Name: 면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: 배우세요 면역 시냅스 형성 중 B 세포의 세포소기체 역학과 세포골격 재배열을 분석하는 영상 및 생화학 기법을. 이 방법은 B 세포 활성화 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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M.-I.Y.는 FONDECYT #1180900 연구 보조금으로 지원됩니다. J.I., D.F. 및 J.L.은 코미시온 나시오날 드 시엔시아 y 테크놀로지아의 펠로우십에 의해 지원되었다. 우리는 비디오 녹화 및 편집에 대한 폰티피시아 유니버시다드 카토리카 드 칠레에서 데이비드 오소리오에게 감사드립니다.

<ol><li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li>
<li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+who%2C+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li>
<li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+at+the+centrosome+controls+lymphocyte+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li>
<li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+antigen+extraction+in+the+B+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse.</a> Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).</li>
<li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+Receptor-Mediated+Antigen+Gathering+Requires+Ubiquitin+Ligase+Cbl+and+Adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+Recruit+Dynein+to+the+Signaling+Microcluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster.</a> Immunity. , (2011).</li>
<li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap1+%E2%80%93+cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).</li>
<li>Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+ligand+discrimination+through+a+spreading+and+contraction+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response.</a> Science. 312 (5774), 738-741 (2006).</li>
<li>Vascotto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-based+motor+protein+myosin+II+regulates+MHC+class+II+trafficking+and+BCR-driven+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation.</a> Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).</li>
<li>Reversat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+Par3+controls+B-cell+receptor+dynamics+and+antigen+extraction+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse.</a> Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).</li>
<li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor%E2%80%93mediated+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li>
<li>Duchez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Polarization+of+T+and+B+Cells+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse.</a> The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).</li>
<li>Pérez-Montesinos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+intracellular+association+of+selected+rab+small+GTPases+with+MHC+class+II+and+DM+during+dendritic+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation.</a> Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).</li>
<li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li>
<li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li>
<li>Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+centrosomes+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of centrosomes from mammalian cell lines.</a> Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).</li>
<li>Obino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vamp-7%E2%80%93dependent+secretion+at+the+immune+synapse+regulates+antigen+extraction+and+presentation+in+B-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).</li>
<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Events+in+B+Cell+Activation+BCR%3A+B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor.</a> Annual Review of Immunology. , (2010).</li>
<li>Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 B 림프구가 IS의 형성을 촉진하기 위해 세포 내 아키텍처를 재구성하는 방법을 연구하는 포괄적 인 방법을 설명합니다. 이 연구는 B 세포 활성화 도중 중심도, 골지 장치 및 리소좀과 같은 세포기관의 세포내 분포를 정량화하기 위하여 화상 진찰 기술의 사용을 포함하고, 어떻게 IS에 편광하는지. 추가적으로, 우리는 B 세포 활성화시 중심 조성물의 변화를 연구하는 생화확적인 접근을 기술합니다.
B 세포에서 IS의 형성을 촉진하기 위해, 우리는 수용성 면역 복합체 대신 고정 된 항원 (항원 코팅 비드)을 사용했는데, 이는 세포골격 재배열과 세포기관이 분리된 접촉 부위의 설립을 촉발하기 때문입니다. 쉽게 연구 할 수 있습니다. 이미징 B 세포 활성화에서 중요한 양상은 샘플의 준비입니다. 모든 이미지 수집은 이상적으로 1 :1 세포를 얻어야한다 : 비드 비율, 항원 접촉의 독특한 사이트에 세포기관의 편광을 정량화. 그러나, 어떤 경우에는 B 세포가 2개 이상의 구슬을 포획할 수 있어...

