Name: 장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 배우세요 다층 미세유체 장치를 이용한 장기간 무세포 유전자 발현 기술을. PDMS 기반 플랫폼으로 GFP 발현을 자동화하고 정밀하게 제어하여 합성생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 유럽 연구위원회에 의해 지원되었다, ERC (프로젝트 n. 677313 BioCircuit) 과학 연구를위한 네덜란드 기구에서 NWO-VIDI 교부금 (NWO, 723.016.003), 교육부에서 자금 지원, 문화 및 과학 (중력) 프로그램, 024.001.035 & 024.003.013), 인간 프론티어 과학 프로그램 그랜트 RGP0032/2015, 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 그랜트 723106, 스위스 국립 과학 재단 보조금 200021_182019.

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

PDMS 기반 다층 미세 유체 장치가 제시되었으며, 오랜 시간 동안 IVTT 반응을 유지하는 능력이 입증되었습니다. 이 특정 예제에 적합하지만 이 기술은 다른 수많은 응용 프로그램에 사용될 수 있습니다. 유체 흐름에 대한 추가 제어 - (by) 제품을 제거하는 동안 지속적으로 반응 시약을 보충할 수있는 능력과 결합 - 연속 합성 반응, 다양한 동적 행동의 조사 및 동시 단일 반응의 여러 변형의 전도.
PDMS 기반 장치의 비교적 간단한 제작 과정에도 불구하고, 이의 사용은 광범위한 하드웨어 설정이 필요합니다. 밸브 어레이, 압력 조절기, 압력 펌프, 인큐베이터 및 냉각 장치로 구성된 제작에서 사용으로의 전환은 기본이 아니며 상당한 초기 투자가 필요합니다. 또한 이러한 장치로 성공적인 실험을 일관되게 설정하고 수행할 수 있는 능력은 상당한 시간 투자가 필요합니다. 이 원고가 해결하는 것을 목표로하는 지점입니다. 그러나 일단 제자리에 있으면 전체 설정을 다양한 용도로 수정할 수 있습니다. 또한 하드웨어 설정은 수많은 모듈식 요소로 구성되며, 각 요소는 보다 복잡한 미세 유체 장치 설계를 사용할 수 있도록 확장할 수 있습니다. 또한, 모듈식 설계를 통해 하드웨어 구성요소를 유사하게 작동하는 대안으로 교체할 수 있으며, 이러한 대안은 사용자가 여기에 설명된 특정 설정에 한정되지 않도록하는 48,49.
개별 장치 간의 가변성 및 외부 조건(예: 압력 변동)에서는 이러한 장치를 사용하여 실험을 수행할 때 부정확성이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 각 실험 전에 시스템 교정을 수행하여 각 반응기마다 고유한 새로 고침 비율을 제공해야 합니다. 교정은 장치 간 및 실험 간 변형을 해결하는 반면, 시간이 많이 소요되는 프로세스이며 완벽하지 않습니다. 점도가 다른 유체는 동일한 압력에 노출될 때 동일한 속도로 흐르지 않으며, 다중 시약으로 교정을 수행하므로 동일한 새로 고침 비율을생성하지 않을 수있습니다. 이 효과는 공급된 압력만 을 변화시켜 흐름을 조절하는 것과 는 달리 세 가지 제어 채널을 사용하여 시약을 미세 유체 장치로 연동 펌프하여 감쇠됩니다. 점도의 차이가 매우 큰 경우 마지막 수단으로, 여러 교정 실험을 수행하여 각 개별 시약에 대해 고유한 새로 고침 비율을 구현할 수 있습니다.
연동 펌프를 사용하여 미세 유체 장치에 시약을 주입하면 점도가 다른 솔루션을 사용하는 효과가 약해지지만 이차적인 문제도 발생합니다. 유체를 미세 유체 장치로 펌핑하기 위해 개별 단계를 사용하면 단일 반응기로 의 주입 해상도가 제한되고 단일 펌프 사이클을 수행할 때 주입된 부피에 의해 제한됩니다. 우리의 연구 내에서 이 값은 보정 중에 결정되며, 단일 펌프 사이클이 반응기 부피(약 0.1 nL)의 약 1%를 대체한다는 것을 나타냅니다. 따라서 반응기 부피의 30%를 대체하려면 30개의 펌프 사이클을 실행해야 하며, IVTT 반응 용액의 23개의 펌프 사이클이 추가되고 DNA 또는 초순수의 펌프 사이클만 7회가 추가됩니다. 연구에 충분하지만 대체 실험 프로토콜은 더 많은 수의 고유 시약을 추가하거나, 더 낮은 새로 고침 분획을사용하거나, 반응기에 단일 시약의 더 작은 볼륨을 추가하려고 할 때 문제가 발생할 수 있습니다. 이러한 경우, 미세 유체 장치 설계는 더 큰 부피의 반응기를 제공하도록 조정할 수 있다. 이러한 예는 니더홀트마이어 외36에보고됩니다.
