 자주 평가된다. 미토콘드리아 ROS 형광 염료를 사용하여 BM 세포에서 미토콘드리아 ROS의 유세포측정 평가는 두 가지 주요 장점을 가지고 있습니다: 1) 살아있는 세포 분석에 적합한 빠르고 간단한 기술이며 2) 희귀를 구별하고 분석할 수 있습니다. 표면 마커 염색을 사용하여 BM의 단일 세포 수준에서 인구. 여기에 제시된 단계별 프로토콜은 유세포분석기를 사용하여 MLL-AF9에 의해 구동되는 AML의 마우스 모델뿐만 아니라 건강한 마우스모두에서 조혈줄기 및 선조 집단의 생체 내 레독스 상태를 연구하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜을 실행하는 동안 고려해야 할 몇 가지 주요 기술 변수가 있습니다.
첫 번째, 프로-산화 컨트롤의 사용은 사용자가 미토콘드리아 ROS 염색뿐만 아니라 얼룩의 특이성에 증가를 위한 기...

반응성 산소 종 (ROS)은 분자 산소에서 파생 된 반응성이 높은 분자입니다. ROS 생산의 가장 잘 정의 된 세포 위치는 미토 콘 드리 아, 어디 전자 수송 사슬을 통해 통과 하는 전자 (ETC) 산화 인 산화 동안 (OXPHOS) 특정의 형성으로 이어지는 분자 산소에 의해 흡수 수퍼 옥사이드1이라고불리는 ROS의 유형 . 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 또는 SOD라고 하는 일련의 효소의 활동을 통해, 수퍼옥사이드는 과산화수소로 변환되며, 이 수소는 카탈라제 또는 글루타티온 과산화효소(GPX)와 같은 효소에 의해 물로 중화됩니다. ROS 조절 메커니즘의 교란은 종종 산화 스트레스라고도 하는 ROS의 과잉 생산으로 이어질 수 있으며, 이는 거대 분자 손상 (즉, DNA, 단백질, 지질)과 같은 유해하고 잠재적으로 치명적인 세포 결과를 가지고 있습니다. 더욱이, 산화 스트레스는 당뇨병, 염증성 질환, 노화 및 종양2,3,4와같은 여러 병리와 관련이 있다. 항상성을 유지하고 산화 스트레스를 방지하기 위해 세포는 다양한 ROS 조절 메커니즘을 가지고5.
특정 ROS의 생리수준은 적절한 배아 및 성인 조혈에 필요하다6. 그러나, 과잉 ROS는 조혈 줄기 및 전구 풀의 DNA 손상, 세포 분화 및 고갈과 관련이 있다. 또한 레독스 생물학에 있는 변경백혈병과 건강한 세포 사이에서 다를 수 있다는 기록이 있습니다. 예를 들어, ROS 수준은 그들의 건강한 대조물의 대조와 다른 연구에 비해 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포에서 더 높은 경향이 백혈병 줄기 세포생존을 위한 ROS의 낮은 정상 상태 수준을 유지한다는 것을건의했습니다 7,8. 중요한 것은, 이러한 산화물의 차이를 치료적으로 활용하기 위한 전략은 몇몇 인간적인 암 조정9,10에서약속을 보여주었습니다. 그러므로, 마우스 모형에 있는 ROS 수준의 평가를 허용하는 분석제는 이 종이 세포 생리학 및 질병 병인에 어떻게 기여하는지의 우리의 이해를 향상할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적으로 의 효과를 평가하기 위한 발판을 제공할 수 있습니다 새로운 레독스 표적 항암 치료.

