Name: 질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 학습하세요 HPLC-MS/MS를 이용한 산화 스트레스 유발 DNA 병변 정량화 방법을. A/J 마우스 폐, 간, 신장 조직에서 8-oxodGuo 및 etheno adduct 수준을 측정하여 환경 오염물질의 DNA 손상 영향을 평가합니다.

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Universidade 및 2012/08616-8 429184/2016-6 454214/2014-6), INCT 나이 라 (Pó-reitas 드 페 스 퀘이 사 다이 라 데 상 파울로), 프라 푸 프 (Pró-이 라이 타로 데 페 사 다스), 트 라이 라 (cccfpq) 2012/22190-3 채찍/파 마/자 위; 573813/2008-6), INCT Redoxoma (대 본) 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; 2011.1.9352.1.8) 및 CEPID Redoxoma 2013/07937-8). (2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) 및 망 토에의 한 장학금을 수 여 받았다 (이에 대 한 자세한 내용은이에 대 한)를 제공 하는 것입니다. M. h. 메 데이 루스, p. 디 마 시 오, p. 에이치. 살 디바, 그리고 p. m. Loureiro는 CNPq에서 펠로 우 십을 받았다.
이 작품에 존재 하는 일부 수치와 표는 원래 올리베이라 A.A.F. et al에 출판 되었습니다. 브라질 상파울로 시에서 집중 된 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)에 노출 된 쥐에서의 유전 독성 및 후에독성 효과. 입자 및 섬유 독성 학. 40 (2018).

저자는 공개 할 것이 없습니다.

HPLC 방법에의 한 8-옥 시 오드 구 오 분석에서 발견 되는 주요 문제점은 dna 추출, dna 가수분해 및 dna 가수분해 물의 농축 과정 중에 그 형성의 유도가22,38이다. 8-옥 시 오 스의 아 티 사실 형성의 문제를 최소화 하기 위하여, 모든 DNA 추출, 저장 및 가수분해 용액에 지연 소 아민을 첨가 하는 것이 좋으며,이는 요오드 화 나트륨의 사용과 DNA 추출 시 페 놀의 회피 방법 및 잘 가수분해 과정에서 100 µ g에 가까운 DNA 양의 사용으로 최종 결과39에 대 한 스 퓨 리 어스 산화의 기여를 최소화 한다. 우리는 DNA 추출을 위한 나트륨 요오드 화 차 열 법의 사용을 제외 하 고, 위에서 인용한 권고를 고려 했다. 대신, 간단 하 게, 우리는 DNA 추출을 위한 상업적인 해결책을 사용 하 고, 사용 하기 전에 그들에 연기 된 아민을 추가 했습니다. 또한...

일부 반응성 산소 종 (ROS)는 산화 된 염기와 DNA 가닥 나누기를 생성 하는 deoxyribose 모이 어 티의 DNA 염기 및 일부 탄소의 탄소 이중 결합을 산화 할 수 있다1. 질소 및 산소 원자가 풍부한 음으로 하 전에 분자 인 dna는 dna 시드와2라고 하는 제품을 제공 하는 친 핵 성 사이트 (질소 및 산소)와 공유 적으로 반응 하는 잔기 그룹의 대상 이기도 합니다. 따라서, dna 시드와 및 산화 된 dna 기지는 잔기 물질의 독성 평가를 위한 유용한 바이오 마커로 서, 생물 변환 시 반응성 전기를 생성 하거나, 산화 적 스트레스를 유발 하는 dna 병변의 예입니다. 2. 변형 된 DNA 염기가 염기 또는 염기 절제 수리 (BER 또는 NER)에 의해 DNA 로부터 제거 될 수 있지만, dna 병 변의 생성 및 제거 사이에 불균형을 유도 하 여 전자에 찬성 하 여 유전자 초과 근무에서 자신의 수준의 순 증가에 이르게 한다3 &lt; /c5 &gt;. 결과는 DNA 변이 율의 증가, 유전자 발현 감소 및 단백질 활성 저하,도4,도6,7등의 효과가 밀접 하 게 관련 되어 있는 질병의 개발. DNA 돌연변이는 세포 신호 전달, 세포 주기, 게놈 완전성, telomere 안정성, 후 성 후 성, 크로마 틴 구조, RNA 스 플라이 싱, 단백질 항상성, 대사 및 세포 분화와 같은 다양 한 세포 기능에 영향을 미칠 수 있다8 ,9. 세포 돌연변이 속도와 만성 질환 발달을 느리게 하는 전략 (예: 암, 신경 퇴행 성 질환)은 그 중 에서도 돌연변이 원의 지식, DNA 병 변 및 그 원인 들을 통과 한다.