결정적으로, 이 원고에 설명된 장치는 장기간 반응을 지속하여 정상 상태 전사 및 번역 속도를 가능하게 합니다. 주기적으로 반응기에 새로운 시약을 주입하고 반응(byby)제품을 제거함으로써 반응이 지속되고 복잡한 동적 거동을 모니터링할 수 있습니다. 이런 식으로 어느 정도는 셀룰러 환경을 모방하는 플랫폼이 만들어졌습니다. 또한,이 플랫폼은 주사와 주사의 특정 구성 사이의 기간을 조정하여 시스템 역학의 탐구를 가능하게한다. 그 결과, 이러한 다층 미세 유체 장치는 복잡한 동적 동작을 표시하는 새로운 합성 네트워크의 특성화 및 최적화를 위한 강력한 도구입니다.

셀은 복잡한 동적 규제 네트워크1,2를사용하여 환경을 감지하고 대응할 수 있습니다. 합성 생물학 분야는 세포3,4의기능을 확장 할 수있는 생물학적 시스템을 설계하기 위해 이러한 네트워크를 포함하는 자연 발생 구성 요소에 대한 우리의 지식을 활용합니다. 반대로, 기존 회로의 단순화된 합성 유사체를 설계하거나 자연적으로 발생하는 행동을 나타내는 전방 공학 생물 시스템을 설계하여 생명을 지배하는 자연 네트워크에 대한 이해를 증진할 수도 있습니다. 이러한 생물학적 시스템의 de novo 엔지니어링은 새로운 유전 회로 또는 신호 경로가 잘 정의 된5,6부분을 사용하여 합리적인 방식으로 설계되는 상향식 방식으로 수행됩니다. 네트워크의 합리적인 설계와 생물학적 관련 시스템의 설계를 결합하면 다양한 수준의 추상화 7과 함께 생물학적 규제 시스템의 심층적 특성화 및 연구를 할 수있습니다.
Elowitz와 Leibler8 및 Gardner et al.9의 선구적인 작품은 세포 호스트에 합성 유전 네트워크의 성공적인 도입을 입증하는 첫번째이었습니다. 다음 10 년 에서, 수많은 연구원은세포7,10,11에 합성 회로의 도입에 관한 몇 가지 제한의 출현에도 불구하고 이러한 초기 성공에 구축을 계속하고있다 ,12. 이상적으로, 셀룰러 호스트에 합성 회로의 도입은 모듈 식으로 발생해야합니다. 불행하게도, 셀룰러 환경의 복잡성은 많은 부분과 네트워크의 기능이 매우 문맥의존되는 12,13,14,특히 도전하게한다 . 결과적으로 네트워크는 종종 합성 회로의 기능에 영향을 줄 수 있는 네이티브 호스트 구성 요소와 원치 않는 상호 작용을 경험합니다. 유사하게, 외인성 네트워크의 구성 요소는 숙주 과정을 억제하고, 호스트 내의 공유 자원을 위해 경쟁하고, 성장역학15,16,17에영향을 미칠 수 있다. 따라서 생체 내 환경에서 합성 네트워크의 동작을 합리적으로 설계하고 예측하기 위해서는 모든 호스트 및 회로 별 역학의 포괄적인 모델이필요합니다 18.
