Name: 에 버 버를 사용 하 여 자동화 된 고 처리량, 지속적인 세포 성장 실험 설계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 eVOLVER 플랫폼을 활용한 자동화된 고처리량 연속 미생물 배양 실험 설계 방법을. 실시간 데이터 모니터링과 다중 파라미터 제어를 통해 균주 간 적응도 변이를 정량적으로 분석할 수 있습니다.

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우리는 시스템의 설계에 그의 도움에 대 한 b. 스태퍼 드, 그리고 h. 칼 릴, a. 솔 타 니 탄, a. 일, s. 파이프 및 시스템의 건설에 대 한 도움을 위한. 우리는 전자 설계 시설 (EDF), 엔지니어링 제품 혁신 센터 및 서비스를 위해 보스턴 대학에서 컴퓨팅을 위한 하리리 연구소에서 소프트웨어 & 응용 프로그램 혁신 연구소 (항해)를 인정 합니다. 이 작품은 NSF 경력 상 (1350949에 A.S.K.)에 의해 지원 되었으며 DARPA는 HR0011-0091 및 HR0011 0014를 A.S.K.에 부여 합니다. A.S.K.는 또한 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2AI131083-01), DARPA 젊은 교수진 상 (D16AP00142) 및 컴퓨팅에서의 NSF 원정 으로부터의 자금 조달을 인정 합니다 (1522074).

1. 미디어, 바이 알 및 접종 준비
참고: 이 프로토콜은 사용자가 이미에이 버 시스템을 보정 했으며 이전 작업16에 설명 된 스마트 슬리브 구성을 사용 한다고 가정 합니다. 스마트 슬리브는 쉽게 재설계 되거나 수정 되지만 볼륨 및 제어 매개 변수의 설정 세부 사항은 대체 구성에 따라 다를 수 있습니다.
<ol><li>실험 전날, 30 ° c에서 BY4741 이상 300으로 설정 된 진 탕 인큐베이터에서 r.p.m.의 참조 스트레인과 변형 균 주를 2 mL 밤새 액상 배양 하 여 준비 한다.</li>
	<li>멸 균 된 YPD 매체를 튜브가 장착 된 깨끗 하 고, 오토 클레이 브 병으로 전달 합니다. 대안적으로, 매체는 튜브가 미리 장착 된 병에 직접 가압 멸 균 될 수 있다. 참고: 병은 캡에 구멍을 뚫 고 제자리에 고정 하기 위해 커넥터를 통해 튜브를 실행 하 여 튜브에 적합 합니다. 재료 표를 참조 하십시오.</li>
	<li>각 유리병에 교 반 바를 추가 하 고 유입 및 불렀습니다 빨 대가 장착 된 바이 알 뚜껑을 조입니다. 육안 검사를 통해 모든 구성품이 깨끗 한지 확인 합니다.</li>
	<li>바이 알을 오토 클레이 버블 랙에 넣고, 호 일로 덮고, 20 분의 멸 균 단계에서 중력 또는 진공 사이클로 오토 클레이 브를 사용 하십시오.</li>
</ol>2. 실험 설정
<ol><li>3 개의 큰 비 커에서 10% 표 백제 500, 200 mL의 10% 표 백제 및 300 mL의 70% 에탄올을 준비 하십시오.</li>
	<li>에이 버 디바이스의 스위치를 사용 하 여, 컴퓨터에서 5v 전원 공급 장치를 켜고 5 초 동안 기다린 다음 12v 전원 공급 장치를 켭니다.</li>
	<li>같은 미디어 병에서 여러 개의 튜브를 실행 하는 경우, 튜브 스플리터와 여러 미디어 입력 라인을 연결 합니다. 맞춤형 튜빙 스플리터는 Luer 컴포넌트로 구성할 수 있습니다.</li>
	<li>제 1 표 백제 비 커에 미디어 입력 라인을 서브 머지 하 고, 제 2 표 백제 비 커에 매체 불렀습니다 라인을 한다. 두 번째 비 커에 미디어 입력 라인의 다운스트림 끝을 불렀습니다 라인으로 배치 합니다. 폐기물 carboy에 폐기물 라인을 배치 합니다.</li>
	<li>실험 중에 생성 된 폐기물을 살 균 하는 큰 빈 폐기물 carboy에 표 백제를 1-2 L을 추가 합니다. 안전 코디네이터와 상의 하 여 폐기물의 적절 한 폐기를 보장 하십시오.</li>
	<li>터치 스크린을 사용 하 여 설치 섹션으로 이동 하 고 20 초 동안 모든 펌프를 실행 하 여 유체 라인을 10% 표 백제로 채웁니다. 실행 중에는 모든 라인이 채워져 있고 펌프가 정상적으로 작동 하 고 있는지 육안 검사를 통해 확인 하십시오. 표 백제 들이 소독을 위해 30 분 이상 라인에 앉을 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>라인이 더 이상 침수 될 때까지 터치 스크린 응용 프로그램을 사용 하 여 다시 펌프를 실행, 가능한 한 표백의 많은 얻을 수 있는 라인을 통해 공기를 밀어.</li>
	<li>상기와 같이, 에탄올로 라인을 충전 하 고 공기로 플러싱 하 여 상기와 같이 매체 입력 라인에 배치 한다. 참고: 에탄올이 빨리 죽 게 되 면 살 균을 위해 30 분을 기다릴 필요가 없습니다.</li>
	<li>Luer 커넥터를 사용 하 여 미디어 병에 미디어 입력 라인을 부착 하 고 미디어가 완전히 라인을 통과할 때까지 펌프를 실행 하 여 잔류 에탄올을 배출 합니다.</li>
	<li>소독 된 바이 알을에 그 라인의 스마트 슬리브에 부분적으로 삽입 하 고 선 위에 컬러 코딩에 따라 적절 한 위치에 라인을 연결 합니다. 짧은 유입 빨 대에 입력 라인을 부착 하 고 긴 불렀습니다 짚에 라인을 낭비 하 여 시작 합니다. 주의: 느슨한 연결 또는 잘못 라우팅된 회선을 확인 하는 것이 중요 합니다. 그렇게 하지 않으면 오버플로우가 발생 하 고 스마트 슬리브가 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>모든 펌프를 10 초 단위로 실행 하 여 바이 알을 미디어로 채웁니다. 육안 검사를 통해 불렀습니다 펌프는 오버플로 방지를 위해 불렀습니다 빨 대를 통해 미디어를 효율적으로 제거 합니다. 불렀습니다 빨 대가 효율적으로 작동 하지 않는 것으로 보이는 경우에는 유체 라인 연결과 연동 펌프를 점검 하십시오. 필요에 따라 부품을 수정 하거나 교체 합니다.</li>