오염 물질 노출, 지속적인 염증, 질병 이상 (예: 당뇨병) 등으로 과잉으로 내 시경 적으로 생성 된 ROS는 DNA 및 지질 손상을 포함 한 생체 분자 손상의 중요 한 원인1입니다. 일례로 서, 전이 금속 이온 (Fe2 +, Cu+)에의 한 고 반응성 수산화 라 디 칼 (OH)이 환 원 되어 형성 된 dna 염기, dna 당 모이 어 티 및 고도 불포화 지방산을 산화 시켜 확산 조절 요금10. 80 중에서 이미 특성화 된 산화 된 뉴 클레 아 제3중 가장 많이 연구 된 것은 8 옥 소-7, 8-dihydroguanine 및 8 옥 소 다이 deoxyguanosine이 고, 도 1)에서 GT 트랜스 버전을 유도할 수 있는 병 변 포유류 세포10,11. 구 아닌의 모노 전자 산화에 의해, 또는 DNA1에서 구 아닌의 하이드 록 실 라 디 칼 또는 일 중 항 산소 공격에 의해 형성 된다. 고도 불포화 지방산은 지질 과산화1,12의 과정을 시작 하는 •OH와 같은 반응성이 높은 산화 제의 다른 중요 한 표적입니다. 이는 malondialdehyde, 4 히 드 록 시 니 알, 잔기 에폭시-데 네 날, 헥 센 날, 아크로 라인, 크로 톤 알 데히드 등의 알 데히드와에 폭 시 알데하이드로 분해 될 수 있는 지방산 하이드로 퍼 옥사이드를 상승 시켜 주며 돌연 변이 exocyclic DNA 시드와 (예: malondialdehyde), propano 또는 etheno 시드와1,13등을 형성할 수 있습니다. Deoxyguanosine, εdGuo, 그림 1및1, n 6-εdAdo,그림 1의 경우에는이에 대 한 것을 참조 하십시오 (1, 2-2). )는 염증14,15의 병 리 생리학에서 잠재적인 바이오 마커로 제안 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> 그림 1입니다. 본 연구에서 정량화 된 DNA 병 변의 화학 구조. 박사 = 2 ´-deoxyribose. 이 수치는 올리베이라 외34에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
1980 년대 초반에 수행 된 연구는 전기 화학적 검출 (HPLC-ECD)에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 8 옥 소 오 궈의 민감성 검출을 허용 했습니다. 다 수의 생물학적 시스템에서 HPLC-ECD에의 한 8-옥 소 오드의 정량은 산화 성 유도 염기의 바이오 마커로 서 8 옥 소 오 궈의 인정을 받아 DNA1,16에서 손상 시켰다. 낮은 fmol 범위17에서 8-옥 소 궈의 정량화를 가능 하 게 하 고 견고 하면서 HPLC-ECD 측정은 분석 물질 식별 및 크로마토그래피 분해능에 대 한 분석 물질 보유 시간의 정확성에 의존 하 여 간섭을 방지 합니다. 다른 샘플 성분. 전기 화학적 검출은 이동 상의 염 분 (예: 인산 칼륨, 아세트산 나트륨)을 사용 해야 하므로 적절 한 분석 조건의 유지 보수에는 일상적인 칼럼 및 장비 세척 시간이 필요 합니다.
대안적으로, 세균 DNA 복구 효소 formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG)를 사용 하 고, 그 후, 인간 8-oxoguanine glycosylase의 검출 및 DNA 로부터 8 옥 소 구 아의 제거를 위한 DNA 알칼리의 유도를 위한 방법으로 등장 사이트. 알칼리 성 불안정 부위는 DNA 가닥 분리로 변환 되어 알칼리 단 세포 겔 전기 영동에의 한 8-옥 소 구 아의 매우 고감도 간접 정량화를 허용 한다 ("혜성 분석 법"). 세포 DNA 추출이 필요 없는 높은 민감도와 분석의 성취는 이러한 유형의 분석의 주요 장점입니다. 이는 DNA에서 가장 낮은 정상 상태 수준을 제공 하며, 일반적으로 HPLC를 기반으로 한 생물학적 분석 방법에 의해 얻어진 수준 보다 7-10 배 낮습니다. 그러나, 8 옥 소 구 아의 간접 측정은 몇 가지 단점이 있고 특이성의 결여 또는 수리 효소의 알려지지 않은 효율이1,16,18에 사용 된다.
