Name: CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9를 사용한 CAR-T 세포 유전자 편집 제조 프로토콜입니다. 이 방법은 CAR-T 세포의 효능을 높이고 독성을 줄여 암 면역치료 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 K12CA090628 (SSK), 국립 종합 암 네트워크 (SSK), 개별 의학메이요 클리닉 센터 (SSK), 프레돌린 재단 (SSK), 실천번역의 메이요 클리닉 사무소 (SSK) 및 보조금을 통해 지원되었습니다. 메이 요 클리닉 의료 과학자 교육 프로그램 로버트 L. 하웰 의사-과학자 장학금 (RMS).

이 프로토콜은 메이요 클리닉의 기관 검토 위원회 (IRB) 및 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 지침을 따릅니다.
1. CART19 셀 생산
<ol><li>T 세포 분리, 자극, 및 전 생체 배양<ol>
<li>적절한 개인 보호 장비를 활용하여 세포 배양 후드에서 모든 세포 배양 작업을 수행합니다. PBMC의 실행 가능한 근원으로 apheresis 도중 집합된 de-identified 정상 기증자 혈액 콘에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수확하십시오.13
</li>
		<li>PBMC를 분리하려면 밀도 그라데이션 매체의 15mL를 50mL 밀도 그라데이션 분리 튜브에 추가합니다. 세포 포획을 피하기 위해 2% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 인산완충식염수(PBS)와 동일한 부피로 기증자 혈액을 희석합니다.<ol>
<li>원뿔에서 희석 된 기증자 혈액을 분리 튜브에 추가하고 혈액과 밀도 구배 배지 사이의 계면을 방해하지 않도록주의하십시오. RT에서 10 분 동안 1,200 x g의 원심 분리기.</li>
			<li>상급체를 새로운 50 mL 원뿔형으로 장식하고, 최대 40 mL까지 가져와서 PBS + 2 % FBS로 씻고, RT에서 8 분 동안 300 x g의 원심 분리기, 흡기 상피, 버퍼 40 mL에서 재중단 및 셀 을 계산하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 완전 자동화된 셀 분리기를 사용하여 음의 선택 자기 비드 키트를 통해 PBMC로부터 T 세포를 분리합니다.</li>
		<li>단리된 T 세포를 배양하기 위해, 10% 인간 AB 혈청(v/v), 1% 페니실린-스트렙토마이신 글루타민(v/v), 및 혈청이 없는 조혈 세포 배지로 구성된 T 세포 배지(TCM)를 준비한다. 0.45 μm 멸균 진공 필터를 통해 여과한 다음 0.22 μm 멸균 진공 필터로 배지를 살균합니다.</li>
		<li>0일째(T 세포 자극의 날)에, T 세포를 자극하기 전에 CD3/CD28 구슬을 씻는다. 세척하려면 필요한 양의 비드(3:1 비드:T 셀의 비율로 충분한 CD3/CD28 비드사용)를 멸균 된 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 놓고 TCM의 1 mL에서 다시 일시 중단하십시오.</li>
		<li>자석과 접촉합니다.</li>
		<li>1분 후, 한심을 흡인하고 1 mL의 신선한 TCM으로 재중단하여 구슬을 세척한다.</li>
		<li>이 절차를 반복하여 총 3번의 세번을 세번 바하십시오.</li>
		<li>세 번째 세척 후, 한의학 의 1 mL에 구슬을 다시 중단.</li>
		<li>T 셀을 계산합니다.</li>
		<li>3:1 비드:셀의 비율로 구슬을 T 세포로 옮김.</li>
