Name: 모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 알파-시뉴클레인 모노머로부터 미리 형성된 섬유소를 생성하고 품질 관리를 수행하는 방법을. 이 프로토콜은 파킨슨병 모델에서 생체 내 병리 형성을 위한 표준화된 기술을 제공합니다.

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이 연구는 마이클 j. 폭스 재단의 보조금에 의해 지원 되었다, 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소 (NS099416) 그리고 웨스턴 브레인 연구소.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
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<li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li>
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</ol>

조셉 패터 슨, 켈빈 룩, 카 릴 소 트 웰은 현재 마이클 j. 폭스 재단과의 계약 약정에 관여 하 고 있으며,이는 프로 테 노스에 의해 생성 된 품질 관리 α-syn 소재 인 니콜 포린스키, 마이클 j. 여우의 직원입니다 Α-syn 단량체를 생산 하기 위해 프로 테아, Inc.를 계약 한 재단. 코 저자 메 간 더 피,로 라 볼 피 넬리-데일리, 그리고 니콜라스 Kanaan는 공개 할 것이 없습니다.

뉴런을 시드 할 수 있는 α-syn PFFs의 생산과 Lewy 바디와 같은 개재 물로 이어지는 것은 여러 요인 및 단계에 따라 달라 집니다. 중요 한 요인은 섬유 소를 생성 하는 데 사용 되는 단량체가4,9,14,15에 대 한 구체적으로 공식화 될 필요가 있다는 것 이다. 모노 머가 섬유 화를 위해 공식화 되지 않는 경우에, 피 브 릴은 형성 되지 않거나 형태를 이루는 섬유 소는 α-syn 병리학을 생성 하지 않을 수 있습니다. 마찬가지로, 단량체가 있는 완충 액도 섬유 화에 영향을 미친다. 이와 같이, 최상의 결과를 위해, 염 농도는 7.0 및 7.3 사이의 약 100 mM 염화 나트륨 및 pH 이어야 한다. 변동성을 소개 하는 초기 단계는 초기 단백질 함량이 결정 되는 방법 이며, A280에서의 측정은 보다 정확한 결과를 생성 할 가능성이 있으므로 선호 되는 방법입니다. 단백질 농도의 불일치는 피 섬유 화 공정의 효능을 저하 시킬 수 있을 뿐만 아니라 실험에 사용 되는 가정 된 PFF 농도를 변경할 수도 있다. 둘 다 실험 간의 시드 효율성과 배치 변이의 감소로 이어질 수 있습니다.
초기 품질 관리 단계는 PFFs의 중요 한 특징을 확인 하 고 (전자 현미경) 아 밀 로이드 구조 (thioflavin T 분석)를 포함 하 고 펠 렛 테이블 (침전 분석)입니다. Thioflavin T 검정의 결과는 시간에 따라 변동 하 고 존재 하는 아 밀 로이드 구조물의 양의 직접적인 측정이 아니라는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다, 오히려, thioflavin T 분석은 내에서 아 밀 로이드 구조 존재의 지표로 서만 사용 되어야 합니다 샘플입니다. Thioflavin T는 통상적으로 상기 피 브리 스가 아 밀 로이드 구조를 함유 하는 것을 보여주기 위해 전술한 검정 법과 같은 시험관 내 분석에 사용 된다. 대안적으로, thioflavin S는 도 7에 도시 된 바와 같이 아 밀 로이드 구조를 검출 하기 위해 조직에서 사용 된다. 침 강 분석에 관해서, 결과는 PFFs가 펠 렛 테이블 분 획에서 주로 발견 되는 것만을 보여준다. 샘플이 변성 조건에서 실행 되기 때문에 α-syn 단량체의 크기 인 약 14 kDa의 단일 눈에 띄는 밴드가 젤에 존재 합니다. 이것은 기본 또는 비 변성 젤을 사용 하는 경우 PFFs에 예상 되는 더 높은 분자량에 존재 하는 다중 밴드와는 달리입니다. 마지막으로, 이러한 모든 초기 품질 관리 단계를 성공적으로 통과 하는 것은 α-syn 포함 시드 작업을 보장 하지 않습니다. 이러한 이유로, 세포 배양 실험 또는 외과 적 주사 동물의 작은 집단은 큰 실험에서 사용 하기 전에 PFFs의 효능을 시험 하기 위해 사용 되어야 한다.