면역 분석은 8-옥 소 구 아1 및 exocyclic DNA adducts 등의 검출에 사용 되는 다른 일련의 방법으로, 예를 들어 1,엔6-다도 및 1,n2-dado12. 민감도에도 불구 하 고, dna 병 변의 검출을 위한 항 체의 사용의 단점은 정상적인 dna 염기1,12를 포함 하는 생물학적 샘플의 다른 성분 들에 대 한 교차 반응성으로 인 한 특이성의 결여 이다. Exocyclic DNA adducts는 1,n2-dado 및 1,n2-dado를 포함 하 여, 또한 고감도 32P-포스트 라벨링 분석 법에 의해 검출 되 고 정량화될 수 있다. 32P-포스트 라벨링의 고감도는 10 개의 정상 염기19당 약 1 개의 부가 물를 검출 하기 위해 매우 적은 양의 DNA (예를 들어 10 µ g) 를 사용할 수 있게 한다. 그러나, 무선 화학 물질의 사용, 화학적 특이성의 결여 및 낮은 정확도는19,20의 몇 가지 단점이 있다.
상기 언급 된 방법의 공유 제한은 원하는 분자의 검출을 위한 낮은 선택성 또는 특이성 이다. 이 시나리오에서 전기 분무 이온화 탠덤 질량 분 광 법 (HPLC-ESI-MS/MS 및 HPLC-MS3)에 결합 된 HPLC는 DNA, 소변, 혈장 및 타 액과 같은 생물학적 매트릭스에서 변형 된 시드의 정량화를 위한 금 표준으로 발전 했습니다. 1 , 19 , 20. HPLC-ESI의 장점 (통상적으로 낮은 fmol 범위에서) 및 크로마토그래피 분리에 의해 제공 되는 높은 특이성, ii) 분자의 특성 및 공지 된 패턴이 질량 내부 단편화 및 iii) 다중 반응 모니터링 모드에서 선택 된 질량을 충전 비율 (m/z)에 대 한 정확한 측정이1,19. 동위 원소 표지 된 내부 표준의 사용은 DNA 가수분해 및 분석 물 농축 단계 동안 분자 손실에 대 한 교정 뿐만 아니라 샘플 간 분석 물질 이온화의 차이에 대 한 보정의 이점을 추가 합니다. 또한1개,12,19,20이상의 피크가 존재할 때 정확한 크로마토그래피 피크를 식별 하는 데 도움을 준다.
HPLC-ESI/ms에 기초한 몇 가지 방법은 상이한 생물학적 샘플 로부터 추출 된 8 옥 소 오 궈, 1,엔6-다도 및 1,n2-dado의 정량 분석을 위해 사용 되었다12,20 ,21,26,27,28,29 . 미 립 자 (PM2.5)는 염증을 유도할 수 있는 다 환 방향족 탄화수소 (pahs), 니트로 pahs, 알 데히드, 케 톤, 카 르 복 실 산, 퀴 놀 린, 금속 및 수용 성 이온과 같은 유기 및 무기 화학 물질을 운반 합니다. 산화 적 스트레스, 생체 분자 손상 및 질병의 발생을 선호 하는 조건30,31,32,33. 이 하, 본 원에 대 한 평가를 위하여 A/J 마우스의 폐, 간 및 신장 DNA에 8-옥 소 오그의 정량화를 위해 성공적으로 적용된 HPLC-ESI/ms 방법에 대 한 검증을 실시 하 고 있습니다. 앰비언트 PM2.5 노출34의 효과.