	<li>스마트 슬리브가 완전히 감싸 질 때까지 바이 알을 밀어 넣으십시오.</li>
	<li>대화식 설정 페이지에서이 더 버 터치 스크린을 사용 하 여 실험적 파라미터에 대 한 초기 조건을 설정 합니다. 모든 바이 알에 대해 온도를 30°c로 설정 하 고 10으로 저 어 줍니다. 이것은 모든 바이 알을 선택 하기 위해 터치 스크린에서 손가락을 드래그 하 여 한 번에 모든 유리병에 대해 수행 할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 소프트웨어 구성 및 알고리즘 문화 루틴 프로그래밍
<ol><li>컴퓨터의에도 대시보드 대시보드에서 실험 관리자 페이지로 이동 합니다. 실험 탐색기 패널 또는 기존 실험에서 기본 실험을 시작 점으로 선택 하 고 새로 복제를 클릭 합니다. 참고: 실험 정의가 실험 관리자에 저장 되는 리포지토리에 GitHub 링크를 붙여넣어 다른 그룹의 실험을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>실험이 실행 되는 실험 이름과이에 대 한 장치를 지정 합니다. 페이지에서 이러한 필드를 수정 하 여 원하는 보정 설정을 선택 했는지 확인 합니다.</li>
	<li>바이 알 선택기 및 매개 변수 정의 창을 사용 하 여 실험 조건을 설정 합니다. 예를 들어, 바이 알 0-4의 온도를 30°c로 설정 하려면 바이 알 선택기에서 바이 알을 선택 하 고 매개 변수 정의를 30으로 설정한 후 설정을클릭 합니다. OD에 대해이를 반복 하 여 각 바이 알에 대 한 상한 및 하 한 임계값을 설정 합니다.</li>
	<li>실험적 매개 변수 정의가 완료 되 면 저장 을 클릭 하 여 실험을 저장 하 고 시작 을 클릭 하 여 실행 합니다.</li>
</ol>4. 실시간으로 실험 및 모니터링 시작
<ol><li>실험이 진행 되 면 대화형 대시보드에서 실시간 데이터 패널로 이동 합니다. 각 바이 알에 대해 OD 값이 0으로 유지 되 고 있는지, 그리고 그래프를 탐색 하 여 온도가 프로그래밍 된 수준으로 진행 되는지 확인 합니다.</li>
	<li>접종을 준비 하려면, 하룻밤 배양의 OD를 측정 하 고, 약 25 mL의 바이 알 부피를 가정 하 여 원하는 배 희석을 계산 하 고, 시료 채취 포트를 통해 접종 량을 바이 알에 피 펫 계산 합니다. 예를 들어, OD 2.0에 있는 하룻밤 배양 물에서 약 0.05의 배양 유리 병에서 원하는 시작 OD에 도달 하기 위하여, 세포의 625 μ l는 각 바이 알에 첨가 되어야 한다.</li>
	<li>대시보드에서 그래프를 확인 하 여 그에 따라 OD 그래프가 업데이트 되었는지 확인할 수 있습니다. 원하는 시작 OD 근처에 증가 그래프에서 볼 수 있어야 합니다.</li>
	<li>대시보드에서 해당 그래프를 탐색 하 여 실험 전반에 걸쳐 OD, 온도, 성장률, 세대 및 미디어 사용량과 같은 다양 한 데이터 유형을 추적 합니다. 이러한 값은 사용자 (예: 일정 timepoints)에 의해 실험적 결정을 알리거나 자동화 된 피드백을 수행 하기 위해 함수에 사용 될 수도 있습니다.</li>
	<li>미디어 병 중간 실험을 바꾸려면 실험 관리자 패널에서 실험을 일시 중지 하 여 펌프 이벤트가 발생 하지 않도록 합니다. 빈 병에서 미디어 라인을 빠르게 풀고 새 병에 연결 하십시오. 오염을 방지 하기 위해 튜브의 끝을 만지지 마십시오. 실험 관리자에서 실험을 재개 합니다.</li>
</ol>5 .에이 버 바이 알의 효 모 세포 채취
<ol><li>단백질 합성을 억제 하 고 유 세포 분석을 위해 효 모 세포를 고정 하는 사이클로 헥 이미 드 용액을 준비 한다. 15 mL 원추형 튜브에서, 5 초 동안 12 mL의 PBS 및 12 μ l의 20 mg/mL 사이클로 헥 사 미드와 소용돌이를 추가 합니다.</li>
	<li>멀티 채널 파이 펫을 사용 하 여, 96-웰 라운드 바닥판의 각 웰에 분 취 액 100 μ l.</li>
	<li>판을 알루미늄 호 일에 싸서 빛을 차단 하 고 필요할 때까지 4°c에서 보관 하십시오.</li>
	<li>확장 된 길이 200 μ l 팁을 사용 하 여 바이 알 뚜껑의 샘플링 포트를 통해 파이 펫을 샘플로 추출 합니다.</li>
	<li>100 μ l을 바이 알에서 고정 플레이트에 잘 넣고, 2 ~ 3 배를 파이 펫 팅으로 혼합 한 다음 호 일에 회복 하 고 4 ° c로 플레이트를 돌려줍니다.</li>
</ol>6. 실험 분해 및 정리
<ol><li>대형 비 커에서 1l의 10% 표 백제 및 2 500 mL DI 워터 솔루션을 준비 하십시오.</li>
	<li>실험 관리자 패널에서 stop 명령을 전송 하 여 실험을 중지 합니다. 데이터는 여전히 클라우드 지원 데이터베이스에 저장 되며 대시보드의 실시간 데이터 패널에서 나중에 보거나 오프 라인 분석을 위해 다운로드할 수 있습니다.</li>
	<li>스마트 슬리브에 바이 알을 제거 하 고 오토 클레이 브 랙에 넣어 후속 단계에서 오버플로를 방지 하십시오.</li>
	<li>미디어 병에서 용지 입력 라인을 풀고 10% 표 백제를 비 커에 넣습니다. 라인 및 바이 알을 살 균 하는 설치에서와 같이, 사용자 인터페이스에서 펌프를 실행 합니다.</li>
	<li>디 워터에서 바이 알과 서브 머지 라인에서 라인을 분리 합니다. 펌프를 실행 하 여 모든 표 백제를 시스템에서 먼저 세척 한 다음 공기를 사용 하십시오.</li>
	<li>먼저 12v 전원 공급 장치를 끄고 5 초 동안 기다린 다음 5v 전원 공급 장치를 꺼서에 대 한 기능을 해제 합니다.</li>
	<li>볶음 바와 뚜껑을 10% 표 백제에 담근 다음 디 워터로 헹 궈 주세요. 그들을 통해 DI 물을 실행 하 여 각 캡의 유입 및 불렀습니다 빨 대를 씻어 해야 합니다. 필름이 벽에 형성 되어있는 경우 시험관 브러시를 사용 하 여 튜브를 스크럽.</li>