		<li>세포를 1 x 10 6세포 /mL의 최종 농도로 희석하십시오.</li>
		<li>37°C에서 배양하고, 24시간 동안 5% CO2를 배양한다.</li>
	</ol></li>
	<li>T 세포 형질 감염 및 변환<ol>
<li>BSL-2+ 예방 조치를 사용하여 렌티 바이러스 작업을 수행, 세포 배양 후드를 포함, 개인 보호 장비, 폐기하기 전에 표백제와 사용 된 재료의 소독.</li>
		<li>렌티바이러스 벡터에서 CART19 구문구를 획득합니다. 참고: 여기에 활용된 CART19 컨스트럭트는 시판되는 단백질 합성 벤더를 사용하여 드노보를 합성하도록 설계되었습니다. CAR 컨스트럭티드를 EF-1α 프로모터의 제어하에 3세대 렌티바이러스로 클로던트. 단일 사슬 가변 영역 단편은 FMC63 클론으로부터 파생되고 인간 CD19를 인식한다. CAR19 컨스트럭트는 2세대 4-1BB 코스티뮬레이션 도메인 및 CD3θ 자극(FMC63-41Bz)을 가지고 있다. 12세
</li>
		<li>앞서 설명한 대로 렌티바이러스 생산을 수행합니다. 12세<ol>
<li>간단히 말해서, 렌티바이러스를 생산하기 위해 70-90%의 동률에 도달한 293T 세포를 활용합니다.</li>
			<li>렌티바이러스 플라스미드 15 μg, 개그/폴/타트/레브 포장 벡터 18 μg, VSV-G 봉투 벡터 7 μg, 사전 착색 시약의 111 μL, 129 μL을 포함한 형질감염 시약의 실온에서 30분 동안 인큐베이션을 허용한다. 형질감염 시약, 및 293T 세포에 첨가하기 전에 형질감염 배지의 9.0 mL. 이어서 형질감염된 세포를 37°C, 5% CO2에서 배양한다.</li>
			<li>수확, 원심 분리기 (10 분 동안 900 x g), 필터 (0.45 μM 나일론 필터), 및 18 시간 동안 13,028 x g 또는 2 시간 동안 112,700 x g에서 초원심 분리에 의해 24 및 48 h에서 상급농축.</li>
			<li>나중에 사용하기 위해 -80 °C에서 동결하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1일째, T 세포를 부드럽게 재중단하여 0일째에 1 x 10 6/mL에서 자극된 T 세포의 장미를 분해합니다.</li>
		<li>모든 렌티바이러스 작업에 대한 적절한 BSL-2+ 예방 조치하에, 3.0의 감염(MOI)의 복합성에서 자극된 T 세포에 신선하거나 냉동 수확된 바이러스를 첨가하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T 셀 확장<ol>
<li>팽창의 단계 동안, 37°C, 5% CO2에서 형질전환된T 세포를 계속 배양한다. 3일 및 5일에 CAR-T 세포를 카운트하고, 1 x 10 6/mL의 CAR-T 세포농도를 유지하기 위해 배양에 신선하고 미리 온난한 TCM을 첨가한다.</li>
		<li>자석을 이용하여 자극(6일째) 6일 후 트랜스듀싱된 T 세포로부터 비드를 제거한다. 50 mL 원추형 튜브에 T 세포를 1 분 동안 자석에 수확, 재 중단 및 배치합니다. 그런 다음 상급체(CAR-T 세포 포함)를 수집하고 구슬을 버립니다.</li>
		<li>수집된 CAR-T 세포를 1 x 106 세포/mL의 농도로 배양하여 다시 배치하여 팽창을 재개한다.</li>