B 림프구는 다른 위협에 대하여 항체를 생성하고 병원체를 침입에 책임 있는 적응면역 계통의 필수적인 부분입니다. 항체 생산의 효율은 B 세포가 수용성 또는 표면 테더형형태로발생하는 항원을 획득, 공정 및 존재하는 능력에 의해 결정된다 1,2. BCR에 의해, 제시 세포의 표면에 부착된 항원의 인식은 IS3,4라고불리는 가까운 세포간 접촉의 형성을 이끈다. 이 동적 플랫폼 내에서 BCR 의존다운 스트림 신호 및 내분형 구획으로 항원의 내재화가 모두 일어난다. 업크업 된 항원 처리 및 MHC-II 분자에 조립 하 고 이후에 T 림프구에 제시. B-T 세포 협력이라고 불리는 생산적인 B-T 상호작용은 B 림프구가 항체 생산 혈장 세포 또는 기억 세포로의 분화를 촉진하는 적절한 신호를 수신할 수 있도록한다8.
2개의 기계장치는 B 세포에 의하여 항원 추출에서 관련시켰습니다. 첫 번째는 시냅스 갈라진 부분5,6에서모집과 융합을 겪는 리소좀에서 유래한 프로테아제의 분비에 의존합니다. 두 번째 는, 클라트린 코팅 구덩이 7로 내면화되는 막을 포함하는 항원의 질을 유발하는 Myosin IIA 매개 당기기힘에 달려 있습니다. 항원 추출 모드는 항원이 발견되는 멤브레인의 물리적 특성에 의존합니다. 그럼에도 불구하고, 두 경우 모두, B 세포는 두 가지 주요 리모델링 이벤트를 겪는다: actin 세포 골격 재구성 및 IS에 세포기관의 양극화. Actin 세포 골격 리모델링은 초기 확산 단계를 포함, 시 냅 스 막에서 actin 의존 돌출 항원과 접촉 하는 표면을 증가. 이것은 항원과 결합된 Bcrs가 분자 모터와 액틴 세포골격 리모델링 8,9,10의공동 작용에 의해 IS의 중심에 집중되는 수축 단계에 선행됩니다. 11. 세포기관의 편광은 또한 액틴 세포 골격의 리모델링에 의존합니다. 예를 들어, 중도체는 핵에서 결합되지 않고, 관련 액틴의 국소 탈중합에 의해, IS5,12에이 소기관의 위치를 재배치할 수 있게 한다. B 세포에서, 하나의 세포극(IS)에 중도의 위치(spositions)는 시냅스 막에 리소좀 모집을 안내하며, 이는 분비시 표면 테더된 항원의 추출 및/또는 처리를 용이하게 할 수 있다6. IS에서 모집된 리소좀은 MHC-II로 풍부하게 되며, 이는 T 세포13에제시될 내인성 구획에서 펩티드-MHC-II 복합체의 형성을 선호한다. 추가적으로, Golgi 장치는 또한 IS14에밀접하게 모집되는 것으로 관찰되었습니다, 분비 통로에서 골지 유래 소포가 항원 추출 및/또는 처리에 관여할 수 있었다는 것을 건의합니다.
전부, 시냅스 대형 도중 B 세포에 있는 세포내 세포기관 및 세포골격 재배열은 그들의 추가 활성화를 위해 요구된 능률적인 항원 취득 및 처리를 허용하는 중요한 단계입니다. 이 작품에서는 IS의 형성과 관련된 세포내 세포 내 리모델링을 연구하기 위해 B 세포에서 이미징 및 생화학 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 소개합니다. 이러한 기술은 다음과 같습니다: (i) 항원 코팅 비드와 항원 코팅 커버슬립으로 활성화된 B 세포의 면역형광 및 이미지 분석, 이는 IS에 동원되는 세포내 성분의 시각화 및 정량화를 가능하게 한다(ii ) 자당 그라데이션에 대한 초원심분리에 의해 B 세포에서 중심도가 풍부한 분획을 분리하여 세포 극성 조절에 잠재적으로 관여하는 중도체와 관련된 단백질을 식별할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>IIA1.6 (A20 변이) 마우스 B-림프종 세포</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>표면에 IgG 함유 BCR을 발현하는 염색체 Balb/c 기원의 마우스 B-세포 림프종 없음 Fc&gamma;IIR</td></tr><tr><td>100% 메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>직경 10mm 커버 글래스 두께 No. 1 원형</td><td>Marienfield-Superior</td><td>111500</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 488 형광- 동키 항 토끼 IgG&nbsp;</td><td>LifeTech&nbsp;</td><td>A21206</td><td>1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>알렉사 플루오 546 염소 항-토끼 항 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A-11071</td><td>1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>알렉사 플루오 647-커닝 된 팔로이딘</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A21238</td><td>1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>DNA와 형질주입 시약을 혼합하는 데 제조업체 지침을 따르십시오</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector 모델 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>프로그램 L-013 사용</td></tr><tr><td>아미노- 다이나 비드</td><td>ThermoFisher</td><td>14307D</td><td></td></tr><tr><td>항- 페리 센트린</td><td>&nbsp;Abcam</td><td>ab4448&nbsp;</td><td>1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>항- rab6</td><td>Abcam</td><td>ab95954</td><td>1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>항- sec61</td><td>Abcam</td><td>ab15575</td><td>1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>BSA</td><td>&nbsp;Winkler</td><td>&nbsp;BM-0150</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Winkler</td><td>CA-0520</td><td></td></tr><tr><td>배양 플레이트 T25</td><td>BD</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 소프트웨어</td><td>Fiji col.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7651&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Winkler&nbsp;</td><td>BM-0820</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-마우스 IgG 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-005-003</td><td>IIA1.6 양성 리간드</td></tr><tr><td>Goat-anti-마우스 IgM 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31186</td><td>IIA1.6 음성 리간드</td></tr><tr><td>HyClone 태아 우 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>56 oC에서 30 분 동안 열 비활성화</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Winkler</td><td>PO-1260</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Winkler</td><td>SO-1455</td><td></td></tr><tr><td>니콘 일립스 Ti-E 형광 현미경</td><td>&nbsp;Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>M</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름알데히드</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>안전 캐비닛에서 PBS로 4 % 희석하고 현재 사용</td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>액체</td></tr><tr><td>폴리 비드 아미노 마이크로 구체 3.00&mu;m</td><td>Polyscience</td><td>17145-5</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-리신</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>멸균수로 희석</td></tr><tr><td>토끼 항- 알파 튜불린 항체</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>1:1000 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>토끼 항- 마우스 lamp1 항체</td><td>Cell signaling</td><td>3243</td><td>1:200 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>토끼 항- cep55&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab170414</td><td>1:500 희석 권장되지만 최적화해야 함</td></tr><tr><td>토끼 항- 감마 튜불린 항체</td><td>&nbsp;Abcam</td><td>ab16504</td><td>&nbsp;Western Blot에 대한 1:1000</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>&nbsp;Merck</td><td>558255</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>수크로스</td><td>Winkler&nbsp;</td><td>SA-1390&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>&nbsp;Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>튜브 50ml</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 b 세포에서 세포 역학 공부