합성 네트워크의 특성화를 위한 셀룰러 호스트의 사용에 대한 실행 가능한 대안은 시험관 내 전사 및 번역(IVTT) 기술의 적용이다. 합성 망에 대한 테스트베드로서 작용하여, 반응은 유전자 발현을 가능하게 하는 데 필요한 모든 성분을 포함하는 용액에서수행된다(19,20,21). 이러한 방식으로, 생물학적으로 관련, 이기는하지만 인공, 환경은 합성 네트워크를 테스트 할 수있는 내에서 생성된다22,23,24,25, 26, 27,28. IVTT 솔루션을 사용하는 주요 장점은 사용자가 지정한 조건하에서 반응을 수행할 수 있는 능력이며, 연구자들은 각 반응의 정확한 조성을 조정할 수 있습니다2. 또한 셀 프리 접근 방식은 시간이 많이 소요되는 셀룰러 복제 단계를 수행할 필요가 없으므로 합성 네트워크의 높은 처리량 테스트를 가능하게 합니다. 그 결과, 연속적인 설계 -build-test 사이클의 지속 기간은29,30,31,32로현저히 감소된다. Gibson 어셈블리와 같은 무세포 복제 기술을 활용하여 새로운 네트워크를 신속하게 엔지니어링하고 생체 내 테스트에 필요한 플라스미드와 달리 선형 DNA 템플릿에서 네트워크를 구축함으로써 설계 주기를 더욱 가속화할 수 있습니다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)33,34를통해 증폭 될 수있다.
배치 반응은 IVTT 반응이 수행 될 수있는 가장 간단한 방법이며, 모든 반응 성분이 결합되는 것을 특징으로하는 단일 반응 용기가필요합니다 35. 이러한 반응은 단백질 발현 및 기본 회로 테스트에 충분하지만 네트워크의 장기적인 동적 거동을 연구하려고 할 때 불충분하다는 것을 증명합니다. 배치 반응의 과정을 통해, 시약은 고갈되거나 전사 및 번역 속도의 지속적인 감소의 결과로 저하를 겪습니다. 또한 반응이 진행됨에 따라 네트워크의 올바른 기능을 방해하거나 완전히 억제할 수 있는 부산물이 축적됩니다. 궁극적으로, 배치 반응기의 사용은 관찰 할 수있는 동적 동작을 제한, 부정적인 규제는5,36을구현하는 특히 도전되고.
IVTT 시스템의 다양성은 연속 흐름에서 액적 기반 방법뿐만 아니라 간단한 투석 접근법 2,30에이르기까지 장기간 IVTT 반응을 수행 할 수있는 여러 가지 대체 방법을 가능하게합니다. 37,38,39,40. 미세 유체 장치의 응용 프로그램은 처리량을 증가시키고 비용을 최소화하는 동안 사용자가 자신의 반응에 대한 제어를 증가 제공35,41,42,각 특정 접근 방식은 자신의 장점. 연속 흐름의 사용은 발현 수율을 증가시키기 위해 용이하게 최적화될 수 있지만, 특정 반응 생성물을 효과적으로 제거할 수 없다는 것은 동적 거동에 대한 연구를 사소한39로만든다. 액적 기반 미세유체 시스템을 채용하는 동안 신규 네트워크의 고처리량 스크리닝이 가능하지만, 반응에 신선한 시약을 공급하는 어려움은 소량의 배치반응(43)과유사한 액적의 결과를 초래한다. 투석 기지를 둔 반응기는 신선한 시약의 소개를 허용할 뿐만 아니라 몇몇 반응 제품의 제거, RNA 분자 및 더 큰 단백질은 막 기공을 통해서 확산하기에 는 너무 크고, 반응기 내축적입니다. 또한, 시약의 많은 볼륨은 장기간 이러한 반응을 유지하기 위해 필요합니다30,44. 2013년, Maerkl 등은 장기간 IVTT 반응을 수행하기 위해 특별히 설계된 다층 미세 유체 장치를36,45로제시하였다. 다층 미세 유체 장치의 사용은 유체 흐름을 직접 제어 할 수 있게하여 장치46,47의특정 영역에서 유체의 리디렉션및 유체 의 절연을 허용합니다. 이러한 단리된 영역은 IVTT 반응이 수행될 수 있는 독립적인 나노리터 규모의 반응 챔버로서 기능할 수 있다. 단일 IVTT 반응 의 과정을 통해, 반응기에 신선한 시약의 주기적인 주사는 IVTT 분대 및 DNA 템플릿을 보충하기 위하여 이용됩니다. 동시에, 이전 반응 용액의 동일한 부피가 변위되어 반응 제품을 제거합니다. 이러한 방식으로, 기초 전사 및 번역 속도가 일정한 상태로 유지되는 평형 환경이 유지되어 IVTT 반응의 수명을 연장하고 풍부한 동적 동작이 발생할 수 있습니다. 이 접근을 적용함으로써, 연구원은 새로운 유전 네트워크의 전진 공학에 있는 원조, 특정 회로 내의 일어나는 개별적인 프로세스의 운동 비율을 조사할 수 있습니다. 예를 들어, Niederholtmeyer 외. 유전 링 발진기의 다양한 요소를 특성화하기 위해 이 접근법을 구현하고, 이의 운동 속도를결정한다 36. 추가 연구에서 Yelleswarapu 외. 배치 조건하에서 결정된 시그마 인자 28(σ28)의운동 속도가 σ28기반 발진기의 거동을 설명하기에 충분하지 않았으며, 유동 기반 데이터의 첨가가 불충분하다는 것을 보여주었다. 네트워크 동작의 향상된 모델 예측22.