초음파 처리는 공정에서 중요 한 단계 이며 매개 변수는 사용 되는 초음파 분쇄기의 모델에 따라 다를 것입니다. 초음파 매개 변수를 적용 하 고 짧은 PFF 조각이 생성 되었음을 보여주기 위해 확인 해야 합니다. 피 브 릴 크기는 파 종에 베어링이 있으며, 짧은 섬유 소를 더 효율적으로 시 딩 합니다. 짧은 섬유 소는 더 효율적으로 종자 이지만,이 효과 고원 및 최적의 pff 길이는 약 50nm 이다. 샘플을 지나치게 초음파 처리 하 고 PFFs에 과도 한 열을 노출 하지 않는 것도 중요 합니다 .이는 시드 효율을 저하 시킬 수 있습니다. 이러한 초음파 처리 된 PFFs는 대규모 실험에서 사용 하기 전에 작은 세포 배양 또는 생체 내 실험에서의 효능에 대해 시험 되어야 한다. 다른 초음파 세션은 가변성을 소개 할 수 있는 잠재력을가지고 있기 때문에 실험적 치료 그룹을 계획 해야 합니다.
Pffs를 생체 내에서 전달 하는 경우, 주사 부위 (들) 및 사용 된 총 양의 pffs의 국 소화는 신경 변성7,14의 정도 뿐만 아니라 개재 물을 개발 하는 뉴런의 수에 영향을 미칠 수 있다. 프로토콜의 좌표는 시작 하는 장소를 제공 하지만, 대규모 실험에서 사용 하기 전에 원하는 표적 지역이 α-syn 병리학을 개발 하도록 하기 위해 실험실 내에서 테스트 되어야 합니다. 원한다 면, 추적 염료 또는 형광 구슬 PFFs를 사용 하기 전에 지역 타겟팅을 테스트 하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 생체 내에서 사용 되는 pffs의 양은 그룹 마다 다르며, 대부분의 그룹은 pffs의 5 ~ 20 µ g 사이에 총을 사용 하 여 2 개의 주사 부위1,2, 3,5 사이에서 나누어 , 6 , 7 , 14. 주사 사이트의 수, 주사 부의 위치, 주입 된 pffs의 양은 시 핵 병의 결과 및 진행 성에 영향을 미칠 수 있으므로, 사용 되는 파라미터의 다운스트림 결과는 모델을 사용 하기 전에 특성화 되어야 잠재적인 개입을 테스트 하거나 모델의 임시 기능을 검사 합니다.
치료법을 시험 하거나 질병 진행을 연구 하는 데 사용할 모델을 선택할 때, 사용 된 모델을 선택 하 여 질문에 가장 잘 대답 합니다. 모든 모델이 PD의 특정 질병 기능을 소유 하거나 잠재적인 개입을 테스트 하는 데 필요한 기간을 제공 하지는 않습니다. PFF 모델은 α-syn 병리학 및 신경 퇴행과 같은 PD의 주요 특징을 탈환 하며, 겸손 한 운동 장애로 이어질 수 있습니다. 이 모델은 예측 가능 하 고 일정 한 시간 과정을 제공 하며, 신경 변성을 위해 몇 달 동안 개재 물이 형성 됩니다. 이를 통해 연구원은 시 핵 병의 진행 과정 전반에 걸쳐 여러 단계를 검토 하 고 악용할 수 있습니다. 전반적인 모델의 현재와 미래의 사용은 질병 진행 및 새로운 치료법의 개발에 도움이 될 것으로 예상 된다.