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

B 세포 수용체 (BCR)에 의한 표면 테더된 항원의 인식은 신호및 항원 세포 가 조정되는 면역 시냅스 (IS)의 형성을 유발합니다. IS 형성은 리소좀 및 골지 장치와 같은 중심도 및 관련 세포내 세포 기관의 시냅스 막에 편광된 모집을 수반하는 동적 액틴 리모델링을 포함한다. 액틴 리모델링의 초기 단계는 B 세포가 세포 표면을 증가시키고 시냅스에서 수집 된 항원 - BCR 복합체의 양을 최대화 할 수 있게합니다. 특정 조건하에서, B 세포가 단단한 표면에 관련되었던 항원을 인식할 때, 이 프로세스는 항원 추출을 촉진할 수 있는 리소좀의 현지 모집 및 분비에 결합됩니다. 취한 항원들은 T 도우미 세포에 대한 추가 프리젠 테이션을 위해 주요 조직 적합성 복합체 II (MHC-II) 분자에로드된 펩티드로 처리하기위한 전문 엔도 리소좀 구획으로 내재화됩니다. 따라서, IS의 형성과 관련되었던 세포역학을 공부하는 것은 B 세포가 활성화되는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 본 기사에서 우리는 B 세포에 있는 IS의 대형과 연관되는 세포 내 세포기관 위치 및 세포골격 재배열에 있는 변경을 공부하기 위하여 이용된 화상 진찰 그리고 생화확적인 기술 둘 다 토론할 것입니다.