<table><tbody><tr><td>[15N5]-2'-deoxyadenosine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-3895-25</td><td></td></tr><tr><td>[15N5]-2'-deoxyguanosine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-3899-CA-10</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>412413000</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 소 장 점막에서 추출한 인산가수분해효소</td><td>Sigma</td><td>P5521</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트</td><td>Merck</td><td>101116</td><td></td></tr><tr><td>송아지 흉선 DNA</td><td>Sigma</td><td>D1501</td><td></td></tr><tr><td>세포 용해 용액</td><td>QIAGEN</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>412653</td><td></td></tr><tr><td>데페록사민</td><td>Sigma</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNase I)</td><td>Bio Basic Inc</td><td>DD0649</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>414542</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-ESI-MS/MS 시스템</td><td>HPLC: Agilent 1200 시리즈&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td><td>HPLC: 바이너리 펌프(G1312B), 등용매 펌프(G1310A), 컬럼 전환 밸브가 있는 컬럼 오븐(G1316B), 다이오드 어레이 검출기(G1315C), 자동 샘플러(G1367C).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ESI-MS/MS: 선형 사중극자 이온 트랩 질량 분석기, 모델 4000 QTRAP.</td><td></td></tr><tr><td>HPLC/DAD 체계</td><td>Shimadzu</td><td>2개의 펌프 (LC-20AT), 광 다이오드 배열 발견자 (DAD-20AV), 자동 주입기 (Proeminence SIL-20AC), 란 오븐 (CTO-10AS/VP)</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 란 (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &micro; m, C18)</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4446-B0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 칼럼 (150 x 2.0 mm 내경, 3.0 &마이크로; m, C18)</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4251-B0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 칼럼 (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &micro; m, C18)</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4252-E0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC C18 경비원 카트리지(4.0 x 3.0mm 내경)</td><td>Phenomenex</td><td>AJO-4287</td><td></td></tr><tr><td>이소 아밀 알코올</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M32658</td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필 알코올 (이소프로판올)</td> <td>카를로 에르바 시약</td><td>A412790010</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>세바</td><td>상업명 : 도팔렌</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>카를로 에르바 시약</td><td>349377</td><td></td></tr><tr>염화<td>마그네슘</td><td>시그마</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carlo Erba 시약</td><td><</td>em>Crotalus atroxSigma P4506 단백질 침전 용액 158912 L022909K7 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포스포디에스테라제 I</td><td></td><td></td> 단백질 분해 효소 K Sigma-Aldrich P2308 리보뉴클레아제 A Sigma R5000 나트륨 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>SPE-C18 (Strata-X)</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S100-TAK</td><td></td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>489983</td><td></td></tr><tr><td>자일라진</td><td>Syntec do Brasil</td><td>상업명: Xilazin</td><td></td></tr></tbody></table>

질량 분 광 법에 의해 3 개의 dna 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Dna 시드와 및 산화 된 dna 기지는 잔기 되는 물질의 독성 평가를 위한 유용한 생물 표지 자, 생물 변환 시 반응성 전자 기적 생성, 또는 산화 적 스트레스를 유도 하는 dna 병 변의 예이다. 산화 된 핵 염기 중에서 가장 많이 연구 된 것은 DNA에 산화 적으로 유도 된 기본 손상의 바이오 마커로 서 8-옥 소-7, 8 dihydroguanine (8 옥 소 구 아) 또는 8 옥 소 다이-deoxyguanosine. 지질 과산화 과정에서 기인 하는 알 데히드 및에 폭 자일로는 잔기 분자 exocyclic DNA 시드와와 같은 돌연 변이를 형성할 수 있게 되는데,이에 노 다 덕트 1,n2-2-deoxyguanosine εdGuo) 및 염증의병 리 생리학에서의 잠재적 바이오 마커로 서 제안 된 1,n6-deoxyadenosine-εdAdo). 세포 돌연변이 속도와 만성 질환 발달 (예: 암, 퇴행 성 신경 질환)을 느리게 하기 위한 예방 전략의 개발에는 DNA에서의 정량화를 위한 선택적이 고 민감한 방법이 필요 합니다. 검출에 사용할 수 있는 민감한 방법 중 (전기 화학적 또는 탠덤 질량 분석 검출기에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피, 혜성 분석 법, 면역 검사 32P-포스트 라벨링) 중에서 가장 선택적인 것은 탠덤 질량 분 광 법에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC-ESI/MS). 선택 성은 DNA, 소변, 혈장 및 타 액과 같은 생물학적 매트릭스에서 변형 된 시드의 정량화를 위한 금 표준으로 진화 된 복잡 한 생물학적 샘플 및 HPLC-ESI/MS를 분석할 때 필수적인 장점입니다. 동위 원소 표지 된 내부 표준의 사용은 DNA 가수분해 및 분석 물 농축 단계 동안 분자 손실에 대 한 교정 뿐만 아니라 샘플 간 분석 물질 이온화의 차이에 대 한 보정의 이점을 추가 합니다. 또한, 둘 이상의 피크가 존재할 때 올바른 크로마토그래피 피크를 식별 하는 데 도움이 됩니다.