파 킨 슨 병 (PD)은 주로 두 가지 주요 병리학 적 특징에 의해 사후 치료를 특징으로 합니다: 광범위 하 고 진보적인 알파 시 뉴 신 (α-syn) 병리학 및 니로 트리 아 변성. 야생 형 쥐 또는 쥐에 주입 다음, α-syn 미리 형성 된 섬유 소 (pffs)는 병리학 적 α-syn의 진보적 인 축적을 유도 하 여 많은 과정을 거쳐 입증 된 니 그 라 파르스 compacta (snpc) 도파민 뉴런의 프로톤 화 변성을 유발할 수 있습니다. 뿐만 아니라, 센 소리 모터 적자의1,2,5,6. 뉴런은 직접 뇌 내 주입을 통해 또는 배양 된 뉴런의 매체에 첨가 된 α-syn 섬유 소에 노출 됩니다. Pffs가 뉴런으로 촬영 될 때, pffs는 템플릿 화를 통해 개재 물의 형성을 "종자" 하 고, 내 인 성 α-syn을 인 산화 된 개재물에 축적 하는 작용을 하 고,7,8 9. 포함은 Lewy 바디에 유사한 속성을 공유 합니다: 세 린 129 (pSyn), 유비퀴틴 및 p62에서 α-syn 인 산화 된을 함유 하 고; 긍정적인 thioflavin 염색과 같이 아 밀 로이드 4 급 구조물을 소유 하십시오; 그리고 프로 테이 지 K 소화에 대 한 내성이 있고, 제1,제5,8,10,11 12. Pff 노 광은 마우스, 랫 트 및 비 인간 영장류에서의1차 및 일부 불멸 화 뉴런에서의 α-syn 포 접 형성에 이르게 한다. 6,8,9,13. PFFs는 모든 세포 배양 모형에 있는 α-syn 포용 형성으로 이끌어 내지 않으며 몇몇 배양 한 신경은 다른 사람 보다는 더 나은 종자 것을 주의 하는 것이 중요 합니다.
생체 내 α-syn PFF 모델의 또 다른 중요 한 특징은 몇 달에 걸쳐 출현 하는 뚜렷한 순차적 병리학 적 단계 이다. 설치류에서, 흉 골 내 주사 다음, α-syn 포함 형성은 일반적으로 SNpc 및 많은 대뇌 피 질의 영역 내에서 1-2 개월 이내에 피크. 이 응집 피크는 ≈ 2-4 개월 후에 니로 터의 변성에따른다. 이러한 뚜렷한 병리학 적 단계는 연구원에 게 1) α-syn 응집을 감소 시키는 전략을 연구 하 고 개발할 수 있는 플랫폼을 제공 하며, 2) 이미 형성 된 α-syn 개재 물 및/또는 3) 후속 신경 변성을 방지 합니다. PFF 모델은 이전에 검토 된 바와 같이 신경 독성, 형질 전환 및 바이러스 벡터 매개 α-syn과 발현 모델과 비교 하 여 뚜렷한 장점과 단점을 제공 한다6. 어떤 모델이 나 접근법을 선택 하는 것은 구도 자가 묻는 질문에 가장 적합 한 모델에 의해 결정 되어야 합니다.
PFF 모델은 많은 실험실에서 성공적으로 활용 되었지만, 섬유 소 생성 및 일관 된 α-syn 병리학의 생성과 불일치를 경험한 여전히 그룹이 있습니다. 불일치의 예로는 α-syn 병리학을 거의 또는 전혀 생성 하지 않는 PFFs의 범위, 회분 식 시 딩 시 효율성, 심지어 피 브 릴의 형성 실패 등이 있습니다. 따라서, α-syn PFF 생성 및 생체 내 적용의 표준화는 신규 한 치료 적 개입의 영향에 관한 정확한 해석을 허용 하기 위해 중요 하다. 다음의 프로토콜은 α-syn 단량체 로부터 PFFs의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하 고, PFFs의 시험관 내 품질 관리는 일단 형성 되 고, 사용 전에 PFFs의 초음파 처리 및 측정 하 고, 성공적인 생체 내 주입을 용이 하 게 하기 위한 제안 쥐 또는 마우스에 PFFs.