본 논문은 B 세포가 IS의 형성을 유도하기 위해 구슬 또는 커버립에 고정 된 항원을 사용하여 활성화 될 수있는 방법을 보여줍니다. 우리는 면역 형광에 의한 다른 세포기관의 편광을 식별하고 정량화하는 방법과 IS와의 연관성에 있어 역동적인 변화를 겪는 단백질을 특성화하는 방법에 대한 정보를 제공합니다. 생화학적 접근법.
면역 형광에 의한 B 세포의 화상 진찰은 우리가 B 세포 활성화시 IS에 모집되는 중심도, 골지 장치 및 리소좀과 같은 세포기관의 역학을 따르는 것을 허용합니다. 하나는 IS에 이 세포기관의 편광을 측정하고 다른 조건 하에서 그(것)들을 비교하기 위하여 양적 적인 매개변수를 장악할 수 있습니다. 그림 1A에서볼 수 있듯이, 센트로솜과 골지 장치는 B 세포 활성화 시 IS에 모집됩니다. 모집은 B...

여기서 우리는 IS의 형성 동안 B 림프구에서 세포 편광 사건을 특성화하는 두 가지 접근법을 기술한다. 첫 번째, 세포 기관 모집 및 시 냅 스 막에서 세포 골격 재배열의 정량화 포함. 두 번째는 면역 시냅스에 대한 편광을 겪는 중심도의 조성의 변화를 특성화하는 생화학적 접근법입니다.