		<li>6일째에, 유세포분석으로 CAR의 표면 발현을 평가한다. 참고: 염소 항마우스 IgG(H+L)로 염색하거나 CD19 특이적 펩타이드로 염색하여 불소화로 컨쥬게이징하는 등 CAR의 표면 발현을 검출하는 데 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 여기서, 배양으로부터 aliquot(약 100,000 T 세포)를 취하고 덜베코의 인산완충식염수, 2% 태아 소 혈청 및 1% 나트륨 아지드로 제조된 유량 완충액으로 세척한다. 항 CAR 항체로 세포를 염색하고 두 번 씻으하십시오. 살아있는 / 죽은 얼룩 과 CD3 단일 클론 항체 (OKT3)로 세포를 얼룩. 셀을 세척하고 흐름 버퍼에서 다시 일시 중단합니다. 전도계를 획득하여 전도 효율을 결정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T 세포 냉동 보존<ol>
<li>CAR-T 세포를 자극 후 8일(T 세포 팽창 8일째) 수확하고 냉동 보존하기 위해 배양으로부터 세포를 수확한다.</li>
		<li>300 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하십시오.</li>
		<li>10% 디메틸 설폭사이드 및 90% 태아 소 혈청으로 구성된 동결 배지에서 유리병 당 1,000만 개의 세포에서 동결 배지에 다시 중단합니다.</li>
		<li>동결 용기에 동결하여 -80°C 냉동실에서 -1°C/min의 냉각 속도를 달성한 다음 48시간 후에 액체 질소로 옮김을 이월합니다.</li>
		<li>시험관 내 또는 생체 내 실험에 사용하기 전에 따뜻한 TCM에서 CAR-T 세포를 해동하십시오.</li>
		<li>세포를 세척하여 희석하고 디메틸 설폭사이드를 제거하고 따뜻한 TCM에서 2 x 106 세포 /mL의 농도로 다시 중단하십시오. 37 °C, 5 %CO2에서 하룻밤 휴식.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GM-CSF k/o CART19 생산
<ol><li>GM-CSF를 중단시키기 위하여는, 인간 사이토카인 GM-CSF를 위해 인코딩하는 CSF2 유전자에 대해 고효율을 가지는 것으로 보고된 gRNA 스크리닝을 통해 선택된 인간 GM-CSF(CSF2)의 가이드 RNA(gRNA)를 표적으로 하는 엑소3를 활용한다. 14세 참고: 이 gRNA를 함유하는 상업적으로 합성된 연구 등급 Cas9 3세대 렌티바이러스 구조(U6 프로모터 하에서)가 사용되었다. 컨스트럭트에는 푸로마이신 내성 유전자가 포함되어 있다. gRNA의 서열은 GACCTGCCTACAGACCCCCC이다. 12세
</li>
	<li>렌티바이러스를 생성하려면 70-90%의 동률에 도달한 293T 세포를 활용하십시오.</li>
	<li>관심 있는 렌티바이러스 플라스미드 15 μg, 개그/폴/타트/레브 포장 벡터 18 μg, VSV-G 봉투 벡터 7 μg, 사전 복합 시약 111μL, 트랜스펙션 시약 129 μL, 트랜스펙션 배지 9.0 mL을 허용하여 30분 동안 인큐베이팅 mperature.</li>
	<li>293T 세포에 형질감염 시약을 추가합니다. 이어서 37°C, 5%CO2에서 배양한다.</li>
	<li>수확, 원심분리기(10분동안 900 x g), 필터(0.45 μM 나일론 필터) 및 초원심분리에 의해 24 및 48시간에서 초원심분리에 의해 18시간 동안 13,028 x g 또는 112,700 x g의 초원분리기에서 2시간 동안 농축하고 향후 사용을 위해 -80°C에서 동결합니다.</li>
	<li>1일째에는 T 세포를 부드럽게 다시 일시 중단하여 장미를 분해합니다.</li>
	<li>BSL-2+ 승인 된 실험실에서, CAR-T 세포를 생성 하는 자극 된 T 세포에 냉동 또는 갓 수확 된 바이러스를 추가. CAR19 렌티바이러스와 CRISPR 렌티바이러스를 표적으로 하는 GM-CSF 를 모두 가진 T 세포를 변환합니다. 3의 MOI에 CAR19 렌티 바이러스를 추가합니다. CRISPR 렌티바이러스의 적정이 가능하지 않았기 때문에, 15 ug 플라스미드 제제에서 생성된 바이러스 입자를 사용하여 10 x 106 T 세포를 변환한다.</li>
