Name: mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 조류 배아에서 mRNA 전기 포란을 이용한 다중 단백질의 빠르고 효율적인 발현 방법을. 형광 단백질 표지와 실시간 세포 이동 추적이 가능하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는이 작품에 도움이 통찰력을 데이비드 Huss 감사합니다. 이 작품은 로즈 힐스 재단 여름 연구 펠로우십 (2016-2018)과 USC Provost의 언더 그라드 연구 펠로우십M.T., 사반 연구소 교내 교육 박사 전 박사 상, 그리고 대학에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 남부 캘리포니아 학부 연구 어소시에이트 프로그램 수상

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저자는 선언할 이해상충이 없습니다.

이 프로토콜에서는 메추라기 배아를 가스투압하는 세포로 mRNA를 정밀하게 미세 주입하고 전기 포어하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공했습니다. 우리는 시험관 내 합성 mRNA 전기화가 메추라기 배아에서 형광 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 입증했습니다 (그림2 및 3). 전기 포공 mRNAs에서 번역된 H2B-시트린 단백질로부터의 형광은 ~ 20분 이내에 공초점 현미경검사법에 의해 검출될 수있고 시간 동안 FP 형광에서 증가하였다(그림 3,보충 영화1). 이것은 놀랍게도 빠르며 시트린32,33에대한 추정 된 성숙 시간에 가깝습니다. DNA 벡터로부터 발현된 FPs는 2-3시간 후에 검출되었다(도 3,<strong class="xfi...

전기 개출은 전기 펄스를 사용하여 플라즈마 막에 일시적인 기공을 생성하여 핵산이나 화학 물질과 같은 물질이 시토솔로 전달되도록하는 물리적 형질 감염 방법입니다. 전기 천공은 박테리아, 효모, 식물 및 포유류 세포1,2,3으로DNA를 전달하는 데 널리 사용됩니다. 그것은 일상적으로 세포의 개발 또는 라벨 이동 세포의 유전 제어를 연구하기 위해 개발 조류 배아 내에서 대상 세포와 조직에 유전 페이로드를 소개하는 데 사용4,5,6, 7. 그러나 DNA 전기 화 8과 관련하여몇 가지 실험적 한계가 존재합니다. 예를 들면, DNA 전기천공은 수시로 세포 당 발현 벡터의 높게 가변적인 수를 소개하고 그 후에 mRNAs 및 단백질은 그(것)들이 인코딩합니다. 이러한 가변성은 이미지 분석과 데이터 해석을 모두 복잡하게 하는 상당한 세포 세포 이질성으로 이어질 수있다9,10. 추가적으로, DNA 전기 천공에서 단백질은 단지 발현하기 시작 ~3 시간 후 전기 천공및 12 시간까지 세포 수와 형광 강도의 최대 효율에 도달하지 않습니다, 가능성이 때문에 핵으로 전달하고 완료하는 데 필요한 시간 생체 내 전사 및 번역모두 11.
대조적으로, mRNA 형질감염은 미세주입12,13,mRNA lipofectamine 형질감염에 의한 인간 줄기세포를 재프로그래밍하여 제노푸스 라에비스 난모세포를 포함한 다양한 모델 시스템에서 효과적으로 사용되고 있다14 , 성인 마우스15에서반응성 신경 줄기 세포를 전기화. 우리는 별개의 형광 성 단백질 (FPs)를 인코딩하는 시험관 내 합성 mRNAs를 사용하여 초기 조류 배아 발달 중에 세포를 효율적으로 라벨링하는 mRNA 전기 화기의 능력을 테스트했습니다. 우리의 연구를 위해, 우리는 pCS2+ 벡터, 제노푸스와 얼룩말 배아에서 단백질을 발현하기 위해 일반적으로 사용되는 다목적 발현 벡터를 사용했습니다. pCS2+에 있는 SP6 및 T7 RNA 중합효소 프로모터는 시험관 내 전사/번역 시스템에서 사용될 때 어떤 복제된 유전자든지에서 mRNA 그리고 단백질의 합성을 허용합니다.
여기에서, 우리는 mRNA 전기 천공이 메추라기 배아를 가두기에서 형광 성 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 보여줍니다. 우리는 이러한 연구에 사용되는 많은 발현 벡터를 설계하고 생성했습니다. 예를 들어, 우리는 LifeAct-eGFP 유전자16을 CMV 프로모터 및 SP6 프로모터로부터 발현하기 위해 pCS2+ 벡터17로 subcloned하였다. 삽입된 유전자는 SP6 프로모터의 하류및 SV40 폴리(A)꼬리(18)의 상류에 놓여 있다. mRNA 및 DNA와 함께 전기화된 배아에서, 시험관내 전사 mRNAs에서 부호매겨진 FPs는 전기 천공의 20 분 안에 처음 검출된 반면, DNA 발현 벡터에서 FPs는 3 시간 후에만 검출되었습니다. 막 단백질은 동시에 배아로 전기화될 수 있어 개별 세포에서 여러 단백질을 빠르고 효율적으로 발현할 수 있습니다. 마지막으로, 광표백(FRAP) 분석 후 생체 내 형광 회복을 사용하여, 우리는 대부분의 전기포케이트 mRNAs가 2시간 내에 붕괴되는 것을 보여준다. 따라서, 제한된 새로운 단백질 번역과 결합된 빠른 초기 단백질 생산은 mRNA 전기화를 발현의 시간적 조절이 필요할 때 귀중한 기술로 만든다.