이 원고의 목적은 장기 IVTT 반응을 수행 할 수있는 다층 미세 유체 장치의 제조를위한 완전한 프로토콜을 제시하는 것입니다. 또한 이 원고는 장기간 IVTT 반응을 수행하는 데 필요한 모든 하드웨어 및 소프트웨어를 설명합니다. 그 안에 유체의 흐름을 제어하는 데 필요한 미세 유체 장치의 작동은 튜브 길이를 통해 미세 유체 장치에 직접 연결되는 일련의 공압 밸브를 사용하여 달성됩니다. 또한 공압 밸브는 맞춤형 가상 제어 인터페이스를 통해 제어됩니다. 미세 유체 장치 내의 유체 흐름은 시판되는 압력 조절 시스템에서 제공하는 연속 압력을 사용하여 달성됩니다. IVTT 반응은 전형적으로 29°C와 37°C 사이에서 수행되며 현미경 인큐베이터는 반응 동안 온도를 조절하는데 사용된다. 그러나 IVTT 혼합물의 기능은 4°C 이상으로 저장될 때 점차 저하된다. 따라서, 이 원고는 미세 유체 장치에 주입하기 전에 IVTT 혼합물을 냉각하는 데 사용되는 오프 칩 냉각 시스템에서 확장됩니다. 결론적으로,이 원고는 다른 연구자들이 상대적으로이 기술을 복제 할 수 있도록 미세 유체 흐름 반응기를 사용하여 장기간 IVTT 반응을 성공적으로 수행하는 데 필요한 절차에 대한 포괄적 인 개요를 제공합니다. 용이성.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20063.365</td><td></td></tr><tr><td>AZ 40 XT</td><td>Merck KGaA(독일 다름슈타트)</td><td>-</td><td>포지티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>AZ 726 MIF 개발자</td><td>Merck KGaA(독일 다름슈타트)</td><td>-</td><td>액 포지티브 포토레지</td></tr>스트 <tr><td>이소프로판올</td><td>Merck KGaA(독일 다름슈타트</td><td>)109634</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>ECN 631-1550</td><td></td></tr><tr><td>mr Dev 600</td><td>Microresist Technology GmbH (독일 베를린)</td><td>-</td><td>개발자 네거티브 포토레지</td></tr>스트 <tr><td>실리콘 프리 방열판 그리스 회로</td><td>작동</td><td>CW7270</td><td>열 화합물</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>실리콘 재료</td><td>-</td><td>< 1-0-0> 방향, 100mm 직경, 525 & 마이크로; m 두께</td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td><td>-</td><td>Negative Photoresist</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td><td>The Dow Chemical Company</td><td>01317318</td><td></td></tr><tr><td>trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr> <tr><td> Name</td><td>Company </td><td>Catalog 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 channel digital input/output module</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-504</td><td>8x</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>The Imaging</td> <td>Source-Compression</td><td></td></tr> <tr><td>fitting</td><td>Koolance, Inc.