	<li>1단계에서 논의된 바와 같이 T 세포 자극, 팽창 및 동결 보존의 나머지 단계를 참조하십시오.
</li>
	<li>순수마이신 내성을 운반하는 렌티CRISPR 편집 T 세포의 경우, 3일째와 5일째에는 1 mL당 1 μg의 순으로 푸로마이신 디하이드로클로라이드로 세포를 치료하십시오.</li>
</ol>3. GM-CSF 중단 효율 및 GM-CSF k/o CART19의 기능 평가
<ol><li>GM-CSF 중단 효율: 분해(TIDE) 시퀀싱 및 분석에 의한 인델 추적<ol>
<li>GM-CSF 유전자에 대한 관심의 엑슨을 서열화하려면, 다음 프라이머를 사용한다. TGACTACAGAGACACAGA의 GM-CSF(CSF2)에 대한 정방향 프라이머 시퀀스 및 TCACCTCTGACCTCATTAACC의 역방향 프라이머 시퀀스를 사용한다.</li>
		<li>게놈 추출 키트로 최대 5백만 대의 CAR-T 세포에서 DNA를 추출합니다. PCR 반응을 위해, μM의 PCR 반응에서 각 프라이머의 최종 농도와 반응당 25 μL의 Taq mastermix를 사용하고, 템플릿 DNA의 0.1-0.5 μg, 및 총 PCR 반응의 총 부피는 뉴클레아제 자유물로 최대 50 μL까지 가져왔다.</li>
		<li>표1에 설명된 PCR 사이클링 조건을 참조하십시오.</li>
		<li>1-2% 아가로즈 젤에서 100V에서 30분 동안 PCR 샘플을 실행하고 젤 추출 키트를 사용하여 추출합니다.</li>
		<li>시퀀스 PCR 앰플리온. 적절한 TIDE 소프트웨어에 원시 데이터를 업로드하여 대중 수정 빈도를 계산합니다. 15세
</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-CSF 생산 및 GM-CSFk/o CART19의 기능 평가<ol>
<li>CAR-T 세포의 사이토카인 생성을 결정하기 위해, CD19를 사용하여 급성 림프구성 백혈병 세포주 NALM6를 37°C에서 4시간 동안 1:5 비율로 발현하는 CD19를 사용하여 야생형 CART19 세포및 GM-CSFk/o CART19을 배양하여 37°C에서 5% CO2의 모렌신이 존재할 때 솔루션, 반 인간 CD49d, 안티 인간 CD28, 및 반 인간 CD107a.</li>
		<li>유세포측정을 위해 배양으로부터 세포를 수확한다. 유세포 분석 버퍼로 세포를 세척합니다. 살아있는/죽은 염색 키트로 세포를 염색합니다. 실온에서 15 분 동안 어둠 속에서 배양. 고정 매체로 세포를 고정하고 실온에서 15 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.</li>
		<li>세척 후, 세포를 반인간 IFNγ 단일클론 항체, 항인간 GM-CSF, 항인간 MIP-1β, 항인간 IL-2 및 반인간 CD3와 결합하여 투과성 배지로 세포 내로 염색하고 30에 대한 실온에서 어두운 환경에서 배양 샘플을 세척하고 다시 일시 중단하십시오. 유세포계에서 샘플을 획득하고 세포내 GM-CSF 발현비율을 분석하였다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK는 노바티스(Mayo Clinic, 펜실베이니아 대학, 노바티스)에 허가된 CAR T 세포 치료 분야의 특허에 대한 발명가입니다. 이 연구 결과는 Humanigen (SSK)에서 보조금에 의해 부분적으로 투자되었습니다. RMS, MJC, RS 및 SSK는 이 작업과 관련된 특허를 발명하는 발명자입니다. 실험실 (SSK)는 Tolero, Humanigen, 연, 렌티겐, 모르포시, 및 액티늄에서 자금을 받습니다.