<table><tbody><tr><td>BamHI-HF</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>BsrG1-HF</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R3575S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R3138L</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올</td><td>써모 피셔</td><td></td><td></td>15593031</tr><tr><td>SP6 mMessage 기계 체외 전사 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마 알드리치</td><td>D9542</td><td>2-(4-아미디노페닐)-6-인돌레카르바미딘 디하이드로클로라이드, 4&프라임;,6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드, DAPI 디하이드로클로라이드</td></tr><tr><td>Whatman No.1 여과지</td><td>시그마 알드리치</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마 알드리치</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>pmTurquoise2-Golgi</td><td>Addgene</td><td>36205</td><td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td></tr><tr><td>pmEGFP-N1-LifeAct</td><td></td><td></td><td>Nat. 방법 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td></tr><tr><td>pCS2.Lifeact-mGFP</td><td>Addgene</td><td></td><td>이 논문</td></tr><tr><td>pCS.H2B-citrine</td><td>Addgene</td><td>53752</td><td>pCS-H2B-citrine은 Sean Megason(Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td></tr><tr><td>pCS.memb-mCherry</td><td>Addgene</td><td>#53750</td><td>pCS-memb-mCherry는 Sean Megason(Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM-780 도립 현미경</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td>LSM-780은 중요한 이미징 작업에 필요한 감도를 제공하는 컨포칼 및 다광자 현미경입니다. 전동 스테이지, 자동 초점 장치 및 풀 스테이지 탑 암막 인큐베이터가 장착된 780은 고급 라이브 셀/배아 이미징을 위한 탁월한 현미경입니다. 고감도 32채널 Quasar 검출기는 스펙트럼 이미징, 선형 불혼화 및 높은 색 수(>4) 이미지 획득을 가능하게 합니다. 여기는 6개 라인 단광자 레이저(405, 458, 488, 514, 564 및 633nm), 카멜레온(Coherent) 2광자 레이저(690nm - 1000nm 범위)로 수행할 수 있으며 ZEN 2011 SP7(Black) 시스템 소프트웨어로 실행할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>CUY-21 EDIT 생체 내 전기천공기</td><td>Bex Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>백금 플랫 사각 전극, 측면 길이 5mm</td><td>Bex Co., Ltd.</td><td></td><td></td>LF701P5E</tr><tr><td>Olympus MVX10 FL 스테레오 현미경</td><td>Olympus LifeScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XM10 흑백 카메라</td><td>Olympus LifeScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&times;, pH 7.4) </td><td></td><td></td><td>1 L의 10&times; 원액을 준비하려면 80g의 NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2g의 KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4g의 Na<sub를 결합하십시오.>2HPO4 (무수; Sigma-Aldrich S3264) 및 2.7g의 KH2PO4 (무수; Sigma-Aldrich P9791). HCl로 pH를 7.4로 조정하고 초순수 H2O로 최종 부피를 1L로 가져옵니다. HCR을 위해 PBS에서 CaCl2 및 MgCl2를 사용하지 마십시오. HCR용 PBS는 RNase-free 용액(예: 디에틸피로카보네이트[DEPC] 처리를 통해)으로 준비되는 것이 중요합니다.</td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/Triton</td><td></td><td></td> <td>Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443)의 1개 mL와 10&times의 100개 mL를 추가하십시오; PBS를 초순수 증류 H2O 890mL로 0.2°C를 통해 용액을 여과합니다. m 필터링하여 4에 보관 ? C를 사용할 때까지.</td></tr><tr><td>1&times; 인산염 완충된 염분 (PBS) (DEPC 대우하는; PH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0.1% 트리톤 X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mrna 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

