iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

이 시험관 내 분석법은 높은 처리량과 확장 가능한 플랫폼에서 혈관신생 발아를 보여줍니다. 이것은 혈관 신생에 있는 새로운 표적을 찾아기 위하여 이용될 수 있었습니다. 이 혈관 신생 분석은 그라데이션과 관류를 포함하는 복잡한 세포 마이크로 환경을 높은 처리량 스크리닝과 호환되는 플랫폼과 결합합니다.

혈관 신생은 건강과 질병 모두에서 중요한 역할을합니다. 혈관 신생 중에 발생하는 메커니즘을 이해하는 것은 암이 어떻게 성장하고 조직이 어떻게 복구되는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 심혈관 질환과 조직 재생 중 메커니즘에 대한 통찰력을 줄 수 있습니다.

둘 다, 혈관 신생은 중요한 역할을 합니다. 이 미세 유체 플랫폼을 처음 사용하려면 볼륨의 법칙과 파이펫 방법을 알아야합니다. 현미경 아래에서 보거나 접시를 거꾸로 뒤집어 단계를 확인할 수 있습니다.

일부 단계는 단지 방법을 읽을 때 에 대한 느낌을 얻기 어렵다, 예를 들어 미세 유체 채널이 얼마나 작은 또는 접시를 보유하는 방법. 이러한 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 웬디 스탬이 될 것입니다. 시작하려면, 미생물 384 웰 플레이트를 멸균 라미나르 플로우 후드로 옮긴다.

뚜껑을 제거하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 40개의 관측 우물각각에 50마이크로리터의 물 또는 인산완충식식염식염을 추가합니다. 그런 다음 각 미세 유체 단위의 젤 입구에 밀리리터 콜라겐 1솔루션당 4밀리그램의 1.5 마이크로리터를 추가합니다. 젤이 채널에 들어가기 위해 젤의 액적이 각 우물의 중간에 놓여 있는지 확인하십시오.

5개의 미세 유체 단위를 채운 후에, 젤 채널의 정확한 충진을 시각적으로 검사하기 위하여 접시를 거꾸로 뒤집습니다. 마이크로플루마 플레이트를 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 10분간 배치하여 콜라겐 1개를 중합합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 접시를 꺼내 멸균 라미나르 플로우 후드로 옮겨.

각 미세 유체 단위의 상단 관류 채널의 콘센트에 밀리리터 fibronectin 코딩 솔루션당 10 마이크로그램의 50 마이크로리터를 추가합니다. 기포를 포획하지 않고 우물의 올바른 충전을 위해 우물의 측면에 파이펫 팁을 누릅니다. 콘센트를 잘 채우지 않고 콘센트의 액체 팬이 채워지고 액체 팬.

그런 다음 접시를 인큐베이터에 적어도 2 일 동안 놓습니다. 이제 냉동 IPSC-IC를 섭씨 37도의 수조에서 1분 이내에 빠르게 해동합니다. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 천천히 10 밀리리터의 기초 매체를 추가하여 희석시.

용액의 10 마이크로리터를 끌어내고 셀 카운터에 셀을 계산합니다. 튜브를 100배 g에서 5분간 원심분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 체퍼를 흡인하고 기저 배지에서 재중단하여 밀리리터당 7번째 세포에 2회 10의 농도를 산출한다.

다음으로, 미생물 384웰 플레이트를 인큐베이터에서 멸균 라미나르 플로우 후드로 옮는다. 관류 콘센트에서 섬유네틴 코딩 용액을 흡인하고 콘센트 우물에 25 마이크로리터의 기저 배지를 추가합니다. 각 상단 관류 입구에 셀 현탁액의 마이크로리터 방울 1개를 추가합니다.

액적이 몇 초 만에 평평해집니다. 시드가 단일 채널 내에서 채널 간에 균질성인지 여부를 현미경으로 확인하십시오. 미세 유체 우물 플레이트를 섭씨 37도에서 1.5시간, 이산화탄소 5%로 배양합니다.

그 후, 그들이 부착 한 것을 확인하기 위해 세포를 확인합니다. 상단 관류 콘센트 우물에서 기저 매질을 제거합니다. 상단 관류 입구와 콘센트에 따뜻한 용기 배양 배지를 추가합니다.

플레이트를 7도 각도로 설정하고 인큐베이터에서 8분 동안 흔들리는 간격으로 놓습니다. 첫날과 2번의 후시종에서는, 자동 단계와 브라이트필드 현미경을 사용하여 플레이트를 이미지하여 세포 생존가능성을 확인합니다. 이틀 후, 콜라겐 하나에 대해 컨할 수 있는 단층이 형성되었습니다.

먼저, VEGF 주식 4.5 마이크로리터, PMA 재고 4.5 마이크로리터, S1P 재고 2.25 마이크로리터로 기저배지 4.5밀리리터를 보충하여 혈관형성 발아 매체의 4.5 밀리리터를 준비한다. VEGF의 5.1 마이크로리터와 3.4 BFGF의 마이크로 리터와 기저 배지를 보충 하 여 혈관 성장 매체의 8.5 밀리 리터를 준비. 우물에서 배지를 흡인하고 상단 관류 입구와 아울렛 우물과 젤 입구 및 아울렛 우물에 신선한 용기 배양 배지 50 마이크로 리터를 추가합니다.