	<li>폐기물을 적절 하 게 폐기 하 고 폐기 용기를 철저히 헹 굽 니다. 주의: 폐 용기는 10% 표 백제, 살 균 된 세포 배양 폐기물 및 미 량의 에탄올 혼합물을 함유 할 것 이다. 적절 한 취급 및 폐기는 안전 코디네이터에 게 문의 하십시오.</li>
</ol>7. 분수 인구의 유 세포 분석을 이용한 체력 정량화
<ol><li>적절 한 형광 채널 및 검출기 (16)를 구비한 유 세포 측정기를 이용 하 여 섹션 5에서 수집 된 샘플을 분석 한다.</li>
	<li>샘플 당 적어도 1만 이벤트를 획득 하 고 전방 및 측면 산란 데이터를 사용 하 여 온전한 세포를 게이트 합니다.</li>
	<li>적절 한 형광 채널 (예컨대 GFP)에 기초한 게이트는 각 인구의 소수 분포를 결정 한다.</li>
	<li>컴퓨터에서 ' 내보내기 ' 버튼을 클릭 하 여 실험 관리자 페이지에서 원하는 위치에 데이터를 저장 합니다.</li>
	<li>에 대 한 데이터 파일에서 각 바이 알에 대 한 각 timepoint에 의해 완료 된 세대 수를 확인 합니다. 이에 대 한 코드에서 세대는 각 희석 이벤트 사이에 OD 데이터를 먼저 분할 하 여 계산한 다음 각 세그먼트가 각 세그먼트 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> 에 대 한 기본 지 수 인 r, 성장률16에 적합 합니다. 다음 공식을 사용 하 여 기간 동안의 세대 수를 계산 합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>샘플을 촬영 한 시점에서 상기 계산 으로부터의 유동 세포 분석 데이터 대 생성 수 로부터 라벨링 및 비 표지 된 모집단의 로그 비율을 플로팅합니다. 선형 영역을 식별 하 고 다음 방정식에 따라 기울기를 맞춥니다. 이 슬로프는 일반적으로 경쟁력 있는 피트 니스18,19로 정의 됩니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

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저자 인 브랜든 g. 웡와 아마 트에 스 칼 릴은이 기사에서 사용 되는이 볼 리 플랫폼을 개발 하는 Fynch 바이오 사이언스 i n c .의 공동 설립자입니다.

성장 선택은 세포 집단 간의 표현 형 차이를 생성 하 고 특성화 하는 데 광범위 하 게 사용 되는 생물학에서 없어서는 안될 도구입니다. 배치 문화는 제한 된 방법으로 성장 선택을 허용 하지만, 연속 배양 기법은 이러한 실험의 제어 및 예측 가능성을 극적으로 확장 하 고, 선택의 형태와 역학에 대 한 정밀한 조절을 발휘 하 여 반복 가능한 정량적 결과22. 연속 배양은 고 다양성 라이브러리(20,23,24,25)에 대 한 선택을 엄격 하 게 제어 하 고, 복잡 한 적응 체계를 실험적으로 구현 하 고 진화 하는발전11,12,27. 또한 연속 배양은 정량적으로 제어 되는 다양 한 조건에서 세포를 정밀 하 게 특성화 하 여 복잡 한 유전 시스템을 더 잘 이해 하 고 설계 된 생체 생산 균 주를 최적화할 수 있습니다. , 28.
그러나, 선택적인 조건에 미묘한 변경은 생물학 결과에 있는 극적인 변경으로 이끌어 낼 수 있기 때문에 연속적인 문화를 위한 보편적인 프로토콜이없습니다,29,30. 실험 자는 선택 영역 사이에서 선택 하 고 실험적 프로토콜과 장비를 적절 하 게 조정할 수 있어야 합니다. 제어 매개 변수 중에서 선택할 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 시스템은 이상적으로 복잡 한의 상호 작용 입력을 해독 하는 데 필요한 고도의 병렬 실험에서 동시에 여러 매개 변수를 독립적으로 관리 할 수 있을 만큼 정교 합니다. 생물학적 시스템 (예: epistasis). 사용자가 고도로 전문화 된 환경 틈새 시장을 지정 하기 위해 문화 조건 및 유체 함수 간의 피드백 제어를 임의로 프로그래밍할 수 있도록 해 주는이 문제를 해결 합니다.
현재 설정의 한계를 극복 하 고 제어 매개 변수를 확장 하거나 변경 하기 위해 스마트 슬리브는 새로운 센서 또는 액추에이터를 추가 하기 위해 쉽게 재설계 될 수 있습니다. 추가적으로, 유리병 부피를 감소 시키는 것은 연속적인 문화에서 중요 할 수 있는 매체 지출을 감소 시킬 것입니다. 현재 설계는 온도, 배양 교 반, 광 유도, 탁도 및 유체 역학의 측정 및 제어를 허용 하지만 다른 매개 변수는 바이 알에서 샘플링 하 여 외부적으로 측정 해야 합니다. 현재 작업에는 루시퍼 라 제를 통해 효소 활성을 모니터링 하 고, 용 존 산소와 pH를 직접에 비에이 터로 조절 하는 기능이 포함 되어 있습니다. 또한,이 작품에서 설명 하지는 않았지만,에 비에 스는 새로운 millifluidic 다중화 장치 (16 )와의 인터페이스를 통해 대규모 통합 (전자에서 유래 하 고 마이크로 fluidics에 의해 채택)의 원칙을 도출 하 여 저렴 한 방식으로 더 복잡 한 유체 처리 가능 (예: 다중화 된 유체 입력, 바이 알 유리병 전송). 이러한 웨어 모듈은 실험실에서 완벽 하 게 설계 및 제조 될 수 있으므로 사용자는 자동화 된 유체 루틴에서 프로그래밍 방식으로 다양 한 밸브 조합을 구현 하 여 유체의 경로를 조정 합니다. 이를 통해 사용자는 전통적으로 지속적인 문화에 사용 되는 견고한 유체 설계를 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 비용이 많이 드는 제어 요소 (예: 연동 펌프)를 사용 하 여 높은 처리량으로 유체 기능을 확장할 수도 있습니다. 마지막으로, 우리는 샘플링 문화가 복잡 한 더 길고 큰 실험 동안 수동 상호 작용의 한계를 극복, 이러한 밀리 유체 및 DIY 구성 요소를 활용 하는 자동 샘플링 플랫폼을 통합 하기를 바라고 있다.