<table><tbody><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td><td>97068-085</td><td>미디어</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>코닝</td><td>30-002-CI</td><td>미디어</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352096</td><td>조직 배양 용품</td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352098</td><td>조직 문화 용품</td></tr><tr><td>40 &mu; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>조직 배양 용품</td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9751</td><td>조직 배양 용품</td></tr><tr><td>Menadione sodium Bisulfite</td><td>시그마 알드리치</td><td>M5750</td><td>프로 옥시던트</td></tr><tr><td>NAC</td><td>시그마 알드리치</td><td>A7250</td><td>항산화 CD3</td></tr><tr><td>PE-Cy5 클론 145-2c11</td><td>Biolegend</td><td>100310</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD4 PE-Cy5 클론 RM4-5</td><td>eBioscience</td><td>15-0041-81</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD8 PE-Cy5 클론 53-6.7</td><td>eBioscience</td><td>15-0081-81</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy5 클론 6D5</td><td>Biolegend</td><td>115510</td><td>항체</td></tr><tr><td>B220 PE-Cy5 클론 RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103210</td><td>항체</td></tr><tr><td>Gr1 PE-Cy5 클론 RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108410</td><td>항체</td></tr><tr><td>Ter119 PE-Cy5 클론 Ter-119</td><td>Biolegend</td><td>116210</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD48 PE-Cy5 클론 HM48-1</td><td>Biolegend</td><td>103420</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD117&nbsp; APC-Cy7 clone 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105825</td><td>항체</td></tr><tr><td>Sca1 peacific Blue clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108120</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD150 APC 클론 TC15-12F12.2</td><td>Biolegend</td><td>115909</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD34 FITC 클론 RAM34</td><td>BD Bioscience</td><td>553733</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD45.2 APC 클론 104</td><td>Biolegend</td><td>1098313</td><td>항체</td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td>염료</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>염료 라이브/데드 옐로우 염료</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34967</td><td>염료</td></tr></tbody></table>

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 mll-af9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

우리는 MLL-AF9에 의해 구동되는 AML을 가진 마우스뿐만 아니라 건강한 마우스에서 다양한 살아있는 골수 (BM) 파생된 줄기 및 전구 세포 인구에 있는 미토콘드리아 ROS를 분석하기 위한 교류 세포 측정 접근을 제시합니다. 구체적으로, 우리는 건강한 또는 백혈병 BM 세포가 미토콘드리아 과산화물을 검출하는 형광성 염료로 먼저 염색되고, 그 다음에 사용되는 불소크롬 연결된 단클론 항체로 염색하는 2 단계 세포 염색 과정을 기술합니다. 다양한 건강하고 악성 조혈 선조 집단을 구별합니다. 우리는 또한 유세포분석에 의한 시료를 획득하고 분석하기 위한 전략을 제공합니다. 전체 프로토콜은 3-4 시간만큼 짧은 시간 내에 수행 될 수있다. 우리는 또한 살아있는 조혈 및 백혈병 줄기 및 전구 소집단의 미토콘드리아 구획에서 ROS 생산을 모니터링하는 장점과 한계뿐만 아니라 유세포 측정에 의한 형광 염료를 사용하여 고려해야 할 주요 변수를 강조합니다. . 게다가, 우리는 미토콘드리아 ROS 풍부가 명백한 건강한 HSPC 하위 인구 및 백혈병 전구체 사이에서 변화한다는 것을 데이터를 제출하고 혈액학 연구에서 이 기술의 가능한 응용을 토론합니다.

제시된 것은 다중 건강 및 MLL-AF9 발현 백혈병 전구 집단의 미토콘드리아에서 ROS를 분석하는 방법이다. 그림 1은 4개의 주요 단계로 구성된 프로토콜 워크플로우의 개략적 보기를 표시합니다: 1) 마우스로부터의 BM 격리; 2) 미토콘드리아 ROS, 특히 과산화물을 인식하는 형광성 염료로 BM 세포를 염색하는 단계; 3) 다양한 건강 및 백혈병 조혈 인구를 묘사하기 위해 표면 마커 항체 염색; 및 4) 유세포 분석 수집 및 분석.
그림 2 A, B는 건강하고 백혈병 BM에 있는 각종 조혈 줄기 및 선조 인구를 분석하기 위한 대표적인 게이팅 전략을 묘사합니다. FSC/SSC 플롯은 이물질을 제거하기 위해 적용되며 FSC 영역(FSC-A) 대 FSC 높이(FSC-H) 플롯은 이중 및 집계를 제외하는 데 사용됩니다. 리니지 표면 마커의<stro...