</td><td>FIT-V06X10</td><td>6mm ID 및 10mm OD의 튜빙용 피팅. 4x</td></tr><tr><td>컨트롤러 엔드 모듈</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-600</td><td></td></tr><tr><td>튜빙</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>AAD04103</td><td>0.02" ID, 0.06" OD, Tygon 튜빙 (ND-100-80)</td></tr><tr><td>장치 커넥터 핀</td><td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td><td>200.010-A</td><td>AISI 304 튜빙, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td></tr><tr><td>이더넷 컨트롤러</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-881</td><td></td></tr><tr><td>암 버스 커넥터</td><td>Encitech</td><td>DTCK15-DBS-K</td><td>15극 암 버스 커넥터</td></tr><tr><td>유체 저장소</td><td>Fluigent</td><td>Fluiwell-4C</td><td></td></tr><tr><td>Fluigent 압력 시스템</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-EZ</td><td>0 - 345 mbar</td></tr><tr><td>Hg 쇼트 아크 램프</td><td>Advanced Radiation Corporation</td><td>- </td><td>350W</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Torrey Pines Scientific</td><td>HP61</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Software</td><td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td><td>https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td><td></td></tr><tr><td>Liquid</td><td>coolant, Koolance, Inc.</td><td>LIQ-705CL-B</td><td></td></tr><tr><td>루어 스텁</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>LS23</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer to barb connectors</td><td>Cole Parmer</td><td>45505-32</td><td>3/32" ID</td></tr><tr><td>Matlab Software</td><td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td><td>https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td><td></td></tr><tr><td>Microcamera</td><td>The Imaging Source</td><td>DMK 42AUC03</td><td></td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>OrcaFlash4.0 V2 ( C11440-22CU)오</td><td></td></tr><tr><td>비탈 셰이커</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-513000-05</td><td></td></tr><tr><td>오븐</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus T6P 50045757</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마 애셔</td><td>Quorum Technologies</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 펀처</td><td>SYNEO</td><td>Accu-Pucnh MP10</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 튜빙</td><td>Trajan</td><td>1301005001-5F</td><td>0.005" ID, 1/32" OD, 빨간색</td></tr><tr><td>펠티에 소자</td><td>유럽 열역학</td><td>APH-127-10-25-S</td><td></td></tr><tr><td>펠티에 온도 컨트롤러</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>포토마스크</td><td>CAD/Art Services, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>포토마스크 디자인</td><td>Maerkl Lab, EPFL</td><td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td><td></td></tr><tr><td>공압 밸브 어레이</td><td>FESTO-1x</td><td></td> <td>22 밸브 어레이 및 1x 8 밸브 어레이, 평상시 폐쇄 밸브.