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

이 검토에서는, 우리는 면역학적 시냅스의 형성 도중 관찰된 세포골격 재배열뿐만 아니라 세포재형성을 연구하는 데 사용되는 화상 진찰 및 생화학 기술 둘 다 토론할 것입니다. 활성 리모델링의 초기 단계는 B 세포가 세포 표면을 증가시키고 시냅스에서 수집된 항원 BCR 복합체의 양을 최대화할 수 있게 합니다. 한편, 리소좀의 현지 모집은 시냅스 멤브레인의 중심과 함께, 고정된 항원 추출을 용이하게 하는 것으로 알려진 리소성 분비에 결합될 수 있다.업제 된 항원은 내막구 내에서 펩티드로 추가로 처리되며, 이는 T 도우미 세포에 대한 프리젠 테이션을 위해 MHC 클래스 II 분자에 로드됩니다. 따라서 면역 시냅스와 관련된 세포역학을 연구하는 것은 B 세포가 어떻게 완전히 활성화되는지 이해하는 데 매우 중요합니다. 고정된 항원으로 활성화된 B 세포의 면역 형광은 우리가 다른 세포 성분을 따르고 면역 시냅스로 모집될 수 있는 방법을 가능하게 합니다.B 세포는 비드 표면 또는 커버슬립 표면에서 고정된 항원들을 통해 활성화될 수 있다. 항원 코팅 구슬은 이전에 아미노 그룹을 활성화하기 위해 글루타랄데히드로 치료된 아미노 구슬로 특정 리간드를 배양함으로써 제조됩니다. PBS 및 소용돌이의 100 마이크로 리터에서 활성화 된 구슬을 재일시 중단합니다.한편, PBS의 150 마이크로리터에 BCR 리간드의 mL 당 100 마이크로그램을 추가하여 항원 용액을 준비한다. 다음으로, 항원 용액에 활성화 된 구슬 50 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 또한 관련없는 리간드를 음수 제어로 사용하십시오.인큐베이션 후 PBS로 구슬을 씻으실 수 있습니다. 슈퍼네티를 흡인하고 PBS로 대체하십시오. 세 번 반복합니다.다음으로, BSA용액의 500마이크로리터에서 구슬을 재일시 중단하여 3개의 아미노산을 차단한다. 마지막으로 PBS의 70 마이크로 리터에서 구슬을 다시 일시 중단합니다. 최종 농도를 계산하려면 혈안이계를 사용하여 구슬을 계산할 수 있습니다.B 세포 활성화의 경우 50mL 튜브를 사용하고 5%의 태아 소 혈청으로 보충된 CLICK에서 mL당 150만 개의 농도로 세포를 재중단합니다. 다음으로, 150, 000 B 세포를 추가하여, 다른 시간점에 대해 37도에서 폴리 L-리신 코팅 커버슬립 광고 인큐베이터에 셀 비드 혼합물의 100 마이크로리터에 대응한다. B 세포를 활성화하는 두 번째 접근법은 항원 코팅 커버립에 그들을 파종하는 것입니다.이를 위해 안티 BCR 및 B220을 가진 코트 슬라이드는 세포 접착력을 향상시킵니다. PBS에 항 BRC 및 B220을 추가하여 mL당 10 마이크로그램과 mL당 0.5 마이크로그램의 최종 농도를 각각 첨가하여 항원 용액을 준비한다. 다음으로, 파라필름 필름으로 덮인 24개의 웰 플레이트 뚜껑 위에 커버슬립을 설정하고 40마이크로리터의 항원 용액을 추가합니다.접시를 밀봉한 다음 하룻밤 사이에 4도에서 배양하십시오. 커버슬립에서 활성화를 시작하려면 먼저 PBS로 세척하고 몇 분 동안 건조하게하십시오. 다음으로, 150, 000 B 세포를 추가하고 다른 시간 점에 대해 37도에서 배양합니다.두 경우 모두 구슬이나 항원 코팅 슬라이드로 활성화할 때 가장 긴 시간 지점부터 시작한 다음 더 짧은 슬라이드로 진행하는 것이 좋습니다. 건조한 커버슬립을 현미경 슬라이드에 장착하면 해결 요구 사항에 따라 상피 불피 또는 공초점 현미경을 사용하여 샘플을 볼 수 있습니다. 전송된 빛을 사용하여 샘플을 집중합니다.셀과 구슬이 하나 비율에서 상호 작용하는 필드를 검색해야 합니다. 항원 커버립에서 활성화된 B 세포의 경우 100x 목표를 사용하여 더 나은 해상도를 확인하십시오. 매개 변수의 경우 전체 셀을 포함하는 z 스택을 복용하는 것이 좋습니다.actin에 레이블을 지정하여 셀의 하부 및 위쪽 경계를 구분할 수 있습니다. 항원 코팅 구슬로 활성화된 B 세포의 경우 1점에 국한된 세포기관을 위해 라벨을 부착하고, 먼저 세포 영역과 비드 영역의 두 영역을 구분합니다. 다음으로 위치 또는 소기관을 한 지점별로 식별하고 현지화 좌표를 얻습니다.세포 중심과 세포기관 사이에, 다른 벡터는 세포 중심과 비드 센터 사이에 하나씩 그립니다. 둘 다의 길이를 측정하고 이제 알파라고 하는 두 벡터 사이의 각도를 측정합니다. 