우리는 여기에 A/J 마우스의 폐, 간 및 신장 DNA에 있는 8 옥 소 오 궈, 1,6-다도 및 1,n2의 정량화를 위해 성공적으로 적용 된 민감하고 정확 하 고 정밀한 HPLC-ESI/ms 방법을 제시 합니다 앰비언트 PM2.5 노출의 효과 평가.

마우스 간에 서 얻어진 평균 DNA 농도 (±sd), 폐 (~ 0.2 g 조직) 및 신장 (~ 0.4 g 조직)은 각각 5068 ± 2615, 4369 ± 1021 및 3223 ± 723 µ µ L의 최종 부피로 하였다. 정제 된 DNA의 HPLC-DAD에 의해 얻어진 대표적인 크로마 토 그램을 도 3에 나타내 었 다. 해당 2 '-deoxynucleosides 직전에 용 리 RNA ribonucleosides에서 자유로운 4 개의 2 '-deoxynucleosides의 존재는 DNA 순수성을 보여줍니다.
크로마 토 그램에서의 정량화를 위한 HPLC-MS/MS 분석에서의 대표적인 것으로는,도 1,n2 내지 εdAdo 및 εdGuo의 생쥐조직...

우리는 병 변의 민감하고 정확한 정량화를 위한 방법을 여기에 설명 합니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine),1n6조-2-deoxyadenosine 및1, n6조-2dado deoxyguanosine (1,n2-dguo) DNA에. 이 방법은 노출 된 A/J 마우스의 조직 (폐, 간 및 신장)에서 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)의 영향에 대 한 평가에 적용 되었다.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

여기에 제시된 방법은 산화 스트레스에 의해 유도된 DNA 병변의 정량화를 허용하고, 질병의 예방 및 치료를 위한 표적이 될 수 있는 병리학적 메커니즘의 이해에 기여한다. 선택성과 감도가 주요 장점입니다. 선택성은 복잡한 생물학적 샘플로 작업할 때 필수적인 이점입니다.HPLC는 질량 분석과 결합하여 생물학적 행렬과 정량화의 이 모형을 위한 금 표준으로 발전했습니다. 산화 스트레스는 다른 병리학 적 과정에 일반적인 이벤트입니다. 에테노 유도관의 증가 수준은 염증성 질병을 가진 환자의 조직 또는 소변에서 검출되었습니다.DNA 병변은 또한 오염 물질에 노출에 의해 시작 된 내 인 성 이벤트에 대 한 정보를 제공. DNA 병변이 증가하는 경우에, 노출은 암 발달의 리스크를 증가하는 수준에 있을 지도 모릅니다, 예를 들면. 병변은 임의의 세포 시스템에서 DNA에서 정량화될 수 있고 또는 샘플 준비에 적응하는 소변, 혈장, 타액 배양 배지에서 양자화될 수 있다.먼저 얼음 위에 놓인 배양판을 베이스로 사용하여 메스로 조직을 자른다. 각 50 밀리리터 캡핑 튜브에 1 그램의 조직의 무게를 달아 즉시 사용하십시오. 남은 조직을 마른 얼음 위에 보관한 후 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.각 튜브에 0.5 밀리머 deferoxamine을 포함하는 상업용 세포 용액의 10 밀리리터를 추가하고 얼음을 유지하십시오. 조직 균질화제를 약 60~90rpm의 저속으로 설정합니다. 용액이 조직 파편이 없을 때까지 얼음에 있는 조직을 몇 분 동안 균질화합니다.그런 다음 각 균질화 된 샘플에 단백질 AK 용액 150 마이크로 리터를 추가합니다. 반전으로 튜브를 흔들어 하룻밤 동안 실온에서 보관하십시오. 아침에는 40 마이크로리터의 리보누셀리스 A 용액을 추가하고, 반전으로 흔들며, 튜브를 실온에서 2시간 동안 유지합니다.상업용 단백질 강수액 5밀리리터, 소용돌이, 원심분리기 5밀리리터를 2, 000배, 섭씨 4도에 10분간 추가합니다. 