우리는 mRNA 전기 가기는 살아있는 메추라기 배아에 있는 세포에 DNA 전기 포공 보다는 더 빠르고 광범위하게 표지하기 위하여 형광성 단백질을 허용한다는 것을 보고합니다. 높은 형질감염 효율은 적어도 4개의 별개의 mRNAs가 ~87% 효율로 공동 형질감염되는 것을 허용합니다. 대부분의 전기 포어mAs는 처음 2시간 동안 전기 천공 후 저하되어 개발 배아에서 시간에 민감한 실험이 수행될 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 다양한 세포내 표적 형광 단백질을 인코딩하는 mRNAs로 전기화된 살아있는 배아를 동적으로 이미지화하는 방법을 설명합니다.

mRNA 전기 화는 DNA 전기 화보다 더 효율적입니다.
우리는 pCS2 +를 사용했습니다. H2B-시트린은 시험관내 전사 mRNA를 준비한다. DNA 전기화는 일반적으로 1-2 μg/μL에서 수행되기 때문에 mRNA 전기화에 대해 mRNA(H2B-Citrine의 경우 약 0.25-0.5 μg/μL로 계산)의 등쪽 농도를 사용했습니다. 우리는 먼저 pCS2+의 전기 개광 효율을 테스트했습니다. H2B-시트린 DNA는 H2B-시트린 mRNA(pCS2+의 SP6 프로모터로부터 전사된 체외에서)와 비교되었다. H2B-Citrine)을 HH5 메추라기 배아에 별도로 전기대기또는 mRNA를 전기화한 후 12시간 후 전기천공에서 전기화 효율을 검사하였다. DNA 전기천공은 일부 전기포지체에서 더 밝은 형광을 유도하지만, 널리 발현된 mRNA 인...

우리는 메추라기 배아 모델 시스템에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현을 허용하는 방법으로 메신저 RNA (mRNA) 전기 를 보고합니다. 이 방법은 형광성 으로 세포를 표지하고 전기 개공 직후 시간 경과 현미경 검사법에 의해 생체 내 움직임을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