<table><tbody><tr><td>1x 둘베코 s 인산염 완충 식염수</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>안티 알파 시누클레인 (세린 129에서 인산화) 항체</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>안티 알파 시누클레인 항체</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchonic acid</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>투명 의료 수축 튜브 (0.036 "내경)Nordson</td><td> Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>투명 의료용 수축 튜브(0.044" 내경)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Copper sulfate</td><td>Thermo Fisher(Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop heated lid</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon coated 전자 현미경 그리드</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 (외경 0.53mm, 내경 0.09mm, 길이 54mm)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>유리 바늘 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>인간 알파-시누클레인 단량체로 미리 형성된 원섬유</td><td>를 생성합니다.Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>마우스 알파-시누클레인 단량체로 미리 형성된 원섬유를 생성합니다</td>.<td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>주황색 의료용 수축 튜브(0.021" 내경)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica 3.2mm 팁</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr>, <tr><td>Qsonica Q125, 초음파 발생기</td>, <td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr>, <tr><td>티오플라빈 S,</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1892</td><td></td></tr>, <tr><td>티오플라빈 T</td><td>, EMD, Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr>, <tr><td>ToxinSensor 발색 LAL 내독소 분석 키트</td>, <td>Genscript</td><td></td> L00350C <td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Eletron 현미경 과학</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

생체 내 알파-시 뉴 핀 (α-syn PFF) 모델의 시 뉴 트리 트의 사용은 파 킨 슨 병 질환 및 근 병 변성을 모델링 하는 것을 목표로 연구자 들 사이에서 인기를 얻고 있다. Α-syn PFF 생성 및 생체 내 적용의 표준화는 일관 되 고 강력한 α-syn 병리학을 보장 하기 위해 매우 중요 합니다. 여기서, 우리는 단량체 성 α-syn, 후 섬유 화 품질 관리 단계 및 쥐 또는 마우스에 α-syn PFFs의 성공적인 신경 외과 주입을 위한 제안 된 매개 변수 로부터 피 브 릴의 생성을 위한 상세한 프로토콜을 제시 한다. 단량체 성 α-syn을 시작으로, 섬유 화는 최적의 완충 조건, 농도 및 온도에서 흔들리는 동안 7 일간의 인큐베이션 기간 동안 발생 합니다. 후 섬유 화 품질 관리는 침전 분석을 통해 펠 렛 테이블 섬유 소의 존재에 의해 평가 되며, thioflavin T 검정 법으로 피 브 릴에서 아 밀 로이드 입체 형성을 형성 하 고, 섬유 소의 전자 현미경을 시각화 합니다. 이러한 분석 법을 이용한 성공적인 검증이 성공에 필요한 반면, 각 PFFS 배치의 응집 활성이 세포 배양 또는 파일럿 동물 집단에서 시험 되어야 하므로 PFFs가 뉴런에 α-syn 개재 물을 종자 할 것을 보장 하기에 충분 하지 않다. 사용 하기 전에 PFFs는 정밀 하 게 표준화 된 조건 하에서 초음파 처리 되어야 하며, 그 다음에는 전자 현미경 또는 동적 광산 산란을 사용 하 여 피 브 릴 길이가 최적의 크기 범위 내에 있는지 확인 하 고 평균 길이는 50 nm입니다. PFFs는 세포 배양 배지에 첨가 되거나 동물에서 사용 될 수 있다. 인 산화 된에 대 한 면역 염색에 의해 검출 가능한 병리학은 α-syn (psyn; 세 린 129)은 세포 배양 및 설치류 모델 각각에서 며칠 또는 몇 주 후에 명백 하다.