알파의 과시안을 사용하여 중척추와 세포 센터 사이의 벡터로 투영한 다음, 투영된 벡터, a, b로 나누어 세포기관의 극성 지수를 계산한다.따라서 0과 1 사이의 극성 지수는 편광 표현형을 나타냅니다. 0과 영하 사이의 값은 비편광 표현형을 나타냅니다. 리소좀과 같은 분산 소기관에 대한 극성 지수를 결정하기 위해 앞에서 언급한 것과 동일한 알고리즘을 사용하여 레이블의 질량 센터 좌표에 대한 소세포 국소화 좌표를 변경할 수 있으며, 이 경우 리소좀이 있다.앞에서 설명한 분석과 마찬가지로 0과 1 사이의 극성 지수는 편광 표현형을 나타내고 0과 마이너스 사이의 값은 비편광 표현형을 나타냅니다. 새로운 시냅스로 밀접하게 모집된 각 소기관의 양을 정량화하기 위해 비드에서 소기관 형광의 백분율을 계산할 수 있습니다. 이를 위해 비드 및 세포 영역을 제한하고, 각각의 형광 강도를 측정한 다음 비드 와 세포 형광의 합에 의해 비드 형광을 분할해야 합니다.새 시냅스와 접촉하는 각 소기관의 양을 얻을 수 있습니다. 또는 비드 반대방향으로 사각형을 그립니다. 세포 길이의 사분의 분기에 해당하는 중량을 사용한 다음 직사각형 내의 형광 강도를 측정하고 총 형광으로 나눕니다.이 알고리즘은 항상 새로운 시냅스와 밀접하게 연관된 세포기관의 백분율을 얻으려면 인터페이스와 직접 접촉하는 것은 아닙니다. 휴식 및 활성화 된 B 셀에서 중구 관련 성분을 정량화합니다. 간단히 말해서, 우리는 세 가지 매개 변수를 결정합니다.셀 및 비드 영역 및 중심 국소화 좌표. 다음으로, 우리는 중심을 둘러싼 원을 정의하고 이전에 정의된 중심의 중심에서 방사형 프로파일 분석을 실행합니다. 플롯이 있으면 최대 형광의 70%가 유지되는 반지름을 결정합니다.이 반지름을 사용하여 중심을 둘러싼 원을 그립니다. 마지막으로, 중심면적 및 세포 영역에서 관심 성분의 형광 밀도를 얻고, 두 값을 나누어 형광 밀도 비율을 얻는다. 면역 시냅스 인터페이스에서 세포기관의 분포를 측정하기 위해 먼저 항원 코팅 커버슬립과 접촉하여 B 세포의 영역을 식별한다.이 영역을 정의하는 데 도움이 되는 액틴에 레이블을 지정할 수 있습니다. 다음으로 슬라이드와 접촉하는 영역, 셀의 높이 및 너비를 측정합니다. 항원 코팅 커버 슬립을 향한 영역은 B 세포 활성화 시 확산되는 B 세포의 측정이다.높이 및 너비 값을 사용하여 높이와 너비 값의 분기로 경계에서 구분되는 셀의 중앙 영역을 구분합니다. 일반적으로 이들은 총 세포 영역의 대략 1/3에 해당합니다. 마지막으로, 새로운 시냅스의 중심에서 세포원 모집을 계산하여 중앙 영역의 형광 밀도를 전체 세포의 형광 밀도로 나눈다.이 인덱스의 양수 값은 새 시냅스의 중심에 있는 세포기관 농축을 나타냅니다. 반대로 음수 값은 주변 분포를 나타냅니다. 항원 코팅 커버립에 활성화된 B 세포의 z-평면을 가로지르는 세포기관의 분포를 측정하기 위해 먼저 시냅스 인터페이스와 세포의 상한을 구분한다.다음으로 셀 중앙을 가로질러 선을 그리고 이미지를 다시 슬라이스하여 XZ 이미지를 얻습니다. 세포의 머리를 측정하고 면역 시냅스에서 세포의 상한에 이르기까지 동일한 영역의 10 분획으로 이미지를 분할합니다. 각 z-분획의 형광을 측정하고 각 z-분획에서 형광을 세포의 총 형광으로 나누어 형광의 백분율을 계산합니다.마지막으로 z 분획당 형광 강도의 백분율을 플롯합니다. 분수 1과 2는 시냅스 인터페이스를 나타냅니다. 다음은 워크플로 또는 중등 격리 절차입니다.조건당 2천만 B 세포를 사용하십시오. 중척추 분리를 용이하게 하기 위해 필요한 프로토콜에 따라 세포균 D 및 노코다졸로 세포를 사전 치료한다. 다음으로, TBS 버퍼의 5mL에서 다시 중단하여 셀을 감시한다.8%의 자당으로 보충된 0.1x TBS 버퍼의 1mL을 사용하여 반복하십시오. 150 마이크로리터의 리시스 버퍼로 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 10, 000 g의 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 사이토솔과 세포기관을 핵으로부터 분리합니다.조심스럽게 세포 상류체를 복구하고 1.5 mL 튜브 위에 배치. 60%의 자크로로 보충된 300마이크로리터의 그라데이션 버퍼로 채웁니다. 원심분리기 는 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000g의 원심분리기 샘플을 채취한다.