mRNA 전기기는 조류 모델 시스템 내에서 여러 단백질의 빠르고 효율적이며 공간적으로 제어되는 발현을 제공합니다. 이 방법은 표준 DNA 전기화에 의해 달성된 라벨링보다 형광 단백질의 더 광범위하고 빠른 발현을 허용합니다. 전기 기공은 수많은 모형 유기체의 세포로 RNA 및 DNA 같이 유전 페이로드의 전송을 위한 통로 역할을 하는 플라즈마 막에 있는 기공의 일시적인 개방을 용이하게 합니다.초기 실험의 경우 전기화와 같은 외부 조작에 더 강하고 저항력이 있기 때문에 하루 이상 된 배아로 작동합니다. 적절한 배아 발달 단계에서 메추라기 달걀 내용물을 부드럽게 깨고 10센티미터 페트리 접시에 붓습니다. 전송 파이펫을 사용하여 두꺼운 알부민의 대부분을 제거합니다.실험실 조직을 사용하여 요크 표면을 부드럽게 닦아 배아 주위에 남아있는 두꺼운 알부민을 제거하여 배아가 종이 고리에 단단히 붙일 수 있도록하십시오. 배아 위에 미리 절단된 필터 용지를 놓고 가위를 사용하여 배아의 둘레를 부드럽게 자른다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 부드러운 스트림을 사용하여 배아 밑에 PPS를 레이어링하여 조직에 달라붙는 멍에를 비우세요.배아 종이 링을 멍에의 경사 각도로 천천히 당깁니다. 종이를 PBS로 가득 찬 페트리 접시에 넣고 추가 청소를 합니다. 대부분의 요크가 제거되면 배아 복부 면을 35mm 페트리 접시에 넣고 한천과 알부민의 반고체 혼합물로 덮여 놓습니다.흑전극을 PBS로 채우고 배아를 내부에 배치하여 전기 포기 챔버를 준비합니다. 유리 마이크로모세필리를 사용하여 200나노리터의 mRNA를 에피블라스트와 원하는 영역을 덮는 비텔린 멤브레인 사이의 구멍에 주입한다. 그리고 적전극을 사용하여 배아를 전극합니다.전기포고이드 배아를 한천 알부민 혼합물에 다시 놓고 원하는 발달 단계까지 섭씨 38도에 배양한다. 전기 포기 -인코딩 형광 단백질의 이미징을 위해 동적 이미징 실험을위한 가장 건강하고 가장 좋은 전기 화 배아를 선택하기 위해 형광 해부 스테레오스코프의 모든 전기 화 배아를 관찰합니다. 별도의 인큐베이터에서 다른 전기도금 배아 및 비 전자도판 배아를 계속 배양합니다.PBS로 선택된 배아를 간략하게 헹구면 전기기화 중에 배아의 등쪽에서 형성되었을 수 있는 기포를 제거한다. 청소된 배아는 배아의 등대 표면에 거품을 일으키지 않도록 주의하는 알부민-한천의 약 150마이크로리터의 얇은 층을 포함하는 이미징 접시에 직접 놓습니다. 이미징 접시의 안쪽 가장자리를 따라 작은 촉촉한 롤업 티슈 페이퍼를 추가합니다.파라핀 필름으로 접시를 밀봉하여 이미징 및 인큐베이션 중 증발을 최소화합니다. 접시를 공초점 현미경의 예동 된 단계로 빠르게 이동하고 밝은 필드 채널을 사용하여 배아의 착색 염료를 찾습니다. 이미징 소프트웨어를 원하는 목표, 이색 거울 및 방출 스펙트럼으로 설정하고 적절한 레이저를 켭니다.세포가 영화 전체에 대한 이미지 시야에 남아 있음을 주의하십시오. 충분히 높은 이미징 해상도를 사용하고 이미징 상태가 광독성을 유발하지 않도록 하십시오. 이미징 소프트웨어에서 라이브를 클릭하고 각 현미경 레이저 전력에 따라 형광 강도에 적합한 설정으로 레이저 전력을 조정합니다.1%레이저 파워와 800게인을 사용하여 배아를 이미징하기 시작하여 포화 픽셀이 보일 때까지 레이저 전력을 1% 증가시면 천천히 증가합니다. 포화 픽셀이 관찰되면 포화 픽셀이 시각화될 때까지 레이저 전력이 약간 감소합니다. 배아가 이미징 세션 중에 아가로즈 침대로 가라앉을 경우, 전체 전기도금 영역의 5마이크로미터 Z 스택을 사용하여 3~5분마다 배아를 이미지하여 전체 전기도금 영역의 5마이크로미터 Z-스택을 사용하여 개별 세포의 이주를 확인합니다.