플랫폼을 물리적으로 수정 하는 것 외에도 웹 기반 소프트웨어는 사용자가 사용자 정의를 작성, 편집 및 공유할 수 있도록 하 여 완전히 자동화 된 피드백 지원 문화 프로그램 (예: turbidostat)을 생성 하 여 새로운 자유도를 엽니다. 사용자는 동일한 선택 체계에서 미묘한 변형으로 매개 변수 범위를 프로그래밍 방식으로 스윕 하거나, 새로운 조합의 제어 알고리즘을 연결 하 여 원하는 수의 정교한 선택 구성표를 지정할 수 있습니다. 더욱이, 실시간으로 쉽게 배양을 모니터링 하는 능력은 실험이 수행 되는 방식을 변형 한다. 실시간 모니터링을 통해 사용자는 1) 실행 간의 일관성을 확인 하 고, 생물 생산 응용 분야의 중요 한 기능과 높은 처리량 실험을 수행 하 고, 필요한 경우 실험 중에 개입 하 여 발생 하는 도전적인 균 주를 해결할 수 있습니다. 성장 또는 생물 막 형성이 불량 하거나 사용자 오류 (예: 오염)를 진단 합니다. 마지막으로, 여러 데이터 스트림이 각 개별 문화권에 대해 실시간으로 수집 되 고 해석 되 면,이에 버 버는 고밀도의 데이터를 생성 하 여 새로운 다운스트림 분석을 위한 기계 학습 접근법을 촉진할 수 있습니다.
적합성 특성화, 라이브러리 선택 및 실험실 진화에 대 한 입증 된 용도 외에도, 우리는 통합 된 fluidics를 사용 하 여이 볼에 구현 하기 위해 잘 익은 관련 필드의 수를 봅니다. 미 생물군 유 전체 시료 실험을 통해 통제 된 환경에서 지역사회의 안정성을 분석 할 수 있습니다.31,32, 컬쳐로 마이크 기법을 사용 하 여 마이크로 바이오 타 조성33, 또는 동적으로 종을 혼합 하 여 식민지의 생태 역학을 심문 또는 침략34,35. 생체 분자의 연속 된 진화를 위한 수많은 방법 들이 장치 뿐만 아니라26,36,37에 쉽게 구현 될 수 있어 이러한 시스템의 접근성 및 처리량이 크게 향상 되었습니다. 동적이 고 높은 처리량의 자연에서 미디어 구성, 온도 및 긴장과 같은 성장 조건을 최적화 하는 능력은 산업 바이오 제조 응용 분야에 최적화 노력을 기울일 수 있습니다9. 우리는 또한 단일 세포와 인구 모두에서 세포 배양의 성장과 분석을 위한 완전 자동화 된 시스템을 제공 하는 폐 회로 방식으로 현미경 및 유 세포 분석기와 같은 다른 분석 기법과 수직적 통합을 구상 하 고 있습니다. 수준. 더욱이, 용기를 밀봉 하 고 가스 함량을 조절 하는 것과 같은 스마트 슬리브에 대 한 일부 하드웨어 수정으로,에이 볼은 잠재적으로 현 탁 포유류 세포와 같은 광범위 한 세포 유형의 성장을 지원 하도록 적응 될 수 있었다. 또한 혐 기성 세포 배양을 위한 혐 기성 챔버에 전체 프레임 워크를 배치 하는 것이 가능 하다. 앞으로는 중앙 집중식 클라우드 인프라로 소프트웨어 프레임 워크를 구축 하는 것을 목표로 하 고 있으며,이를 통해 사용자는 실험실에 물리적으로 존재할 필요 없이 데이터를 원격으로 쉽게 구성, 분석 및 공유할 수 있습니다. 데이터 큐레이터의 역할을 하는 클라우드 인프라는 실험에 대 한 대규모 메타 분석에도 큰 도움을 줄 것입니다. 지속적인 문화에서 자동화와 혁신을 촉진 하 여 가능한 성장 선택 실험의 범위를 크게 확대할 것으로 예상 됩니다.

연속 세포 배양 기술은 거의 70 년 전에 처음 개발 된1,2는 최근 부흥3,4를 즐기고 있다. 이것은 요인의 합류 때문 이다. 첫째, 다량의 유전형을 판독 하 고 생성 하는 것을 가능 하 게 하는 고 처리량-omics 기법 개발은5,6,이를 촉진 하는 실험적 기술에 대 한 수반 되는 수요를 창출 잘 제어 된 세포 성장과 표현 형. 이를 위해, 지속적인 문화는 응급 게놈 진보를 활용 하는 강력한 실험적 접근법을 나타낸다. 지속적인 배양은 정밀 하 게 제어 되는 (그리고 동적인) 환경 조건에서 세포 집단에 대 한 성장 선택/실험을 촉진 함으로써, 유전자 형을 표현 형7,8에 엄격 하 게 매핑할 수 있는 수단을 제공 합니다. 정량적으로 엔지니어링 된 균 주와 유기 체9를 특성화 하 고 실험실의 진화 연구10,11,12에서 적응형 유전 변화를 추적 합니다.
두 번째로, 적 층 제조 및 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어 요소와 같은 접근 가능한 프로토타이핑 기술의 출현으로 광범위 한 사용자 들이 자체 비용 효율적인 형태의 연속 배양 시스템을 설계 하 고 구축할 수 있게 되었습니다. 실험실에서 직접. 이 모든 것은 화학 능력13, turbidostat14또는 morbidostat15와 같은 연속적인 문화 기능을 수행 하는 DIY 장치 들로 구성 된 흥미로운 배열을 이끌었습니다. 불행히도 설계 된 특정 (틈새) 문제를 해결 하는 데 성공 했지만 이러한 임시 솔루션은 일반적으로 처리량 및/또는 실험적 설계의 복잡성을 확장 하는 기능이 부족 합니다.
이 볼 시스템은 지속적인 문화의 증가 하는 실험적 요구를 수용할 수 있는 단일 플랫폼을 구축 하 고, 응급 게놈 기술16 (그림 1a)의 속도와 규모를 일치 시킬 목적으로 설계 되었습니다. 에 버 버의 설계는 표준화 된 풋프린트, 모듈식 구성품 및 오픈 소스설계 원칙을 포함 하 여 다른 분야의 고도로 확장 가능한 기술에 기초 하는 공통 텐서를 구현 합니다. 따라서 새로운 틈새 애플리케이션을 위한 솔루션은 시스템을 크게 수정 하지 않고도 설계할 수 있습니다. 고도로 모듈화 된 오픈 소스 웨어, 하드웨어, 전자 및 웹 기반 소프트웨어로 구성 된이 볼 브는 비용 효율적이 고 쉽게 재구성 될 수 있는 최초의 자동 연속 배양 시스템으로, 사실상 모든 유형의 높은 처리량의 성장 실험. 각 문화권을 제어 하는 데 필요한 모든 센서와 액추에이터를 제공 하는 모듈형의 프로그래밍 가능 스마트 슬리브를 통해,에이 더 스는 처리량과 개별 배양 조건의 제어를 모두 확장할 수 있습니다. 또한 웹 기반 플랫폼으로 서, 데이터와 정보를 원격 컴퓨터와 실시간으로 교환 하 여 수백 개의 개별 문화를 동시에 모니터링 하 고 임의로 정의 된 제어를 통해 자동화 된 문화 섭 동을 허용 합니다. 알고리즘.