이 원심 분리 단계는 중도체를 집중하는 것이 중요합니다. 원심 분리 후 인터페이스에 도달할 때까지 상체를 조심스럽게 제거합니다. 튜브에 남아 있는 샘플을 소용돌이.0.45mL의 70%의 자당, 0.27mL의 50%의 자당, 그리고 그라데이션 완충에서 40%의 0.27mL를 오버레이하여 초원심분리기 튜브에 불연속 자당 그라데이션을 준비한다. 중구농축 샘플을 불연속 그라데이션에 놓고 각 어댑터의 각 샘플의 중량을 보정합니다. 40, 000g의 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 원심분리하고, 최소한의 가속력과 그라데이션을 어지러워하지 않도록 휴식 없이 튜브를 분리합니다.원심 분리 후, 신중하게 동일한 볼륨12 분수를 수집합니다. 로딩 버퍼로 샘플을 다시 중단하고 SDS-PAGE를 실행합니다. 면역 시냅스의 형성 도중 B 세포에 있는 세포기관 분포를 공부하기 위하여는, 우리는 다른 시간 점에 대한 항원 코팅 구슬로 활성화된 2A1.6 B 세포를 이용했습니다.대조군으로서, B 세포는 관련이 없는 BCR-리간드를 포함하는 구슬로 활성화되었다. 그런 다음 면역 형광 염색을 사용하여 다른 세포기관을 감지하여 고정 된 항원으로 활성화시 국소화를 변경합니다. 우리는 여기에 Rab6a로 표시된 알파 튜룰린과 골기 장치로 표시된 센트로솜을 보여줍니다.그래프에서, 우리는 각 점이 하나의 세포를 나타내는 활성화의 각 시간 지점 은 중심 및 골기 장치 극성 verus에 대한 극성 인덱스를 표시합니다. 활성화 기간 동안, 우리는 이러한 소기관의 극성 지수가 1에 가까운 값에 도달한다는 것을 관찰할 수 있으며, 리소좀과 같은 분산 분포를 표시하는 IS.Organelles에 대한 모집증가도 극성 지수를 사용하여 정량화될 수 있음을 시사합니다. 활성화 시 리오소좀의 극성 지수가 더 긍정적인 값에 도달할 것으로 관찰할 수 있으며, 이는 IS모집에서 유래한 것입니다. 우리는 면역 시냅스를 향한 리소좀의 모집을 정량화하기 위한 보완적인 접근법을 보여줍니다.항원 코팅 구슬과 동일한 의정서를 사용하여 IS에 대한 리소솜 모집은 비드 주변 또는 시냅스 영역 내에서 정의된 영역으로 모집된 리오좀의 형광 라벨을 정량화하여 계산되었다. 우리는 오픈 활성화를 관찰 할 수 있습니다. 시 냅 스의 사이트에 결합 된 리소좀의 증가가 있다.여기서 우리는 특정 및 비특이적 항원 코팅 구슬로 활성화된 B 세포에서 중척추에 액틴의 정량화를 제시한다. 액틴 풀은 화살표로 표시됩니다. 이 경우 액틴과 같은 중구 관련 성분의 정량화는 각 점이 하나의 셀을 나타내는 점 플롯으로 나타낼 수 있습니다.활성화 후, B 세포는 중척추경 주위의 액틴의 양이 감소한다. 이 단계는 새로운 시냅스로의 양극화를 허용하기 위해 페리핵 지역에서 중원을 분리하는 것이 중요합니다. 항원 코팅 표면에 활성화된 B 세포의 경우, 시냅스 멤브레인에 대한 세포기관의 모집뿐만 아니라 액틴 리모델링을 연구할 수 있다.여기서는 각각 중앙 및 주변 분포를 표시하는 골기 장치 및 폐래 성 망상과 같은 세포기관의 분석을 보여줍니다. 또한, 우리는 활성화의 다른 시간 점 후 B 세포의 확산 영역을 계산할 수 있습니다. 이를 위해 XY 평면의 셀 제한을 정의할 수 있도록 액틴에 라벨을 부착합니다.그래프에서 활성화 30 분 및 60 분 후에 셀 영역의 증가를 관찰 할 수 있습니다. 소기관의 분포는 또한 시냅스 인터페이스에 각각 XZ 평면에서 계산될 수 있다. 그래프는 처음 두 평면이 시냅스 인터페이스에 해당하는 z 평면에서 액틴 분포를 나타냅니다.활성화 시 이 부위에 액틴이 풍부해지는 것을 관찰할 수 있습니다. 이미징 분석 외에도 생화학적 접근법은 B 세포 활성화 시 중구의 변화를 연구하는 데도 사용될 수 있습니다. 베이지 색 사각형으로 강조 표시된 센트로좀 함유 분획의 대표적인 서양 얼룩을 보여 드립니다.센트로솜 분획은 불연속 자당 그라데이션에서 격리되고 감마-튜룰린 평준화에 의해 검출되었다. 아래 서쪽 얼룩은 활성화시 고갈되는 휴식 B 세포에서 센트루소 분획에서 actin 및 Arp2를 보여줍니다. B 림프구는 기능성 면역 시냅스를 형성하기 위해 멤브레인 인터페이스에서 동적 변화를 겪습니다.이 과정은 이 비디오에서 여기에 설명된 이미징 및 생화학 적 기술에 의해 연구 될 수있다. 우리는 이 분석이 B 세포가 능동하게 활성화될 수 있는 방법에 관련되었던 분자 기계장치에 가치 정보를 제공할 수 있다는 것을 믿습니다.