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

반응성 산소 종 또는 ROS는 세포에 의해 생성되는 매우 반응성 산소 종이며, 그들의 행동에 영향을 미칩니다. 과잉 ROS는 또한 광범위 한 세포 혼란을 일으킬 수 있습니다 하지만, 그리고 심한 경우에, 세포 죽음. 따라서, ROS 항상성의 유지는 세포 기능 및 생존에 근본적으로 중요합니다.여기에 제시된 프로토콜은, 미토콘드리아에 의해 생성되는 특정 유형의 ROS를 측정하는 데 초점을 맞추고 있으며, 주로 살아있는, 정상 또는 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 집단뿐만 아니라 혈액암, 급성 골수성 백혈병 또는 AML의 마우스 모델에서 백혈병 세포에서 대사 부산물로 서 발생합니다. 이 프로토콜은 또한 유전자 삭제 또는 과발현과 같은 유전 조작이 몇몇 건강하고 악성 조혈 인구에 있는 미토콘드리아 ROS에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그리고 결과적으로, 잠재적으로 레두 상태 와 아마도 세포의 물질 대사에 대 한 통찰력 있는 정보를 제공.이 기술은 살아있는 건강하고 악성 조혈 줄기 및 선조 하위 인구에서 미토콘드리아 ROS 생산을 모니터링하기 위해 프로토겐 프로브의 흐름 정착 메트릭 분석을 승인합니다. 이 프로토콜은 간단하며 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 더욱이, 살아있는 세포 분석에 적합하며, 골수의 줄기 세포 집단에서 미토콘드리아 로스를 구별하고 분석할 수 있으며, 얼룩의 표면 마크를 이용하여.원고에 따르면 야생 단단한 마우스및 백혈병 MLL-AF9 마우스로부터 단핵 골수 세포를 수집한 후, 9개의 단일 색 대조구 각각에 세포 현탁액의 200 마이크로리터를 알리쿼트. 다른 실험 관에 나머지 세포를 알리쿼트, 각각 200 마이크로 리터. 그런 다음 골수 세포와 백혈구를 각각 포함하는 원심분리기 2개의 실험관및 1개의 대조군 관으로 놓습니다.원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 다음으로, 제조 자의 지시에 따라, 상체를 데칭하고, 라이브 / 죽은 세포 얼룩으로 실온 F-PBS에서 세포를 다시 중단합니다. 얼음에 30분 간 배양하세요.그 후, 3개의 라이브/데드 스테인드 튜브에 실온 F-PBS 1밀리리터를 추가하고, 미토콘드리아 ROS 염색을 위한 단일 컬러 제어 튜브를 추가합니다. 튜브를 원심분리기에 300배 G로 넣고 실온에서 5분간 넣습니다. 그런 다음, DMSO의 13 마이크로리터에서 미토콘드리아 ROS 염료 50 마이크로그램을 다시 일시 중단하여 5 밀리미터 미토콘드리아 ROS 염료 스톡 용액을 획득한다.그런 다음 13 마이크로 리터 미토콘드리아 ROS 염료에 실온 F-PBS 13 밀리리터를 추가하여 5 마이크로 몰러의 최종 농도로 희석합니다. 필요한 경우 미토콘드리아 efflux 펌프를 억제하기 위해 50 밀리머 베라파밀13마이크로리터를 솔루션에 추가합니다. 원심분리기에서 튜브를 얻고 살아있는 / 죽은 세포 얼룩의 세척을 흡인.라이브/데드 스테닝 컨트롤에 F-PBS 200 마이크로리터를 추가하고 분석을 시작할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 베라파밀을 함유한 미토콘드리아 ROS 염료 얼룩 200개, 각 실험 튜브, 미토콘드리아 ROS 염색 제어 튜브에 첨가한다. 소용돌이는 어둠 속에서 섭씨 37도에서 10 분 동안 혼합하고 배양합니다.그런 다음 제어 및 실험 튜브에 실온 F-PBS 1 밀리리터를 추가합니다. 원심 분리기는 실온에서 300배 G로 5분 거리에 있습니다. 슈퍼나텐트를 흡습하고 실온 F-PBS1밀리리터로 셀을 세척합니다.원심분리기는 실온에서 300배 G에서 5분간 다시 원심분리기를 사용할 수 있습니다. 첫째, 건강하고 백혈병 골수 세포를 위한 2개의 항체 칵테일을 준비합니다. 건강한 골수 세포를 포함하는 실험 관으로부터 상체를 흡인하고, 항체 칵테일 번호 1의 마이크로리터 를 튜브에 첨가한다.혼합 소용돌이. 또한 F-PBS의 200 마이크로리터와 해당 항체의 1개의 마이크로리터를 추가하여 단일 색 제어 관을 준비한다. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.