이전 작업16에서,에 버 버의 강력한 성능은 장기간의 작동에 대 한 장기적인 실험에서 입증 되었으며, 대장균 및 s. 소 뇌 에서 다양 한 유기 체 를 육성 할 수 있는 능력을 증명 했습니다. 미생물. 일련의 뚜렷한 성장 선택 실험이 수행 되었고, 여기서 프로그래밍 방식으로 정의 된 다차원 선택 구배는 개별적인 배양 조건의 배열에 걸쳐 적용 되었고, 그 결과 셀룰러 피트 니스 풍경은 정량. 여기서 목표는 시스템을 설계 하는 데 사용 하는 방법에 대 한 설명과 이러한 유형의 실험을 제공 하는 것입니다. 예시 적인 예로서, 온도 및 삼투성 스트레스로 구성 된 2 차원 환경 구배에 걸친 s. 세레 비시 돌연변이 체의 피트 니스 지형을 정량화 하는 방법이 제시 된다. 이 프로토콜은 소프트웨어를 사용 하 여 16 개의 병렬 연속 배양 각각에 대 한 사용자 정의 된 탁도 및 온도 제어 루틴을 설정 하 고 물리적으로,이 실험에 대 한이 시험에 대 한 사용자를 구성 하는 과정을 안내 합니다. 유체 레이아웃을 통해 다른 염 농도의 매개체를 적절 하 게 라우팅합니다. 이 프로토콜은 다양 한 연구와 분야에 대 한 다양 한 자동화 된 연속 배양 실험을 실행 하기 위해에 버 버를 구성 하는 일반적인 루 브릭 역할을 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>캡이 있는 5갤런 플라스틱 헤드팩</td><td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td><td>45-56Y8-E2FR</td><td>폐기물 수거용</td></tr><tr><td>A-D(+)-Glucose</td><td>Chem-Impex</td><td>00805</td><td>YPD용</td></tr><tr><td>매체 Attune NxT Autosampler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td>는 <td>유세포 분석기가 96 웰 플레이트에서 샘플을 실행할 수 있도록 합니다</td></tr>. <tr><td>Attune NxT 유세포 분석기</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>단일 세포 형광을 통해 인구 분획을 결정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-0</td><td>YPD 매체</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648250</td><td>YPD 매체</td></tr><tr><td>화학물질 저항성 가시 튜브 피팅 티 커넥터, 1/8" 튜브 ID, 250°C; F 최대 온도</td><td>McMaster- Carr</td><td>5121K731</td><td>미디어 입력 분기용</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>YPD 용 매체</td></tr><tr><td>CLOROX 살균 표백제 8.25</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td>유체 라인 살균용</td></tr><tr><td>맞춤형 eVOLVER 바이알 뚜껑</td><td>FynchBio</td><td></td><td>뚜껑에는 샘플링 및 유체 입력/출력</td></tr><tr><td>용 포트가 있습니다.Cycloheximide</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10018301</td><td>유세포 분석 샘플링 플레이트용</td></tr><tr><td>에탄올, 무수(조직학적)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td><td>유체 라인 멸균용</td></tr><tr><td>eVOLVER Unit</td><td>FynchBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 확장 길이 팁(리프트 오프 랙, 1 to 200 ul)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-420</td><td>바이알 샘플링용</td></tr><tr><td>Fisherbrand 팔각형 스핀바 자기 교반 바</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57</td><td>직경: 4.5 mm, 길이, 12 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand 재사용 가능한 유리 미디어 병 캡 포함</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB8002000</td><td>튜브가 장착되어 있어야 합니다</td></tr>. <tr><td>고온 실리콘 고무 튜빙 Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD</td><td>McMaster- Carr</td><td>51135K73</td><td>미디어 병</td></tr><tr><td>Mac용 Mini</td><td>Apple</td><td></td><td>실험 실행/데이터 수집용</td></tr><tr><td>PBS(Phosphate Buffered Saline)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP243820</td><td>유세포 분석 샘플링 플레이트용</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, 플러그, 1/16" Barbed Tube ID용, 폴리프로필렌</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K141</td><td>미디어 병용</td></tr><tr><td>플라스틱 퀵-턴 튜브 커플링, 플러그, 5/32" 바베드 튜브 ID용, 폴리프로필렌</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K144</td><td>미디어 병용</td></tr><tr><td>플라스틱 퀵-턴 튜브 커플링, 소켓, 1/16" 바베드 튜브 ID용, 폴리프로필렌</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K291</td><td>미디어 병용</td></tr><tr><td>플라스틱 퀵-턴 튜브 커플링, 소켓, 5/32" 바베드 튜브 ID용, 폴리프로필렌</td><td>McMaster- Carr</td><td>51525K294</td><td>미디어용 병</td></tr><tr><td>나사 캡, 오픈 탑, PTFE 표면 실리콘 SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. 나사산 크기: 24-400, GREEN</td><td>Chemglass</td><td>CG-4910-04</td><td>배양 바이알</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fsher Scientific</td><td>S271-3</td><td>YPD 매체용</td></tr><tr><td>SpectraMax M5 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td>야간 세포 배양의 OD600 측정용</td></tr><tr><td>바이알 전용, 샘플, 40mL, 투명, 28mm x95mm, GPI 24-400</td><td>Chemglass</td><td>CG-4902-08</td><td>배양 바이알</td></tr><tr><td>YPD 매체용</td> <td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td></tr></tbody></table>