studying-organelle-dynamics-in-b-cells-during-immune-synapse-formation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Bello-Gamboa, A. et al., 인간 면역학적 시냅스 이미징.J. Vis. 특급(2019년) 이 비디오는 형광 현미경을 사용하여 항원 제시 세포와 보조 T 림프구 사이의 면역학적 시냅스 형성에 대한 체외 연구를 보여줍니다. 보조 T 림프구의 T 세포 수용체는 항원 제시 세포의 항원-MHC-II 복합체와 상호 작용하여 면역학적 시냅스를 형성한 후 시냅스를 향한 분비 소포 이동이 이어지며, 이는 형광 현미경으로 시각화됩니다.

보조 T 세포와 항원 제시 세포 사이의 면역학적 시냅스 형성

이 비디오에서는 항원 코팅된 마이크로비드로 활성화된 B 림프구의 소기관 역학을 연구하는 방법을 설명합니다.

Organelle Dynamics in B Lymphocytes following Activation with Antigen-Coated Beads

이 비디오는 체외에서 B 세포 활성화를 보여줍니다. 이 과정에는 B 세포 수용체와의 항원 상호 작용이 포함되며, 이는 세포골격 리모델링, 면역 시냅스 형성, 리소좀 이동, 항원 내재화, 처리 및 B 세포 활성화를 위한 MHC 분자에 대한 후속 제시로 이어집니다.

항원으로 코팅된 커버슬립(Coverslip)을 이용한 B 세포 활성화

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

여기에서 우리는 두 가지 색상 STED의 nanoscopy에 의해 유리에 효과적으로 요약 NK 세포의 세포 독성 면역 시냅스 이미징을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 우리는 시냅스 단백질과 세포 골격의 하위 100 nm의 분해능을 얻을 수 있습니다.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

Coverslips B 세포 수용 체에 항 체, 초기 단계에 대 한 모델 코팅에 확산 하는 B 세포에서 동시에 이미지 걸 구조, microtubules, 및 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질에 호텔 위치 현미경 검사 법을 사용 하기 위한 프로토콜 소개 면역 시 냅 스 형성.

말라와 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하 여 B 세포 면역 냅에 Microtubule Cytoskeletons 시각화

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

배우세요 면역 시냅스 형성 중 B 세포의 세포소기체 역학과 세포골격 재배열을 분석하는 영상 및 생화학 기법을. 이 방법은 B 세포 활성화 메커니즘 연구에 필수적입니다.

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부

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