Α-syn 단량체 로부터의 소 섬유의 생성은 단량체의 농도를 결정 하는 것으로 시작 한다. BCA 분석 및 280 nm (A280)에서 흡 광도의 측정은 단백질 함량을 측정 하는데 사용 될 수 있다; BCA 분석 결과는, 그러나, A280 방법 보다는 더 높은 농도를 제안 했습니다. 마우스 α-syn 단량체 로부터 유도 된 PFFs는 14.05 ± 0.22의 BCA 값을 가지 며 8.05 ± 0.03 µ µ L의 A280을 가졌다 (도 1). 마찬가지로, 인간 α-syn 단량체 로부터 유도 된 PFFs도 높은 농도에서 12.95 ± 0.38의 BCA 값과 7.83 ± 0.05 µ µ L의 A280으로 나타났다 (도 1). A280 측정은 소멸 계수의 포함에 기초 하 여 α-syn에 특이 적 이며 이러한 결과는 7 일 인큐베이션 전에 단량체를 희석 시키기 위해 사용 하였다.
인큐베이션 전에, α-syn 단량체를 포함 하는 액체는 분명 하지만, 피 브 릴 형성 후에 혼 탁 하 게 나타나야 한다. 투과 전자 현미경 검사는 10-20 nm 폭을 측정 한 긴 섬유 소의 존재를 확인 했습니다 (그림 4). 이에 비해 α-syn 단량체는 겉보기에 눈에 띄지 않는 모양으로 보이지 않았다 (그림 4). Fibrillar 구조에 대 한 시각적 확인을 통해, 피 브 릴의 아 밀 로이드 형태는 thioflavin T 검정을 사용 하 여 확인 해야 하는 PFFs의 다음 기능입니다. Thioflavin T는 아 밀 로이드에 결합 될 때 향상 된 형광을 나타낸다; 따라서, 샘플 로부터의 증가 된 형광 신호는 아 밀 로이드의 존재를 나타낸다. 일례로 서, dPBS는 3287 ± 580의 상대 형광 단위 (RFU)의 신호를 생성 하 고, 마우스 α-syn 단량체는 4174 ± 158 RFU의 신호를 생성 하 고, 마우스 PFFs에는 59754 ± 6224 RFU의 신호를 thioflavin 하였다 (도 5). 이와 비교 하 여, 인간 α-syn 단량체는 마우스 모노 머에 4158 ± 105 RFU의 유사한 신호를 생성 하 고, 휴먼 PFFs는 마우스 PFFs에 비하여 1235967 ± 113747 RFU의 높은 신호를 생성 하였다 (도 5). 펠 렛 테이블 섬유 소의 존재를 평가 하기 위해 침전 분석을 수행 하였다. 소 릴은 원심 분리로 펠 렛을 합니다. 마우스 및 인간 PFF 샘플 모두에서, 상층 액 분 획 물은 상 등 액 보다 펠 렛에 더 많은 단백질을 가져야 한다 (도 6). 대조적으로, 대부분의 마우스 및 인간 단량체 로부터의 단백질은 펠 렛 내에 거의 존재 하는 상 청 액에 존재 하였다 (도 6). PFFs가 전자 현미경, 아 밀 로이드 구조 존재 및 피 브 릴 펠 렛 테이블에 의해 가시적으로 존재 하는 PFFs는 모든 시험관 내 품질 관리 단계를 통과 시켰다.