에 버 버를 사용 하 여 자동화 된 고 처리량, 지속적인 세포 성장 실험 설계

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

연속 배양 법은 세포가 정량적으로 제어 되는 환경 조건 하에서 성장할 수 있도록 하며,이에 따라 체력 표현 형을 측정 하 고 선택에 의해 유전형이 형성 되는 방식에 대 한 이해를 향상 시키는 데 광범위 하 게 유용 합니다. 틈새 연속 배양 장치를 개발 하 고 적용 하기 위한 광범위 한 최근의 노력은 새로운 형태의 세포 배양 제어를 수행 하는 장점을 밝혔다. 여기에는 장기적인 실험적 진화에서 게놈 전체 라이브러리 선택 및 합성 유전자 회로 특성화에 이르는 연구에 대 한 맞춤형 선택 압력 정의 및 처리량 증가 등이 포함 됩니다. 이 증가 하는 수요를 충족 하기 위해 향상 된 확장성, 유연성 및 자동화를 제공 하는 지속적인 문화 플랫폼을 개발 했습니다. 에 볼 브는 다양 한 유형의 고 처리량 또는 다차원 성장 선택 실험을 수행 하기 위해 최소한의 노력으로 (재) 구성 하 고 확장할 수 있는 단일 표준화 플랫폼을 제공 합니다. 여기서, 사용자에 게는 사용자가 대규모의 연속 성장 실험을 수행 하도록 시스템을 구성 하는 방법을 설명 하는에이 볼 프레임 워크를 제공 하는 프로토콜이 제시 된다. 특히,이 프로토콜은 사용자가 시스템을 프로그래밍 하는 방법에 대해 안내 하 여, 온도와 오 스몰 농도 같은 두 가지 선택 압력을 멀티플렉스 ( 사 카로 마 세레 비시 돌연변이의 피트 니스 풍경을 정량화 하기 위해 많은이에 대 한 바이 알에 걸쳐) 해상도. 유체 및 하드웨어 레이아웃을 배열 하 여 프로그래밍 방식으로, 오픈 소스 웹 기반 소프트웨어를 통해, 물리적으로 장치를 구성 하는 방법을 보여 줍니다. 물리적으로 디바이스를 설정 하 고, 배양 루틴을 프로그래밍 하 고, 인터넷을 통해 실시간으로 실험을 모니터링 하 고 상호 작용 하 고, 후속 오프 라인 분석을 위한 바이 알을 샘플링 하 고, 실험 후 데이터 분석을 자세히 설명 하는 프로세스입니다. 이는 생물학 시스템을 연구 하 고 조작 하기 위해 복잡 하 고 높은 처리량의 세포 성장 실험을 설계 하는 데 있어 다양 한 분야의 연구원 들이이를 시작 점으로 사용할 것입니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 온도와 염도의 2 차원 응력 구배에 걸쳐 s. 세레 비시 의 유전 변종에 대 한 피트 니스 맵을 구성 하는 데 사용 되었습니다. 구체적으로, 각각의 변형 균 주에 대해, 우리는 16 개의 다른에 있는 형광 표지 된 기준 균 주 (통합 된 헌법 M신생아 그린 리포터와 BY4741)에 대 한 쌍별 경쟁 실험을 수행 하기 위해 사용 이러한 응력의 조합 (그림 1). 변이체의 경우, 2 개의 녹아웃 균 주가 응력 조건 축 중 하나에 민감 하다 고 예측 되는 각각의 것을 선택 하였으며, 높은 온도에서의 피트 니스 불량을 가지고 있는 것으로 보고 된 δ prx1 및 고 적합성 결함을 가진 δ p s 2 염 농도21. 제어 변형으로 서, 라벨이 없는 야생 형 BY4741 스트레인이 사용 되었으며, 레퍼런스 스트레인과 유사 하 게 수행 될 것으로 예상 된다. 전체적으로, 이러한 3 72 시간 경쟁 실험은 한 대의 컴퓨터에서 모두 실행 되는 세 가지에이 버 (16 개 바이 알) 장치에 걸쳐 48 바이 알에서 동시에 진행 되었습니다.
각 실험 중에 생성 되는 대량의 데이터를 탐색 하는 데 사용할 수 있는 대화식 대시보드가 제공 됩니다 (그림 2a). 도 2b에는 단일이 볼 디바이스의 16 개 바이 알 모두에 걸친 대표적인 OD 트레이스 들이 도시 되어 있다. 각 트레이스는 OD에 대 한 피드백을 사용 하 여 희석을 트리거하고 좁은 밀도 범위 (이 경우 0.2-0.3)에서 배양을 유지 하는 turbidostat 제어 알고리즘에서 특징적인 톱니 패턴을 표시 합니다. OD 및 온도 데이터는 지속적으로 측정 되 고, 클라우드 지원 데이터베이스로 스트리밍되고, 실시간으로 업데이트 됩니다. 지속적으로 스트리밍되는 데이터에서 상위 지표 (예: 성장률, 누적 세대)를 계산 하 여 대시보드 (그림 2c)에 표시 하 고 다른 선택 체계 (예: morbidostat)에서 피드백 파라미터로 사용할 수도 있습니다.
피트 니스 맵을 생성 하기 위해, 우리는 참조 변형이 유 세포 분석기 측정과에이 지 성장 데이터를 모두 통합 하 여 변형 변형 률과 경쟁 하는 속도를 측정 합니다. 특히, 인구 분 획은 각 timepoint 샘플의 유 세포 분석 데이터를 사용 하 여 참조 변형 률에 대 한 변형 변형의 로그 비율로 계산 됩니다. 각 문화권 및 시간 지점에 대 한 세대의 경과 된 수는 각 희석 기간에 대 한 증가 속도 데이터에서 보간됩니다. 세대에 대 한 로그 비율을 플로팅하 면 조건 간의 질적 차이가 나타나기 시작 합니다 (그림 3a). 피트 니스를 계산 하기 위해 기울기는 변형 변형이 참조 스트레인과 경쟁 하는 방식을 설명 하는 정량적 체력 값 (부호 및 비율 모두 포함)을 산출 하는 각 구획18의 선형 부분을 통해 맞습니다 ( 도 3B). 이 실험에서 음수 피트 니스 값은 변형 변형이 참조 변형에 의해 능가 된다는 것을 나타냅니다. 모든 피트 니스 계산에서 히트 맵을 구성 하는 것은 2 차원 피트 니스 풍경의 시각화를 가능 하 게 하 여 스트레인과 조건 사이의 성능에 미묘한 정량적 차이를 드러냅니다 (그림 3c).
피트 니스 히트 맵에서는 각 변형 변형이 다양 한 방식으로 나타나는 피트 니스 결함을 나타내는 것을 볼 수 있습니다. Δ Prx1 은 높은 온도에 주로 민감 하지만, 소금 스트레스는 체력 결함을 증가, 첨가제 효과를가지고 나타납니다. 반대로, δ Pbs2 는 온도 축을 따라 최소한의 차이로 높은 염 농도에 반응 하 여 주로 피트 니스 결함을 나타낸다. 이러한 결과는 특히 여러 환경 스트레스 요인의 상호 작용을 해독 하기 위한 고해상도 선택 실험의 효용을 강조 합니다,이는 첨가제를 가질 수 있는, 시너지, 또는에 피 착 효과.