백혈병 골수를 포함하는 실험관에서 초신자를 흡인시키고, 항체 칵테일 번호 2의 마이크로리터 200을 튜브에 추가합니다. 혼합 소용돌이. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.그 후, 모든 튜브를 차가운 F-PBS와 원심분리기 1밀리리터로 실온에서 300배 G로 5분간 세척합니다. 감기 F-PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 체온을 제외하기 위한 40 마이크로미터 필터로 각 유량 사이토미터 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.먼저, 유동 세포측정기에 얼룩 제어 튜브를 하나 도 삽입하고 유동 세포측정기의 보정을 위해 인수를 시작한다. 다른 제어 튜브에 대해 반복합니다. 그 후, 게이트를 설정하는 실험 튜브를 읽어보십시오.세포 집단의 크기와 복잡성을 분석하기 위해 먼저 건강한 HSPC를 위해 전방 분산 영역과 측면 분산 영역 플롯 인구를 설정합니다. 스퀘어 게이트 버튼을 눌러 전방 및 측면 흩어진 플롯에서 불필요한 잔해를 문밖으로 내보세요. 그런 다음 전방 분산 영역과 높이 플롯에서 이중 차별을 사용하여 더블 을 게이트합니다.라이브 셀, 계보 낮은 세포 및 다양한 건강한 HSPC를 선택합니다. 관심의 각 인구에 대해, 히스타그램 플롯에서 TRPE 채널의 중간 형광 강도를 분석하여 미토콘드리아 ROS 신호의 차이를 평가한다. 백혈병 인구를 위한 크기 분석, 게이팅 및 히스토그램 플롯의 동일한 절차를 반복합니다.건강한 마우스로부터 분리된 골수 세포는 살아있는/죽은 염료및 미토콘드리아 ROS 염료로 염색되었고, 이어서 계보 마커를 인식하는 항체로 염색하였다: 플러스 CD48, C 키트, Sca-1, CD34 및 CD150. 또한, 백혈병 마우스로부터의 골수 세포는 또한 CD45.1로 염색된 건강한 수령인 골수 세포로부터 MLL-AF9 백혈병 세포를 구별하기 위해 CD45.2로 염색되었다. 건강한 CD48 네거티브 LSK와 골로이드 전구사이의 미토콘드리아 ROS 염색을 비교하면 골수성 전구가 미토콘드리아 ROS 염색 수준이 상당히 높은 것으로 나타났습니다.더욱이, c-Kit 높은 백혈병 전구는 c-Kit 중간 낮은 백혈병 세포, 건강한 CD48 음성 LSK 및 골로이드 전조제에 비해 미토콘드리아 ROS 염색의 상당히 높은 수준을 표시합니다. C-Kit 중간 낮은 백혈병 세포, 또한 CD48 음성 LSK 세포에 비해 상당히 높은 값을 표시, 하지만 골수성 전조에. 미토콘드리아 ROS 염료는 반응성이 매우 높으며 다음 단계를 시작하기 전에 염료의 과잉이 제거되었는지 확인하기 위해 적절한 세척 단계가 필요합니다.살아있는 조혈 세포에서 redux 상태의 지식의 비트를 달성하기 위해,이 프로토콜에 사용할 수있는 몇 가지 화학적으로 뚜렷한 ROS 불소 염료가 있습니다. 이 기술은 문학에서 광범위하게 사용되었으며, 정상 대응과 비교하면 백혈병 세포에서 분화되는 대사 및 신호 경로에 대한 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

flow-cytometric-analysis-mitochondrial-reactive-oxygen-species-murine

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 논문은 시험 관내 및 주사 후 마우스에서 유도 된 급성 백혈병 C1498 세포 배양을 특성화하는데 사용될 수있는 기술적 인 방법을 제공한다. 표현형 및 기능 분석은 유동 세포 계측법, 면역 형광 현미경, cytochemistry 월 - 그룬 왈드 김사 염색을 사용하여 수행됩니다.

쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

학습하세요 유동 세포 분석을 통해 뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포와 MLL-AF9 구동 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종을 검출하는 방법을. 이 기술은 유전자 조작이 ROS 수준에 미치는 영향을 평가하여 급성 골수성 백혈병 치료 전략에 대한 통찰을 제공합니다.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

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