초월체를 차가운 이소프로파놀 10밀리리터를 포함하는 50밀리리터 캡 튜브로 이송합니다. 침전된 DNA의 관측이 될 때까지 튜브를 여러 번 부드럽게 반전시면 됩니다.끝에 닫힌 파스퇴르 파이펫을 사용하여 침전된 DNA를 수집합니다. 수집된 DNA를 10밀리머 트리스 버퍼의 4밀리리터와 pH 7에서 1밀리머 deferoxamine을 포함하는 튜브로 전송하여 용해한다. DNA가 튜브에 완전히 용해된 후 각 튜브에 4%이소아밀 알코올을 함유한 클로로폼 용액 4밀리리터를 추가합니다.균질화튜브를 10회 반전시키고, 원심분리기는 2, 000배, 섭씨 4도, 10분 동안, 상면을 새로운 튜브로 옮긴다. 클로로폼 용액으로 상층의 세척을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음, DNA를 침전시키기 위하여 절대 에탄올의 8밀리리터 및 5개의 어금니 나트륨 염화나트륨 용액의 0.4 밀리리터를 추가합니다.다시, 침전 된 DNA를 수집 하 고 70%에탄올의 3 밀리 리터로 전송. 70%에탄올로 한 번 더 씻어내면 됩니다. 에탄올 용액을 조심스럽게 버리고 흡수성 용지에 침전된 DNA를 함유한 튜브를 반전하여 과도한 용액을 제거합니다.15N5 이소토성 표준1, N6-etheno-deoxyadenosine 및 15N5 이소토성 표준으로 DNA 가수분해 샘플을 준비한 후 원고에 따라 N2-에테노 데옥시구아노신의 1, N2-에테노 데옥시구아노신의 15N5 이소토성 표준, 일반 디옥시 뉴클레오의 정량화를 위해 각 샘플의 10 마이크로리터를 튜브로 전송한다. 잔류 볼륨을 고체 위상 추출에 적용합니다. HPLC를 수행하려면 먼저 C18 SecurityGuard 카트리지에 부착된 C18 컬럼을 0.1%의 포믹산 및 메탄올그라데이션으로 처리합니다.그라데이션 프로그램을 0~25분0~ 18%의 메탄올로 설정하고, 25분에서 27분에서 27분에서 0%의 메탄올을 분당 1밀리리터와 섭씨 30도의 유량으로 설정합니다. 그 후, 정상 탈옥 핵분열 정량화를 위해 예약된 각 샘플에 대해 2~6개의 마이크로리터 사이의 부피를 주입한다. 데옥시구아노신과 데옥시아데노신 봉우리의 통합을 위해 DAD 검출기를 260 나노미터로 설정합니다.1, N6-etheno-deoxyadenosine 및 1, N2-etheno-deoxyguanosine의 분석을 위한 고체 상 추출을 수행하기 위해, 먼저 1 밀리리터의 부피로 일련의 솔루션으로 카트리지를 로드합니다. 100% 메탄올, 탈이온수, 가수분해DNA 샘플, 탈량화된 물, 10%메탄올, 15%메탄올, 마지막으로 100% 메탄올을 첨가하여 수집합니다. 그런 다음 원고에 따라 진행합니다.DNA 가수분해 시료 15N5 이소토성 8-옥소-데옥시구아노신을 준비한 후, HPLC-ESI-MS/MS 시스템에서 분석을 위해 각 시료의 80마이크로리터를 바이알로 전송한다. HPLC-UV에 데옥시구아노신의 정량화를 위해 나머지 20 마이크로리터를 예약하십시오. HPLC-ESI-MS/MS에서 8-oxo-deoxyguanosine의 분석을 위해, 분당 150 마이크로리터와 섭씨 25도의 유량으로 용매 A와 B의 그라데이션을 가진 C18 시큐리티 가드 카트리지에 결합된 C18 컬럼 A를 엘테.처음 25분 동안 용매 B의 0~15%, 용매 B의 15~80%, 용매 B의 80% ~28분~ 31분, 용매 B의 80~0%, 31~33분, 용매 B의 0%를 33~46분으로 실행한다. 처음 16분간 의 칼럼 A 용액을 낭비하도록 지시합니다. 