이 보고서에서는 CRISPR/Cas9 기술을 활용하여 CAR-T 세포의 이차 수정을 유도하는 방법론을 설명합니다. 구체적으로, 이것은 GM-CSFk/o CART19 세포를 생성하기 위해 관심 유전자및 Cas9를 표적화하는 gRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 이용한 렌티바이러스 트랜스덕션을 사용하여 입증된다. 우리는 이전에 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CRS 및 NT를 개량한다는 것을 보여주었습니다. 12 앞에서 설명한 바와 같이, GM-CSFk/o CAR-T 세포는 제조 공정 중 GM-CSF의 억제를 허용하고, 다른 중요한 T 세포 기능을 유지하면서 GM-CSF의 생산을 효과적으로 감소시키고, 향상된 결과를 초래합니다. 야생형 CAR-T 세포에 비해 생체 내 항종양 활성. 12세
게놈에 있는 Cas9의 영구적인 통합은 임상으로 실행 가능한 제품으로...

키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암 치료에 큰 약속을 전시한다. 1개 , 2 CD19(CART19)를 표적으로 하는 2개의 CAR-T 세포 치료는 다중 센터 임상 시험에서 눈에 띄는 결과를 입증한 후에 B 세포 악성에 있는 사용을 위해 최근 유나이티드 명시된 및 유럽에서 승인되었습니다. 3개 , 4개 , 5 CAR-T 세포의 보다 광범위한 사용에 대한 장벽은 고형 종양에서 제한된 활성및 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경독성(NT)을 포함한 관련 독성이다. 3개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9 CAR-T 세포 치료의 치료 지수를 향상시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR과 같은 게놈 엔지니어링 도구가 덜 독성이 적거나 더 효과적인 CAR-T 세포를 생성하기 위해 CAR-T 세포를 추가로 수정하는 데 사용됩니다. 10개 , 11세
이 문서에서는 CRISPR/Cas9 편집된 CAR-T 셀을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 특정 목표는 CRISPR/Cas9를 통해 CAR-T 세포 제조 중에 CAR-T 세포를 유전적으로 수정하여 독성이 적거나 더 효과적인 CAR-T 세포를 생성하는 것입니다. 이 방법론을 개발하기위한 근거는 CAR-T 세포 치료의 치료 기간을 증가시키고 응용 프로그램을 확장하기 위한 새로운 전략이 절실히 필요하다는 것을 나타내는 CAR-T 세포 치료의 임상 경험에서 얻은 교훈을 기반으로 합니다. 그밖 종양은 병원에 들어가기 시작한 CAR-T 세포의 다중 수정을 허용하는 합성 생물학에 있는 최근 어드밴스에 의해 지원됩니다. 아연 핑거 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR과 같은 여러 게놈 엔지니어링 도구가 개발되고 적용되고 있는 동안, 당사의 방법론은 CAR-T 세포의 CRISPR/Cas9 수정을 설명합니다. 10개 , 11 CRISPR/Cas9는 외래 DNA를 제거하도록 설계된 RNA 기반 세균 방어 메커니즘입니다. CRISPR은 가이드 RNA (gRNA)를 통해 확인된 표적 서열을 갈라기 위하여 endonucleases에 의존합니다. CAR-T 세포의 CRISPR 편집은 다른 게놈 엔지니어링 도구에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이들은 gRNA 순서의 정밀도, 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 디자인하는 단순성, 높은 유전자 편집 효율성 및 다중 gRNA가 동시에 사용될 수 있기 때문에 다중 유전자를 표적으로 하는 기능.
구체적으로 여기에 기술된 방법에서, 우리는 CRISPR 가이드 RNA 및 Cas9를 코딩하는 렌티바이러스를 사용하여 T 세포의 CAR 주입 동안 유전자를 중단하였다. CAR-T 세포를 편집하기 위한 적절한 기술을 선택할 때, 여기서 설명한 기술은 연구 등급 CAR-T 세포를 생성하는 효율적인 메커니즘이지만, Cas9를 게놈에 영구적으로 통합하는 장기적인 효과는 알려지지 않기 때문에, 우리는 개념 연구 등급 CAR-T 세포의 증거를 개발하지만 좋은 제조 연습 학년 CAR-T 세포를 생산하지 않는이 방법론을 제안한다.
특히, 여기서 우리는 인간 CD19를 표적으로 하는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 녹아웃 CAR-T 세포의 생성을 기술한다. 이들 CAR-T 세포는 GM-CSF(유전자 명 CSF2) 및 Cas9에 특이적인 가이드 RNA를 코딩하는 렌티바이러스 입자를 가진 트랜스덕션에 의해 생성되었다. 우리는 이전에 GM-CSF 중화가 이종이식 모델에서 CRS 및 NT를 개량한다는 것을 발견했습니다. 12 개의 GM-CSFk/o CAR-T 세포는 제조 과정에서 GM-CSF의 억제를 허용하여 야생형 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포 항종양 활성 및 생존을 향상시키면서 GM-CSF의 생산을 효과적으로 감소시킵니다. 12 따라서, 여기서 우리는 CRISPR/Cas9 편집된 CAR-T 세포를 생성하는 방법론을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>CD3 단클론 항체 (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 단클론 항체 (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 시스템 B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>플로우 사이토미터</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td> <td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep 자석</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 인간 T 세포 분리 키트&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>음성 선택 자석 구슬; 17951RF 포함 팁과 버퍼</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>고정 매체 (매체 A)</td> <td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA 구성물 : 이름 : CSF2 CRISPR 가이드 RNA 1; 종 : 인간, 벡터 : pLentiCRISPR v2; 저항성 : 암피실린; 사본 번호 : High; 플라스미드 준비 : 표준 배달 : 4 &mu; g (무료 </td>)<td>GenScript</td><td>N/A</td><td>사용자 정의 주문</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td><td>데스크탑 유전학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 AB 혈청; 남성 기증자; AB형; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma 단클론 항체 (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 형질주입 시약</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정식 Aqua Dead Cell 염색 키트, 405nm 여기용</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin Solution, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 CD28 클론 CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 CD49d 클론 9F10</td><td>BD Pharmingen 561892</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 MIP-1&beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 용기</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, 클론 G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>급성 림프모구 백혈병 세포주</td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리 워터</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 진공 필터 시스템, 500mL, PES 멤브레인, 0.22uM, 멸균</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>CN 멤브레인이 있는 Nalgene Rapid-Flow 멸균 일회용 필터 장치 0.45uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 미디엄(1X), 리퀴드</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 마우스 안티-휴먼 IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100X), 리퀴드</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>투과화 배지(미디엄 B)</td><td>인비트로겐</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 게놈 DNA 미니 키트</td><td>인비트로겐</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로라이드</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>전자동 세포 분리기</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 무혈청 조혈 세포 매체</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9를 사용하여 car-t 셀에서 gm-csf를 제거합니다.