마지막으로, 어떤 경우에는, 특히 심한 스트레스 조건에 대 한 피트 니스 계산은 과장 되거나 왜곡 된 결과를 초래할 수 있다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 예를 들어, δ Pbs2 는 기준 스트레인에 대하여 39 ° c/1 M 염화 나트륨 조건에서 가파른 양의 기울기를 나타내는 것으로 나타난다 (도 3a). 이것은 야생 유형 데이터에 반영 되 고이 조건에서이 특정 메트릭의 유틸리티를 제한 하는 두 변형의 가난한 성장에 기인 합니다. 세대 수가 부족 하면 1) 지연 단계에서 발생 하는 확률 효과에 대 한 민감도 및 경사 피팅을 방해 하는 timepoints의 불량 한 분리가 초래 됩니다. 우리는이 연구에서 그렇게 하기로 선택 하지 않았지만, 실험 중에에 볼에 의해 수집 된 실시간 성장 데이터는 실험을 확장 하 고 약간의 노력으로이 조건에 대 한 추가 timepoints를 수집 하는 결정을 알리기 위해 사용 되었을 수 있습니다. 후속 실험에서, 시작 비율은 또한 포화가 발생 하기 전에 선형 영역의 길이를 확장 하도록 변조 될 수 있습니다.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> 그림 1:이 더 보기 프레임 워크 및 실험 설계 개요 (A)에 버 버는 배양 조건의 멀티 파라미터 제어가 가능 하도록 하는 자동화 된 연속 배양 플랫폼입니다. 이 플랫폼은 문화 조건을 제어 하는 센서와 액추에이터, 문화를 들어오고 나가는 미디어 및 폐기물을 위한 연동 식 펌프 어레이, 장치와 수동으로 상호 작용 하는 터치 스크린, 컴퓨터와 같은 스마트 슬리브로 구성 되어 있습니다. 플랫폼의 데이터가 스트리밍되는 클라우드 인프라와 상호 작용 하는 데 사용 됩니다. (B)는 다양 한 방법으로 구성 될 수 있다: 물리적으로, 셀 및 미디어 입력을 통해, 그리고 프로그래밍 방식으로 스마트 소매 배양 유리 병 모듈을 제어 하는 알고리즘을 조정. 이는 정의 된 시점에서 물리적으로 수집 된 셀 들로 구성 된 출력과 배양 데이터의 실시간 스트리밍을 통해 고해상도에서 다차원 선택/환경 구배를 프로그래밍 하는데 활용 될 수 있다. (C) 온도 및 삼투성 응력으로 구성 된 2 차원 선택 그라데이션에 걸쳐 성장 적합성 실험을 수행 하기 위해이 볼 버를 구성 합니다. 에 대 한 배양 바이 알은 참조 및 변형 효 모 균 주의 동등한 비율로 시드 되었다. Turbidostat 루틴은 정의 된 OD 창에서 지 수 위상의 모든 문화권을 유지 하도록 프로그래밍 되었습니다 (OD 0.2-0.3). 온도 및 매체 조건은 두 개의 독립적인 응력 구배를 형성 하기 위해 스마트 슬리브 어레이 전반에 걸쳐 변화 되었다. 기본 배지는 세균 오염에 대 한 예방 조치로 서 YPD (2% 글루코스) + 100 µ의 카 르 베 실린 + 25 µ의 클로 람 페니 콜로 구성 되었다. 배지 조성 물은 0 M, 0.6, 0.8 m 또는 1.0 M에 보충 염화 나트륨을 첨가 하 여 다양 하였다. 바이 알 온도는 30°c, 35 ° c, 37 ° c 또는 39 ° c의 4 가지 값 중 하나로 프로그래밍 되었다. (D) 3 개의 시험 된 조건에서 문화 OD 및 집단 분 획을 위한 원시 산출의 예. 경쟁 실험은 72 h를 유지 하였으며, 24 시간에 샘플링 하 여 실험을 마칠 때까지 12 시간 마다 연속적으로 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> 그림 2:에 버 버 실시간 데이터 분석 대시 보드. (A)에이 지 데이터는 클라우드 기반 소프트웨어를 통해 실시간으로 처리 되 고 스트리밍되어 대화형 대시보드로 제공 됩니다. 대시보드를 통해 사용자는 연결 된 컴퓨터에서 자신의 문화권 루틴을 정의 및 시작 하 고, 모든이 볼 버 장치에서 현재 실행 중인 실험을 모니터링 하 고, 필요한 경우 개별 유리병 또는 바이 알 세트에서 실험 조건을 수동으로 다양 하 게 변경할 수 있습니다. (B) 전체 실험 기간 동안 테스트 된 조건의 매트릭스에 걸쳐 각 바이 알에 대 한 OD 트레이스. 추적은 실시간으로 볼 수 있으므로 실험이 원하는 대로 실행 되 고 추가 분석을 위해 실험 후에 사용 됩니다. (C) 성장 속도 및 세포 세대는 실험 진행 상황을 추적 하기 위해 즉석에서 OD 트레이스 로부터 계산 될 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> 그림 3: 피트 니스 표면의 건설. (A) 셀 모집단은 셀 세대에 대해 플롯 된 자연 로그 (변형 변형/참조 변형)입니다. 색상은 선택의 온도를 나타내며 대시는 염 농도를 구분 합니다. (B) 상기 기준 균 주에 대 한 변이체의 상대적인 적합성을 정량화 하기 위해, 피트 니스 메트릭은 세대에 걸쳐 세포 집단 분 율이 변화 하는 속도 로부터 도출 된다. 이 메트릭은 최소 3 개의 점을 사용 하 여 셀룰러 분수 플롯의 선형 영역에서 계산 됩니다. (C) 환경 스트레스 그라데이션에 대 한 피트 니스 표면을 구성 하기 위해 히트 맵에 상대적인 피트 니스 지표가 표시 됩니다. 야생 형 및 δ Pbs2 에 대 한 우측 상단 조건 (39 ° c/1.0 염화 나트륨)은 배양이 불충분 한 세대를 통과 함에 따라이 분석에 포함 되지 않는다 (대표 결과 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 더에이 버 프레임 워크는 실험적 파라미터에 대 한 높은 분해능과 동적 제어를 통해 고 처리량의 지속적인 미생물 배양을 가능 하 게 합니다. 이 프로토콜은 복잡 한 피트 니스 실험을 수행 하기 위해 시스템을 적용 하는 방법을 보여 주며, 사용자가 여러 개별 문화권에 대 한 자동화 된 제어를 프로그래밍 하 고, 측정 하 고, 수집 하 고, 실시간으로 실험 데이터와 상호 작용 하는 방법을 안내 합니다.