조건 열 B분당 150 마이크로 리터의 유량에서 0.1 %의 포름산을 함유 한 물에 15 %의 메탄올의 용액을 가진 등각 펌프에 의한.6분 후 크로마토그램을 확인하여 기둥 A.16~32분 간격동안 밸브를 기둥 A와 기둥 B.클로즈를 32분 만에 분리하여 두 번째 열에서 8-oxo-deoxyguanosine를 포진하여 날카로운 색토메토그래피를 얻을 수 있도록 하는 위치로 밸브를 전환합니다. 1, N6-etheno-deoxyadenosine 및 1, N2-etheno-deoxyguanosine의 분석을 위해, 분당 130 마이크로리터와 섭씨 25도의 유량으로 용매 A와 B의 그라데이션을 가진 C18 SecurityGuard 카트리지에 결합된 C18 컬럼을 엘테.. 처음 10분 동안 용매 B의 0%, 용매 B의 0~20% 0%, 용매 B의 0~20%, 용매 B의 20~75%가 39분에서 41분, 용매 B의 75%가 41분에서 46분, 용매 B의 75~0%, 46분에서 47분까지 용매 B의 75% 및 0%를 40분 간 실행한다.스위칭 밸브를 사용하여 처음 35분 동안 용종의 폐기물을 지시하고 35분에서 42분 분분의 분수를 ESI 소스로 안내합니다. 광고 표준이 설정된 간격의 열에서 엘로트되어 있는지 확인합니다. 8-oxo-deoxyguanosine 의 봉우리 통합 15N5 8-oxo-deoxyguanosine의 동위 원가 표준, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 15N5 이소성 표준 1, N6-에테노 데옥시아데노신, 1, N2-에테노 데옥시구아노신, 15N5 이소토성 표준 1, N2-에테노 데옥시오시오신 1, N2-에테노 데옥시오시오신교정 곡선 및 샘플의 면적 비율을 계산합니다. 교정 곡선을 설정하고 각 주입된 샘플에서 병변의 양을 계산합니다. HPLC-UV 분석에서 데옥시구아노신과 데옥사데노신의 피크를 통합합니다.이 영역을 사용하여 교정 곡선을 설정하고 각 주입된 샘플에서 동물에서 데옥시구아노신 과 데옥사데노신의 양을 계산합니다. 데옥시구아노신을 통해 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine 위에 데옥시아데노신, 그리고 1, N2-에테노 데옥시구아노신 을 통해 데옥시구아노신을 계산하여 100만 원당 병변수를 산출합니다. HPLC-UV에 의해 얻어진 정제된 DNA의 대표적인 크로마토그램은 DNA 순도를 보여주는 RNA 리보뉴클레오시드로부터 자유로운 4개의 정상 탈옥핵의 존재를 나타낸다.8-oxo-deoxyguanosine의 HPLC-ESI-MS/MS의 대표적인 크로마토그램, 1, N6-에테노 데옥시아데노신, 및 1, N2-에테노-데옥시구아노신 마우스 조직 DNA 샘플에서 의 대표적인 크로마토그램이 나타났다. UV 검출으로 얻은 크로마토그램은 첫 번째 컬럼에서 약 10분까지 4개의 정상 탈옥핵을 보례하며, 8-oxo-deoxyguanosine로부터 좋은 분리를 하여 원치 않는 간섭을 제거합니다. 정확한 정량화를 기억해야 할 중요한 것은 교정 곡선 및 샘플의 주입 볼륨에서 항상 동일한 양의 내부 표준을 갖는 것입니다.여기에 제시된 방법은 다른 변형된 탈옥핵세포의 정량화를 위해 적응될 수 있다. 수정 된 탈옥 핵체의 밴드를 확장하면 기본 병리학 적 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 우리는 xenobiotics, 당뇨병 및 세포 악성 변환에 노출과 같은 다른 상황에서 산화 손상의 역할을 조사할 수 있습니다, 따라서 예방 및 치료 전략의 발달을 원조.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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