마우스 및 인간 pffs 모두는 α-syn 개재 물4,18의 시드를 위한 적절 한 길이의 pffs를 생성 하도록 초음파 처리 되었다. PFFs는 4 µ g/µ L의 원하는 농도로 희석 하 고 초음파 처리 하였다. 수술 직전에, 25 개 대표적인 피 브 릴을 전자 현미경으로 이미지화 하 고 피 브리 실 크기를 스폿 체크 하는 것으로 측정 하였다. 초음파 처리 된 마우스 PFFs는 48.8 ± 3.1 nm를 측정 하는 반면, 인간 PFFs의 길이는 52.1 ± 4.4 nm 이다. 두 종의 PFFs는 따라서 적절 한 길이 (50 nm이 하)가 시드 활성을 유도 하였다. 약 500 섬유 소의 보다 포괄적 인 검사는 초음파 처리 된 마우스 섬유 소의 평균 길이 및 길이 분포를 밝혀 내었다. 평균 길이는 44.4 ± 0.6 nm이 고, PFFs 측정의 86.6%는 60 nm이 하 이다 (그림 4). 이에 비해, 휴먼 pffs의 평균 55.9 ± 1.1 nm 미만의 69.6%의 pffs 60 측정을 하였다 (도 4).
앞서 설명한 바와 같이 쥐에 초음파 처리 된 마우스 pffs의 내분 비 주입 후,5, 일련의 조직 절편을 2 개월 후에 수술 후, 신경 세포를 포함 하는 포함의 수가 피크로 알려져 있는 경우 SNpc는 인 산화 된 α-syn 개재 물의 확인을 위해5. 포함 베어링 뉴런은, pSyn ( 물질의 테이블에 있는 항 체)에 대 한 면역 조직 염색에 의해 지시 되는 바와 같이 Snpc (도 7) 내에 존재 하 고, 뿐만 아니라 다른 지역 들을 신경 자극 하는 뇌를 통하여 (전방 후 각 핵, 모터, 대뇌,이 상근, prelimbic, 체 감각, entorhinal 및 인 술 관 류, 복숭아 류, 편도,19. 이러한 개재 물 들이 면역 조직 화학 염색 ( 물질의 테이블에 있는 항 체 및 프로 테이 나 제 k)에 의해 나타낸 바와 같이, thioflavin의 결합, 및 프로 테이 나 제 k에 대 한 총 α-syn과 같은 lewy 체와 유사한 성질을 공유 한다 (도 7) . 뇌 내에서의 시 딩의 확인은 생체 내 품질 제어가 통과 되었으며, 동일한 배치 로부터 이전에 동결 되 고 저장 된 PFFs의 분 취 액은 동일한 매개 변수 하에서 초음파 처리 될 수 있으며, 길이는 더 큰 실험에서 검증 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> 그림 1 . Α-syn 섬유 소의 생성을 위한 방법. Α-syn 단량체 로부터 섬유 소를 생산 하는 데 필요한 단계의 윤곽. 단량체는 10 분 (15000 x g, 4°c에서) 동안 원심 분리 된다. 상 청 액은 깨끗 한 튜브로 이송 되 고 단백질 농도는 280 nm에서의 흡 광도 또는 BCA 분석 법에 의해 결정 된다. 그래프는 인간 및 마우스 α-syn 단량체의 농도를 나타낸다. 열은 그룹 평균을 나타내며 오차 막대는 평균의 ± 1 표준 오차를 나타냅니다. 단백질 농도가 결정 된 후에, α-syn 단량체는 1000 RPM으로 설정 된 궤도 혼합기 상에 서 흔들어 주면서, 37 ° c에 대 한 간단한 보 텍 싱 및 7 일 동안 인큐베이션 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> 그림 2 . 투과 전자 현미경에 대 한 염색 방법. 전자 현미경에 대 한 부정적인 얼룩의 다이어그램. A) 전자 현미경 견본 격자를 묘사 하는 심상. 그리드는 무딘 또는 밝은 측면과 반짝 또는 어두운 면이 있습니다. 광택/어두운 면은 formvar/카본 지지 필름으로 코팅 되어 있습니다. B) 염색 절차의 그림. 