</td></tr><tr><td>전원 어댑터</td><td>Koolance, Inc.</td><td>대서양 서머 타임 - EX004S</td><td>110 / 220V AC 전원 어댑터</td></tr><tr><td>PTFE 튜빙</td><td>콜 파머</td><td>06417-21</td> <td># 24 AWG 얇은 벽 PTFE</td></tr><tr><td>펀칭 핀</td><td>SYNEO</td><td>CR0320245N21R4</td><td>OD : 0.032 "(0.8128 mm), ID : 0.024 "(0.6090 mm)</td></tr> <tr><td>PVC 튜빙</td><td>Koolance, Inc.</td><td>HOS-06CL</td><td>6mm ID, 10mm OD</td></tr><tr><td>단일 가장자리 블레이드</td><td>GEM Scientific</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Soft 튜빙</td><td>Fluigent</td> <td>-</td> <td>유체 저장소와 함께 제공됩니다. (1mm 내경, 3mm 외경)</td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>서미스터 케이블</td><td>Warner Instruments</td><td>TA-29</td><td>케이블(비드 서미스터</td></tr><tr><td>포함) UV 노광 시스템</td><td>ABM, USA-Near</td><td></td> <td>UV 노광 시스템, 350W</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Vacuumbrand GmbH</td><td>MD1C</td><td></td></tr><tr><td>수냉식 냉각판 블록</td><td>Koolance, Inc.</td><td>PLT-UN40F</td><td></td></tr><tr><td>워터 쿨러</td><td>Koolance, Inc.</td><td>EX2-755</td><td></td></tr><tr><td>저울</td><td>Sartorius</td><td>M-prove</td><td></td></tr></tbody></table>

장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

세포 기지를 둔 합성 생물학의 한계는 연구원이 더 크고 더 복잡한 합성 유전 통제 회로를 개발하는 것을 목표로 함에 따라 점점 더 명백해지고 있습니다. 생체 내에서 합성 유전 조절 네트워크의 분석은 시간이 많이 걸리고 환경 제어의 부족으로 고통받고 있으며, 외인성 합성 성분이 호스트 프로세스와 상호 작용하여 원치 않는 행동을 초래합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 새로운 회로의 무세포 특성화가 더욱 널리 퍼지고 있습니다. 시험관 내 전사 및 번역(IVTT) 혼합물은 실험 환경의 조절을 허용하고 각각의 고유 시스템에 최적화될 수 있다. 여기에 제시된 프로토콜은 장기간 IVTT 반응을 유지하는 데 사용할 수 있는 다층 미세 유체 장치의 제조를 자세히 설명합니다. 시간이 지남에 따라 자원이 고갈되고 (바이-) 제품이 축적되는 배치 반응과는 달리, 미세 유체 장치를 사용하면 자원의 보충뿐만 아니라 반응 제품의 제거가 가능합니다. 이러한 방식으로, 세포 환경은 유전자 회로의 동적 거동이 장기간에 걸쳐 조사될 수 있는 평형 이외 환경을 유지함으로써 에뮬레이트된다. 다층 미세 유체 장치를 완전히 활용하기 위해 하드웨어와 소프트웨어가 통합되어 IVTT 반응을 자동화합니다. IVTT 반응을 여기에 제시된 미세 유체 플랫폼과 결합함으로써 복잡한 네트워크 동작을 포괄적으로 분석하여 세포 프로세스를 조절하는 메커니즘에 대한 이해를 촉진할 수 있습니다.

PDMS 기반의 제조 과정, 다층, 체외 전사 및 번역(IVTT) 반응이 장기간 수행될 수 있도록 하는 미세유체 장치. 또한 장기간 이러한 반응을 자동화하고 유지하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어에 대한 포괄적인 개요가 제공됩니다.