그런 다음 각 하단 관류 채널 입구 및 콘센트 우물에 혈관 유발 성 새싹 혼합물 50 마이크로 리터를 추가합니다. 혈관 신생 성장 인자의 그라데이션을 형성하기 위해 로커 플랫폼의 인큐베이터에 플레이트를 다시 넣습니다. 혈관 신생 성장 인자를 추가 한 후 1 일 및 이틀 후, 자동 단계에서 우물을 이미지하는 브라이트 필드 현미경을 사용합니다.

해부학과 새싹 안정화를 연구하려면 밀리리터 형광 라벨이 부착된 알부민당 0.5 밀리그램의 마이크로리터 1개를 상위 관류 입구에 추가합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터 파이펫과 솔루션을 혼합합니다. 플레이트를 37°C로 자동 단계및 인큐베이터로 형광 현미경으로 옮기습니다.

현미경을 10X 목표에서 설정하고 노출 설정을 수정합니다. 1분마다 타임랩스 이미지를 10분 동안 획득합니다. 현미경에서 플레이트를 제거하고 접시를 멸균 라미나르 플로우 후드로 옮겨.

우물에서 모든 배지를 제거하고 해당 우물에서 혈관 배양 배지 및 혈관 유발 발아 매체를 모두 교체합니다. 미세 유체 판을 인큐베이터에 다시 넣고 혈관 신생 발아를 계속합니다. 6일째에, 투과성을 연구하기 위하여 화상 진찰을 반복합니다.

세포 배양을 고치려면 우물에서 모든 배양 매체를 흡인시합니다. PBS에 4%PFA의 25마이크로리터를 모든 관류 입구및 아울렛 웰에 추가합니다. 그런 다음 미세 유체 판의 한쪽을 뚜껑에 5도 각도로 배치하여 흐름을 유도합니다.

실온에서 10분 동안 배양하세요. 그 후, 우물에서 PFA를 흡인. HBSS 의 50 마이크로 리터와 두 번 모든 관류 입구와 콘센트를 세척합니다.

그런 다음 우물에서 HBSS를 흡인합니다. Paraformaldehyde는 장갑을 착용하고 연기 후드로만 열어야하는 유해 화학 물질입니다. 다음으로, 모든 관류 입구및 콘센트에 0.2%의 이온성 계면활성제 50마이크로리터를 추가하여 실온에서 10분 동안 투과하고 미세유체 판을 뚜껑에 5도 각도로 배치합니다.

우물에서 비 이온 계면 활성제를 흡인하고 모든 관류 입구 및 아울렛 우물에 50 마이크로 리터의 HBSS를 추가하여 관류 채널을 두 번 세척합니다. 우물에서 HBSS를 흡인. Hoechst 1, 000 ~ 2, 000을 준비하여 핵을 염색하고 F-액틴을 염색하기 위해 HBSS에서 100 에서 200까지 의 Phalloidin을 준비합니다.

6밀리리터의 HBSS, 30마이크로리터의 F-actin, 그리고 팔콘 튜브에 Hoechst의 마이크로리터 3기를 결합합니다. 그런 다음 각 관류 입구와 콘센트에 25 마이크로 리터를 잘 추가합니다. 접시를 약간의 각도로 놓고 실온에서 적어도 30 분 동안 배양하십시오.

모든 관류 입구와 콘센트에 HBSS의 50 마이크로 리터와 두 번 세척. 그런 다음 자동화 된 단계와 형광 현미경을 사용하여 직접 이미지 또는 나중에 사용하기 위해 4 섭씨에서 빛으로부터 보호 플레이트를 저장합니다. 이 프로토콜에서, 마이크로 혈관은 지속적으로 침투하고 혈관 신생 성장 인자의 그라데이션에 노출되었다.

수동 펌핑 방법을 사용하여 IPSC-IC를 시드하면 균일한 파종 밀도가 발생했습니다. 미세유체 채널의 입구 위에 놓인 액적물의 타임랩스는 추가 직후, 입구 트렁크 위에 있는 액적물, 점막 반월상연상연동이 입구에 의해 고정될 때까지 출구쪽으로 흐르는 흐름을 나타낸다. 혈관신생 인자의 그라데이션에 노출되면 패턴 콜라겐 1젤 내의 마이크로 용기의 방향성 혈관형성 발아가 발생했습니다.

클리어 팁 세포 형성 및 콜라겐 내 침입은 혈관형성을 첨가한 후 24시간 동안 보였으며, 루멘 형성을 포함한 스톡 셀은 48시간 후에 보였다. 고정 및 염색 후, 이러한 새싹의 모양과 길이가 확인되었다. 그러나, 성장 인자의 추가 없이, 콜라겐 에 침입 하지 1 젤 관찰 되었다.

공초점 영상으로, 새싹 직경이 결정되었고 루멘 형성이 확인되었다. 이 방법은 새로운 혈관 유발 억제제를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 당뇨병 망막병증, 류마티스 관절염 및 암에 대하여 새로운 처리를 찾아는 것을 도울 수 있었습니다.

우리는 현재 혈액-뇌 장벽과 혈관 화 된 오르가노이드의 모델을 포함하여 공동 문화를 만들 수있는 방법을 모색하고 있습니다.