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

키메라 항원 수용체 T (CAR-T) 세포 치료는 암에 대한 최첨단 잠재적으로 혁명적 인 새로운 치료 옵션입니다. 그러나, 암의 치료에 그것의 광범위 한 사용에 상당한 제한이 있다. 이러한 제한은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 신경 독성 (NT) 및 고형 종양에서 제한된 확장, 이펙터 기능 및 항 종양 활성과 같은 독특한 독성의 개발을 포함한다. CAR-T 효능및/또는 CAR-T 세포의 독성을 조절하는 한 가지 전략은 CAR-T 세포 제조 중에 CAR-T 세포의 게놈을 스스로 편집하는 것입니다. 여기에서, 우리는 과립구 대식세포 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 Cas9에 가이드 RNA를 포함하는 렌티 바이러스 구조를 가진 transduction를 통해 CAR-T 세포에 있는 CRISPR/Cas9 유전자 편집의 사용을 기술합니다. 예를 들어, 우리는 GM-CSF의 CRISPR / Cas9 중재 녹아웃을 설명합니다. 우리는 이 GM-CSFk/o CAR-T 세포가 중요한 T 세포 기능을 유지하면서 효과적으로 적은 GM-CSF를 생성하고 야생 형 CAR-T 세포에 비해 생체 내에서 향상된 항 종양 활성을 초래한다는 것을 보여주었습니다.

그림 1은 GM-CSFk/o CART19 셀에서 GM-CSF의 감소를 나타낸다. T 세포의 게놈이 녹아웃 GM-CSF로 변경되었는지 확인하기 위해, TIDE 시퀀싱을 GM-CSFk/o CART19 세포(도1A)에서사용하였다. CAR-T 세포 표면 염색은 T 세포가 살아있는 CD3+ 세포상에서 게이팅을 통해 시험관 내에서 CAR 표면 수용체를 성공적으로 발현하는 것을 확인한다(도1B). 유세포분석에 의한 GM-CSF의 세포내 염색은 살아있는 CD3+ 세포에서 게이팅함으로써 GM-CSF에서 GM-CSF의 감소된 발현을 입증하고, 녹아웃의 기능적 성공을 검증한다(도 1C). GM-CSFk/o </s...

여기에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 CAR-T 세포를 유전적으로 편집하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