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER는 연구원에게 실험적 자유, 여러 매개 변수에 대한 자동화된 피드백으로 자신의 문화 성장 실험을 정의하고 필요한 크기로 확장할 수 있는 기능을 제공합니다. eVOLVER는 다른 장치보다 더 유연합니다. 사용자는 각 문화권에 대한 센서를 보유한 스마트 슬리브를 수정하여 Python과 하드웨어에서 소프트웨어를 쉽게 사용자 정의할 수 있습니다.시스템은 여러 구성 요소와 연결로 언뜻 보기에 복잡해 보일 수 있습니다. 시각적 가이드는 처음 사용자가 스스로 실험을 실행하는 데 더 많은 자신감을 제공합니다. 적절한 설정은 매우 중요합니다.각 구성 요소가 수행하는 작업을 이해해야 합니다. 그래서 당신은 그들이 작동하는지 확인할 수 있습니다. 모든 것이 올바르게 라우팅되고 긴밀하게 연결되어 있는지 확인합니다.다양한 조건에서 박테리아와 효모의 호기성 배양을 위해 설계된 동안, eVOLVER는 또한 혐기성 발효 또는 현탁액에 있는 포유류 세포를 유지하기 위하여 수정될 수 있었습니다. 이 비디오는 eVOLVER 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 연속 문화 실험을 설정, 초기화 및 실행하는 방법을 보여줍니다. 실험 전날 원고에 따라 미디어, 바이알 및 접종을 준비합니다.3개의 큰 비커에서 10%의 부커 2개와 70%에탄올의 비커 1개를 준비합니다. eVOLVER 장치의 스위치를 사용하여 eVOLVER의 5볼트 전원 공급 장치를 켜고 5초 동안 기다린 다음 12볼트 전원 공급 장치를 켭니다. 동일한 미디어 병에서 여러 개의 바이알을 실행하는 경우 튜브 스플리터와 여러 미디어 입력 라인을 연결합니다.사용자 정의 튜브 스플리터는 낮은 구성 요소로 구성 할 수 있습니다. 제1 표백제 비커와 두 번째 표백제 비커의 미디어 유출 선에 미디어 입력 라인을 잠급합니다. 미디어 입력 라인의 다운스트림 끝을 eflux 선과 두 번째 비커에 연결합니다.폐기물 라인을 폐기물 카보이에 넣습니다. 실험 중에 생성된 폐기물을 소독하기 위해 1~2리터의 표백제를 폐카보이에 넣습니다. eVOLVER의 터치스크린을 사용하여 설정 섹션으로 이동하여 모든 펌프를 20초 동안 실행하여 유체 라인을 10% 표백제로 채웁니다.표백제가 적어도 30분 동안 선에 앉아 살균할 수 있도록 허용하십시오. 라인이 더 이상 침수되지 않고 라인을 통해 공기를 밀어 가능한 한 많은 표백제를 얻을 때까지 터치 스크린을 사용하여 펌프를 다시 실행합니다. 에탄올 비커에 미디어 입력 라인을 배치, 에탄올로 라인을 채우기, 공기로 플러시.그런 다음 미디어 입력 라인을 낮은 커넥터로 미디어 병에 부착하고 미디어가 잔류 에탄올을 플러시하는 라인을 완전히 통과할 때까지 펌프를 실행합니다. eVOLVER 스마트 슬리브에 멸균 된 바이알을 부분적으로 삽입하고 색상 코딩에 따라 긴 유출 밀짚에 짧은 유입 빨대 및 폐기물 라인에 입력 라인을 연결합니다. eVOLVER 터치스크린을 조정하여 모든 펌프를 10초 단위로 실행하여 바이알을 미디어로 채웁니다.육안으로 검사하여 eflux 펌프는 유출을 방지하기 위해 eflux 빨대를 통해 미디어를 효율적으로 제거합니다. 그런 다음 스마트 슬리브에 의해 완전히 감싸될 때까지 바이알을 아래로 밀어 넣습니다. eVOLVER 터치스크린 대화형 설정 페이지에서 터치스크린을 가로질러 손가락을 드래그하거나 모든 선택 버튼을 눌러 모든 바이알을 선택하고 온도의 초기 조건을 섭씨 30도에서 설정하고 저어는 10도로 설정합니다.컴퓨터에서 실험이 실행될 eVOLVER 장치를 지정합니다. 원하는 교정 설정이 선택되었는지 확인합니다. eVOLVER 대시보드를 열고 실험 관리자 페이지로 이동합니다.실험 탐색기 패널또는 기존 실험에서 기본 실험을 시작점으로 선택하고 복제본을 클릭합니다. 실험 편집기 페이지로 이동합니다. 바이알 선택기 및 매개 변수 정의 패널을 사용하여 온도를 섭씨 30도로 조정하고 실험 설계에 따라 각 바이알에 대한 OD의 상하 임계값을 설정합니다.저장을 클릭하여 실험을 저장합니다. 그런 다음 화살표를 클릭하여 실험 관리자 페이지로 돌아가서 실행하려면 재생 버튼을 클릭합니다. 실험이 진행되면 대화형 대시보드의 실시간 데이터 패널로 이동합니다.각 바이알에 대해 OD 값이 0으로 유지되고 있는지 확인합니다. 온도 그래프를 탐색하여 온도가 섭씨 30도로 진행되고 있는지 확인합니다. 접종을 준비하기 위해 먼저 야간 배양의 OD를 측정하고 25 밀리리터의 바이알 부피와 원하는 시작 OD를 약 0.05로 가정하여 야간 문화에 대한 원하는 전체 희석을 계산합니다.샘플링 포트를 통해, 피펫은 이노큘럼의 계산된 부피 또는 이노쿨라의 혼합물을 계산한다. 대시보드의 그래프를 확인하여 OD가 0.05로 증가하고 있는지 확인합니다. 세포 성장 및 유리병 조건실험이 진행 중이기 때문에 실시간으로 모니터링할 수 있으므로 문제가 발생하면 연구원이 개입할 수 있습니다.eVOLVER는 문화 조건의 다중 매개 변수 제어를 허용하는 자동화 된 연속 문화 플랫폼입니다. eVOLVER 성장률 데이터에서 보간된 세대에 대해 로그 비율이 플롯되었을 때 야생 유형, 온도 민감성 및 소금에 민감한 그룹 간에 질적 차이가 나타났습니다. 색상은 선택 온도를 나타내며 대시는 소금 농도를 구별합니다.최소 3점을 사용하여 각 플롯의 선형 부분을 통과하는 경사면은 변형 변형 변형이 참조 변형 변형과 경쟁하는 방식을 설명하는 정량적 피트니스 값을 산출합니다. 음수 피트니스 값은 변형 균주가 참조 변형 스트레인에 의해 경쟁되지 않는 것을 나타냅니다. 항상 모든 펌프가 효율적으로 실행되고 유체 선이 나막신이 없는지 항상 확인합니다.오버플로는 실험을 망치고 스마트 슬리브를 손상시킬 수 있습니다. eVOLVER에서 채취한 샘플은 실험의 결과로 게놈 변경을 확인하기 위해 이후에 시퀀스될 수 있다. 이 정보는 새로운 균주 또는 시스템을 엔지니어링하는 데 사용할 수 있습니다.실험실 진화 또는 라이브러리 선택을 사용하는 연구원의 경우 각 eVOLVER 실험에서 고유한 선택 압력을 쉽게 적용할 수 있습니다. 피드백 제어 및 동적 환경도 이제 매우 액세스할 수 있습니다. 폐기물 카보이는 실험 후 소량의 표백제와 에탄올을 함유할 것입니다.적절한 폐기물 처리를 위해 실험실 안전 코디네이터에게 문의하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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