셀이 이동하는 속도 관찰하려면 첫 번째 영화의 처음 몇 시간 지점을 확인합니다. 세포가 빠른 속도로 이동하는 경우, 이미지 영역의 확대/축소를 확장하거나 다른 영역을 이미징하는 것이 좋습니다. 배아의 전체 전기도금 영역이 이미지되었을 때, 자가형경화 수준을 결정하기 위해 동일한 배아의 전기도금 되지 않은 영역에서의 이미지.전염된 mRNA가 스테레오 현미경에 대한 관심 유전자의 전기포공을 확인한 후 형광단백질로 얼마나 오래 번역될 수 있는지를 결정하기 위해, 배구를 반전된 공초점 현미경의 예열된 단계에 배치하고, 세포형 광판지의 70%레이저 출력, 100회 반복, 그리고 4개의 스캔 속도를 셀룰러 전기전도의 대부분에 걸쳐 사용한다. 사진 표백 후 36도에서 단계에서 배아를 계속 배양하고, 일반적으로 건강한 배아에서만 볼 수 있는 광표백 부위 내에서 활발하게 분할되는 세포에 주의를 기울이고, 따라서 전기기공이 배아 세포에 해를 끼치지 않았음을 나타낸다. 일반 3~5분 간격으로 원하는 시간 동안 전기도금 영역의 표백제 Z 스택 이미지를 획득합니다.이미징 조건이 이미징에 대한 대조군역할을 하기 위해 광표백되지 않은 동시에 배아 생존에 영향을 미치지 않도록 하기 위해. mRNA 붕괴 후 전기화에 대한 광표백 결과를 양수화하기 위해 ImageJ는 각 세포의 전기도금 영역의 중심에서 7.5 마이크로미터 원의 형광 강도를 측정하여 각 3~5분 간격에 걸쳐 세포 형광을 추적한다. 미토시스를 거치지 않고 완전히 광표백된 광표백 부위 내의 모든 세포가 측정되었을 때, 각 시간 지점에서 표백 후 시간 마다 형광 강도를 플롯하여 배아가 표백하였다.DNA 전기기화는 몇몇 전기도금 세포에 있는 밝은 형광으로 이끌어 내더라도, DNA 전기기화의 효율성은 널리 표현된 mRNA-인코딩형 형광 단백질에 비해 눈에 띄게 낮습니다. 동일한 배아 내에서 DNA와 mRNA 의 동시 전기포화를 비교할 때, 형광 단백질 효율을 표현하는 DNA는 형광 단백질을 표현하는 mRNA보다 유의하고 일관되게 효율이 낮습니다. 만 mRNA, DNA 또는 둘의 조합으로 전기도상화된 모든 배아의 정량화는, DNA는 세포의 대략 25%를 transfects 하는 동안, 주어진 지역에 있는 세포의 대략 75%를 암RNA transfects는 것을 밝힙니다.전감염된 mRNA는 mRNA가 세포경 번역 기계에 의해 즉시 인식될 수 있기 때문에 전감염된 DNA에 비해 더 빠른 단백질 생산으로 이끌어야 한다. 다중 DRNA의 공동 전기포지는 이전에 상대적으로 비효율적이기 는 않았지만, 본 실험에서 4mRNA의 공동 전기화는 모든 전기도금 영역 내에서 4개의 mRNA 의 87%의 전율 효율을 초래하였다. 광표백은 처음에 대략 95%에 의하여 광표백된 세포에 있는 형광 강도를 감소시키지만 몇몇 세포는 전기기화 직후형 단백질을 분할하고 표현하는 그들의 능력을 복구하는 남아 있습니다.그러나 이 능력은 전기기 후 5시간 이상 감소합니다. 최고의 이미징 조건을 최적화하는 데 시간을 할애하고 필요한 경우 조정을 할 준비가 된 영화를 시작한 후에도 계속 땜질을 하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

배우세요 조류 배아에서 mRNA 전기 포란을 이용한 다중 단백질의 빠르고 효율적인 발현 방법을. 형광 단백질 표지와 실시간 세포 이동 추적이 가능하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

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