우리의 프로토콜은 CRISPR 기술을 통해 제조 하는 동안 CAR-T 세포의 유전자 변형을 설명 하 고 더 효과적이 고 덜 독성 제품을 생성. 이 기술의 장점은 CAR-T 세포 생산 및 유전 조작모두 좋은 효율을 가진 한 세포에서 발생할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 로잘리 스테너, MD 박사 과정 학생, 미셸 콕스, 기술자 및 대학원생, 그리고 내 실험실에서 박사 후 동료 인 로나 사케무라 (Reona Sakemura)가 될 것입니다.수확된 말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 격리한 후, 먼저 T 세포 배지를 제조한 다음 0.45 마이크로미터 멸균 진공 필터를 통해 필터링한 다음 0.22 마이크로미터 멸균 진공 필터로 이를 살균하여 배양하기 시작합니다. T 세포 자극 또는 일 제로의 날에, 자극 하기 전에, 세척 CD3/CD28 구슬의 필요한 볼륨멸균 에 구슬의 필요한 볼륨을 배치 하 여 1.5 밀리 리터 미세 원심 분리 기 튜브 및 TCM의 1 밀리 리터에서 다시 중단. 튜브를 자석과 1분 동안 접촉합니다.그런 다음 TCM을 흡인하고 신선한 TCM의 1 밀리리터로 다시 중단하여 구슬을 다시 씻고 총 3개의 세척을 반복합니다. 그리고 마지막으로, TCM의 1 밀리리터에서 구슬을 다시 중단합니다. T 세포를 계산한 후 구슬을 세포에 3 대 1구슬의 비율로 T 세포로 옮기다.그런 다음 세포를 밀리리터 당 100만 개의 세포로 희석하고 섭씨 37도, 24시간 동안 5%CO2로 배양합니다. 렌티바이러스 벡터에서 CART19 구조를 획득한 후, 렌티바이러스 플라스미드, 포장 벡터, 봉투 벡터, 프리컴터링 시약, 트랜스페션 시약 및 실온에서 30분 동안 트랜스포팅 배지를 먼저 배양하여 렌티바이러스 생산을 수행한다. 세포 배양 후드, 개인 보호 장비 및 폐기 전에 표백제로 사용된 물질의 소독을 포함하여 BSL2+예방 조치를 사용하여 렌티바이러스 작업을 수행하십시오.인큐베이션 후, 70~90%에 도달한 293T세포에 이러한 트랜스페션 시약을 추가하고 37°C와 5%CO2에서 전과 세포를 배양한다. 24 및 48 시간 에서 트랜스포밍, 수확, 원심분리기, 필터 및 농축 바이러스 함유 상류체에 의한 초원심분리에 의한 및 농축 및 향후 사용을 위해 영하 80도에서 동결한다. 첫날, 세포의 장미를 분해하기 위해 0 일째에 밀리리터 당 백만 세포에서 자극 된 T 세포를 부드럽게 재중단합니다.적절한 BSL2+예방 조치하에서, 3.0의 감염의 복합성에서 시뮬레이션된 T 세포에 신선하거나 냉동 수확된 바이러스를 추가하십시오. 트랜스듀스된 T 세포를 섭씨 37도, CO2 5%로 계속 배양합니다. 3일과 5일에는 CAR-T 세포를 계산하고 밀리리터당 100만 개의 CAR-T 세포 농도를 유지하기 위해 배양에 신선한 사전 데워진 TCM을 첨가합니다.시뮬레이션 후 6일 후, 세포를 먼저 수확하고 다시 중단하여 변환된 T 세포에서 구슬을 제거합니다. 50 밀리리터 원뿔 관에 세포를 전송하고 1 분 동안 자석에 튜브를 배치합니다. CAR-T 세포 함유 슈퍼나탈을 수집하고 구슬을 버린 후, 배양 플라스크에서 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 세포를 배양에 다시 배치한다.유동 세포측정을 위해 세포 샘플을 사용하여 CAR의 표면 발현을 평가합니다. 나머지 를 배양하여 확장을 재개한 다음 원고에 설명된 대로 8일째에 세포를 수확하고 냉동 보존합니다. 과립 세포 대식세포 식민지 자극 인자를 방해하려면 원고에 설명 된 바와 같이 가이드 RNA를 활용하십시오.실온에서 30분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 70~90%에 도달한 293개의 T세포에 추가하고, 렌티바이러스를 생성하기 위해 섭씨 37도, 5%CO2에서 감염된 세포를 배양한다. 24 시간 및 48 시간에서 50 밀리리터 초원심 분리 관에서 초원심 분리에 의해 바이러스 함유 상체를 수확하고 농축하고 향후 사용을 위해 영하 80도에서 동결하십시오.그런 다음 첫날에 T 세포를 부드럽게 다시 중단하여 장미를 분해합니다. BSL2+승인 실험실에서 CAR-T 세포를 생성하기 위해 CAR19 렌즈바이러스 및 GMCSF 표적 CRISPR 렌즈바이러스를 시뮬레이션된 T 세포에 추가합니다. 3일째와 5일째에 푸오마이신 저항을 운반하는 렌티크리스프르 편집T 세포를 성공적으로 변형하여 밀리리터당 1마이크로그램의 푸오마이신 농도로 푸오마이신 디하이드로클로라이드로 세포를 치료한다.조류 시퀀싱은 생CD3 양성 세포에 게이트된 CAR-T 세포 표면 염색의 약 71%의 흐름 플롯을 가진 GM-CSF 녹아웃 CART19 세포의 GM-CSF 감소를 확인하는 데 사용되었으며, 이와 유사한 방식으로 바이오트로에서 CAR 표면 수용체를 발현하는 것으로 나타났다. 한편, 멜트세포-세포측정에 의한 GM-CSF의 세포내 염색은 또한 살아있는 CD3 양성 세포에 게이트되어 야생형 CART19 세포에 비해 녹아웃 세포에서 GM-CSF의 발현감소를 입증하여 녹아웃의 기능적 성공을 확인한다. 그들은 유전자 변형 CAR-T 세포의 개발에 가장 중요 하기 때문에 특정 주의이 절차의 변환 단계 동안 취해야 한다.설명된 방법론은 잠재적으로 CRISPR/CAS9를 통해 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 유전자의 다양한에 적용될 수 있고 보다 효과적인 제품을 생성하는 것을 돕습니다. CRISPR/CAS9 기술은 CAR-T 세포의 게놈을 직접 표적으로 삼아 현재임상 결점에 대한 솔루션을 설계하는 전략을 제공합니다.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 CRISPR-Cas9 시스템을 통해 유전자 변형 CAR T 세포를 만드는 과정을 간략하게 설명합니다. T 세포를 CRISPR과 CAR 렌티바이러스에 감염시키면 표적 유전자가 변형되고 키메라 항원 수용체(CAR)가 합성되어 궁극적으로 유전적으로 변형된 CAR T 세포가 형성됩니다.

CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 CAR T 세포의 유전자 변형

이 동영상은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 인간 T 세포에서 유전자 편집을 수행하는 방법을 보여줍니다. 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체와 결합되어 knockout을 위한 특정 유전자를 표적으로 합니다. 전기천공법(electroporation) 시 sgRNA는 Cas9을 타겟 DNA 염기서열로 유도하여 정밀한 절단을 생성합니다. 그런 다음 이러한 절단은 세포의 비상동 말단 결합 메커니즘에 의해 복구되어 유전자 녹아웃으로 이어집니다.

T 세포의 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

녹아웃 동물을 사용 하 여 유전자의 손실의 기능 연구를 기존의 자주 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. CRISPR 중재 체세포 mutagenesis Electroporation 기반 유전자에 vivo기능을 이해 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 소 뇌의 세포 증식에 녹아웃 고기를 분석 하는 방법을 보고 합니다.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

여기서, 우리는 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 CRISPR Cas 기술을 사용하여 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 편집을 위한 프로토콜을 제시합니다.

인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

여기에서는 맥락총의 유전자 발현을 선택적으로 변경하면서 다른 뇌 영역에는 영향을 주지 않는 방법을 설명합니다.

맥락총(Choroid Plexus)에서 유전자의 표적 녹다운(Targeted knockdown of Genes in the Choroid Plexus)

이 논문은 건강한 기증자 키메라 항원 수용체 T 세포에서 게놈 전체 CRISPR 녹아웃 스크리닝을 완료하기 위해 고갈에 대한 체외 모델을 적용하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

키메라 항원 수용체 T 세포에서 체외 게놈 와이드 CRISPR 녹아웃 스크리닝 수행

우리는 원발성 CAR T 세포에 대한 최적화된 CRISPR-Cas9 녹아웃 스크리닝 프로토콜을 개발했습니다. 효소 소화와 sgRNA 카세트 풀다운을 통한 gDNA 운반을 줄임으로써 PCR 인공물을 최소화하고 정확한 sgRNA 검출과 기능성 유전자 표적의 견고한 식별을 보장합니다.

CAR T 세포에서 CRISPR-Cas9 스크리닝 개선: 라이브러리 준비를 위한 정교한 방법

배우세요 CRISPR/Cas9를 사용한 CAR-T 세포 유전자 편집 제조 프로토콜입니다. 이 방법은 CAR-T 세포의 효능을 높이고 독성을 줄여 암 면역치료 연구에 활용됩니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

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