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

세포없는 유전자 발현 시스템의 사용에 의해 합성 유전자 네트워크를 프로토타이핑하는 것이 크게 향상됩니다. 당사의 프로토콜은 다층 미세 유체 흐름 반응기의 제조 공정을 설명하고 이러한 장치가 GFP의 장기간 세포 없는 발현에 사용될 수 있음을 보여줍니다. 미세 유체 유량 반응기와 결합된 세포 없는 단백질 발현은 합성 생물학적 장치의 설계를 위한 신속한 프로토타이핑 플랫폼을 제공합니다.이 전체 설정은 매우 다재다능하며 높은 수준의 제어를 요구하는 생화학 적 또는 화학 반응의 전도에 적응 할 수 있습니다. 세포 없는 반응 용액의 안정성을 보장하는 것은 중요하고 달성하기 어렵다. 충분한 냉각을 제공하는 데 집중하고 이 프로토콜에 지정된 튜브를 활용하십시오.실험 플랫폼을 제작하고 준비하려면 시각적 인 보조 없이 는 따라하기 어려울 수 있는 수많은 개별 구성 요소의 연결이 필요합니다. 먼저, 동반 텍스트 프로토콜을 따라 미세 유체 장치를 제조하고 이 장치에 중요한 밸브를 제어하는 데 사용되는 공압 제어 및 유압 조절을 설정합니다. 오프 칩 냉각을 설정하려면 펠티에 요소의 차가운 면에 PTFE 튜브의 길이를 코일링하고 테이프로 코일을 고정합니다.PTFE 튜브의 한쪽 끝이 유동 층 압력 제어 시스템의 저장소에 연결되어 있고 다른 쪽 끝이 펠티에 표면에서 1센티미터 이상 튀어오르지 않도록 합니다. 다음으로 PTFE 튜빙의 돌출 끝에 PEEK 튜브의 5~ 10센티미터 길이를 삽입합니다. 펠티에 요소의 뜨거운 면에 충분한 양의 열 화합물을 적용하여 물 블록의 차가운 접시에 놓습니다.튜브, 펠티에 요소 및 냉각 블록이 항상 서로 직접 접촉하고 있는지 확인합니다. 그런 다음 펠티에에 제공된 전압을 조절할 수 있도록 직렬 버스 커넥터를 사용하여 펠티에 요소를 온도 컨트롤러에 연결합니다. 그런 다음 펠티에 표면에 테미터를 단단히 배치하고 출력을 온도 컨트롤러에 연결합니다.물 냉각기를 켠 후 온도가 섭씨 4도에서 안정될 때까지 펠티에공급된 전압을 조정합니다. 미세 유체 장치의 각 제어 채널에 대해 1미터 길이의 표준 튜브 길이를 절단합니다. 한쪽 끝에는 23 게이지의 핀, 반인치 루어 스텁을 삽입하고 다른 쪽 끝에는 스테인레스 스틸 연결 핀을 삽입합니다.루어 스텁을 남성 Luer 3/32 인치 가시 나일론 커넥터에 연결하고 커넥터의 바브를 폴리우레탄 튜브 의 길이에 삽입합니다. 그런 다음 이 폴리우레탄 튜브를 솔레노이드 밸브 중 하나에 직접 삽입합니다. 다음으로 23 게이지 하프 인치 루어 스텁을 주사기에 부착하고 표준 튜빙의 3 ~ 4 센티미터 길이조각에 삽입합니다.이 튜브의 열린 끝을 초순수 수의 저수지에 넣고 주사기를 초순수물로 채웁니다. 여기에 도시된 바와 같이 미세 유체 장치의 각 제어 채널을 번호. 4~29번 채널의 경우 해당 튜브를 찾아 주사기에 부착된 튜브의 열린 끝에 금속 핀을 삽입합니다.그런 다음 길이의 절반이 채워질 때까지 제어 채널 튜브에 물을 주입합니다. 다음으로, 주사기에서 튜브를 분리하고 스테인레스 스틸 커넥터 핀을 미세 유체 장치의 해당 구멍에 삽입합니다. 모든 제어 채널에 대해 이 단계를 반복합니다.이제 제어 인터페이스를 사용하여 솔레노이드 밸브를 모두 엽니다. 이렇게 하면 제어 채널 튜브 내의 유체가 미세 유체 장치로 강제로 유입되고 장치 내의 모든 멤브레인 기반 밸브를 닫습니다. 각 냉각시 시약은 저수지 출구를 미세유체 장치 입구에 연결하기 위해 표준 튜브의 미터 길이를 절단합니다.튜브의 한쪽 끝을 가지고 튜브가 저수지의 바닥에 도달 할 수 있도록 저수지에 삽입합니다. 저수지 튜브 콘센트를 조여 밀폐 씰이 달성되어야 합니다. 그런 다음 스테인레스 연결 핀을 튜브의 열린 끝에 삽입합니다.다음으로, 1 밀리리터 주사기의 끝에 23 게이지 반 인치 루어 스텁을 부착합니다. Luer 스텁에 짧은 길이의 표준 튜빙을 추가합니다. 튜브의 끝을 원하는 시약 용액에 넣고 시약으로 주사기를 채웁니다.그런 다음 주사기에 연결된 폴리우레탄 튜브에 스테인레스 스틸 커넥터 핀을 삽입하고 시약으로 튜브를 채웁니다. 작은 반응 볼륨을 사용하는 경우, 시약은 저수지에 들어가지 않으며 튜브 자체는 저수지 역할을합니다. 완료되면 주사기를 분리하고 커넥터 핀을 미세 유체 장치의 유동 층 입구 구멍 중 하나에 삽입합니다.그런 다음 압력 레귤레이터 소프트웨어를 사용하여 각 저장소에 압력을 가하여 시약을 미세 유체 장치로 강제로 넣습니다. 펠티에의 표면 온도가 섭씨 4도로 설정되어 물 냉각기와 펠티에 원소가 켜져 있는지 확인합니다. 