격자는 1 분 동안 ddH2의 첫 번째 방울에 반짝/어두운 면이 아래로 떠 있고 과량은 여과 지에서 사악 합니다. 이 공정은 ddH2, 희석 된 pffs 또는 단량체의 두 번째 방울, 우 라 닐 아세테이트 2 방울이 함께 반복 되며, ddh2의 추가 방울은 이미지 될 때까지 그리드 박스에 저장 될 수 있다. 스케일 바 = 3mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> 그림 3 . 사용자 정의 유리 바늘 주사기의 조립. 유리 바늘 부착 주사기를 조립 하는 데 필요한 단계의 다이어그램. 규소 화 유리 모 세관은 유리 바늘을 생산 하는 중간에 뽑아 절단 된다. 수축 포장 튜브는 금속 바늘을 준비 하 고 유리 바늘이 금속 바늘에 슬라이딩 될 때 내부 씰을 형성 하는 데 사용 됩니다. 유리 바늘과 금속 바늘의 염기와 겹치는 수축 포장 튜브의 2 개의 추가 층이 연속적으로 첨가 되 고 열이가 해지면 유리 바늘을 고정 하 고 방수 밀봉을 형성 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> 그림 4 . 투과 전자 현미경을 통한 α-syn 단량체 및 α-syn 섬유 소의 가시화 . Α-syn 단량체 및 소 섬유의 대표적인 마이크로 그래프. 상단 패널: 마우스 및 인간 α-syn 단량체. 중간 패널: 전체 길이 마우스 및 인간 α-syn PFFs. 하단 패널: 초음파 처리 후 마우스 및 인간 α-syn PFFs. 하단 그래프: 초음파 처리 된 마우스 및 인간 α-syn 길이의 분포. 스케일 바 = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> 그림 5 . Thioflavin T 분석에의 한 아 밀 로이드 구조의 확인. 마우스 및 인간 α-syn 단량체 및 PFF 샘플 로부터의 형광 신호 측정. 왼쪽: 마우스 α-syn 단량체 및 α-syn PFFs의 결과. 오른쪽: 인간 α-syn 단량체 및 α-syn PFFs의 결과. DPBS 네거티브 컨트롤은 각 그래프에 표시 됩니다. 모든 측정은 상대 형광 단위 (RFU)로 표현 됩니다. 열은 그룹 평균을 나타내며 오차 막대는 평균의 ± 1 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> 그림 6 . 펠 렛 테이블 α-syn에 대 한 침전 분석 . 코 마 시디 스테인드 젤의 이미지. 표시 된 밴드는 단백질 사다리를 기준으로 약 14 kDa입니다. 왼쪽: 마우스 모노 머와 PFFs. 오른쪽: 인간 단량체 및 PFFs. 모든 단량체 및 PFF 샘플에 대해, 재현 탁 펠 렛 (P) 및 상 등 액 (들)이 도시 되어 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> 그림 7 . Α-syn 병리학을 확인 하는 쥐 모델의 개재 물 특징. Compacta에서의 대표적인 마이크로 그래프는 2 개월 후 주입 후에는 니 그 라 파스를 통해 서 나타난다. 왼쪽: pSyn을 포함 하는 뉴런 및 cresyl 바이올렛으로 반격. 중간: Thioflavin S 양성 뉴런. 오른쪽: α-syn 함유 프로 테이 나 제 k. 스케일 바에 내성 = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 기사의 목표는 단량체 성 알파-sy뉴 클레 인, 후속 품질 관리 및 생체 내에서 미리 형성 된 섬유 소의 사용 으로부터 피 브 릴의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하는 것입니다.