냉각 설정을 가능한 한 미세 유체 장치에 가깝게 마운트하여 펠티에와 장치 입구 사이의 냉각되지 않은 부피를 최소화합니다.그런 다음 1 밀리리터 주사기를 23 게이지 반 인치 루어 스텁에 연결하여 단부에 부착된 짧은 길이의 표준 튜브를 연결합니다. 시약을 냉각하여 주사기를 채우도록 그립니다. 다음으로 결합 튜브를 통해 PEEK 튜브를 주사기에 연결하고 PEEK 튜브를 통해 시약을 강제로 시약에 일정한 압력을 가하여 PTFE 튜브에 넣습니다.마지막으로 주사기에서 PEEK 튜브를 분리하고 미세 유체 장치의 흐름 채널 입구에 직접 삽입합니다. 압력이 가해지면 냉각된 시약이 미세 유체 장치로 강제로 강제로 들어갑니다. 모든 제어 및 유동 층 튜브가 부착된 현미경 단계에서 미세 유체 장치가 안전한지 확인하고 인큐베이터의 모든 개구부를 닫습니다.다음으로 인큐베이터의 주변 온도를 섭씨 29도로 설정합니다. 그런 다음 냉각 시스템이 켜져 있고 실험을 시작하기 전에 섭씨 4도로 설정되어 있는지 확인합니다. 유량 채널 압력 레귤레이터에 가해지는 압력이 800 밀리바로 설정되어 있고 소프트웨어를 사용하여 각 개별 유량 채널의 출력 압력을 20~100밀리바 사이로 설정합니다.제어 채널 솔레노이드 밸브에 가해지는 압력이 채널 1~8개, 채널 9~29의 경우 3개의 막대가 있는지 확인합니다. 다음으로, 채널(29)을 가압하여 장치의 출구를 닫고 동시에 제어 채널을 1~3및 15~28로 우울화한다. 그런 다음 선택적으로 멀티플렉스의 제어 채널을 우울화하여 선택한 단일 시약이 장치로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다.현미경을 사용하여 공기 제거를 모니터링하고 기포를 도입하지 않고 모든 시약이 올바르게 흐르도록 합니다. 제공된 소프트웨어 패키지를 사용하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 교정 프로세스와 관련된 데이터 필드를 설정합니다. 이어서 교정 프로토콜을 실행하여 단일 유입 단계에서 각 반응기에서 변위된 유체 부피를 결정합니다.제어 소프트웨어가 제시한 단계와 함께 교정 실험의 분석을 완료하고 미세 유체 장치에서 각 링 반응기의 새로 고침 비율을 결정합니다. 마지막으로 가상 제어 인터페이스 내에서 원하는 실험에 필요한 값을 설정합니다. 제어 인터페이스에서 수행 실험 버튼을 눌러 실험 프로토콜을 시작합니다.교정 실험 중에 반응기는 각 희석 후 강도가 기록되는 불소로 소각로 가득 차 있습니다. 희석당 형광 강도의 감소는 정해진 수의 유입 단계에 대해 변위된 반응기 고리의 부피를 나타낸다. 이 볼륨을 새로 고침 비율이라고 합니다.평균 새로 고침 비율과 표준 편차는 빨간색의 각 희석 단계에 대해 표시됩니다. 8개의 원자로 중 7개는 매우 유사한 동작을 보여주지만, 원자로 1개는 7차 희석 주기 이후 변동을 나타낸다. 이는 각 반응기에 대한 고유한 새로 고침 비율의 필요성을 강조합니다.여기에 나타난 장기간의 체외 성적 증명서 및 번역 반응은 원자로 부피의 30 %가 14.6 분마다 대체되었습니다. 빈칸으로 사용되는 미세 유체 장치의 두 개의 반응기. 다른 모든 반응기는 시험관 내 전사 및 번역 반응 용액75%와 초순수수 또는 2.5 나노몰러 선형 DNA 템플릿코딩으로 구성되어 deGFP 단백질의 발현을 용인하였다.DNA가 추가된 4개의 반응기 에서, 명확한 deGFP 발현이 있었습니다. 하나의 반응기는 낮은 형광 신호를 표시합니다. 이는 반응기에 들어가는 DNA가 적거나 반응기 치수의 변화로 인해 흐름의 차이로 인해 발생할 수 있습니다.14 시간 후에, DNA를 포함하는 반응기의 신호에서 급격한 증가가 보입니다. 이는 미세 유체 장치의 유동층으로 유입되는 기포에 기인한다. 흐름이 재개되면 실험은 이전의 형광 강도로 돌아갑니다.세포 없는 반응 솔루션은 충분히 냉각되지 않는 한 시간이 지남에 따라 저하될 수 있으며, 이 프로토콜에 설명된 냉각 공정을 중요하게 만듭니다. 플랫폼의 다재다능함으로 인해 다양한 생화학 및 화학 반응을 정밀하고 통제된 방식으로 수행할 수 있습니다. 미세 유체 유량 반응기의 적용은 이중 유전 회로 프로토타이핑을위한 연속 설계 빌드 테스트 주기를 가속화했다.

a-multilayer-microfluidic-platform-for-conduction-prolonged-cell-free

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

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