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

알파-시뉴클레인 미리 형성 된 Fibril 모델은 synucleinopathies를 공부하기 위해 전 세계 실험실에서 사용되고 있습니다. 이 모델은 많은 실험실에서 성공적으로 사용되었지만 일부 그룹은 피브릴을 생성하고 일관된 알파 시뉴클레인 병리학을 생성하는 불일치를 경험했습니다. 우리는 알파 시뉴클레인 단음체에서 피브릴의 생성과 생체 내 사전 형성 된 섬유의 사용을 자세히 설명이 프로토콜이 프로토콜의 사용에 대해 연구자 가지고 질문에 대답 할 수 있기를 바랍니다.알파-시뉴클레인 사전 형성 된 피브릴 모델은 알파 시뉴클레인 병리학 및 신경 변성과 같은 파킨슨 병의 주요 특징을 재구성합니다. 그리고 그것은 일부 동물 모델에서 겸손한 모터 장애로 이어질 것으로 나타났습니다. 인산화 된 알파-시뉴클레인과 신경 변성을 향한 연장 된 시간 과정을 포함하는 포함 된 포함의 형성은 연구원에게 synucleinopathy의 진행을 통해 다른 단계를 제공, 연구 하고 잠재적인 치료 개입에 대 한 대상.사용자 정의 유리 바늘의 준비를 시연, 우리의 실험실 기술자입니다, 크리스토퍼 켐프. 이 절차를 시작하려면 얼음에 알파 시뉴클레인 단량체를 해동하십시오. 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어가서 해동된 단조로움을 다시 감쇠시켰다.그리고 원심분리기는 15, 000g, 섭씨 4도에서 10분 동안. 이어서, 상체를 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 이송하고 전송된 양을 기록한다. 1x dPBS로 단조체를 1x dPBS로 희석하여 mL당 5 mg의 최종 농도로 희석합니다.간략하게 소용돌이가 섞이고, 간략하게 원심분리기를 사용하여 튜브 바닥의 모든 액체를 수집합니다. 다음으로 접착제 필름을 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브 뚜껑을 닫습니다. 튜브를 1, 000 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 7일 동안 뚜껑을 닫은 궤도 열 믹서에 넣습니다.7 일의 끝에서, 튜브의 내용은 탁탁으로 표시해야합니다. 첫째, 장갑, 실험실 코트 및 얼굴 방패를 포함하여 필요한 모든 개인 보호 장비를 착용하십시오. 그런 다음, 세포 배양 후드에서, 컨버터에 3.2 mm 직경 프로브를 부착한다.초음파 차단기 진폭을 30 %로 설정하고 펄스를 1 초 및 1 초 끄고 1 분으로 펄스합니다. 실온에서 피브릴을 해동하고 문화 후드에 있는 동안 멸균 dPBS로 피브릴을 희석시하십시오. 다음으로, 70%에탄올로 실험실 조직을 약화시키고 이를 사용하여 초음파 처리기의 프로브를 닦아 청소하십시오.프로브의 끝을 이중 분수물에 담그고 10번 펄스하여 프로브를 더 청소합니다. 그 후, 실험실 조직으로 프로브건조를 닦아냅니다. 청소된 프로브 팁을 희석된 피브릴튜브에 넣고 팁을 튜브 바닥에 놓습니다.각 펄스 동안 프로브를 위아래로 이동하면서 이전에 설정된 매개 변수를 사용하여 희석 된 피브릴을 초음파 처리하여 액체의 모든 피브릴이 초음파 처리되도록합니다. 초음파 처리 후, 튜브의 측면에서 모든 액체를 수집하는 2, 000g에서 1 초 동안 간략하게 원심 분리기. 프로브 팁을 1% SDS로 침수하고 프로브를 청소하기 위해 10번 펄스합니다.그런 다음, SDS에서 팁을 제거하고 이중 증류수에 담근 후 10번 펄스합니다. 70%에탄올로 감쇠된 실험실 조직으로 프로브를 닦고 건조한 실험실 조직으로 말리십시오. 변환기에서 프로브를 분리하고 저장합니다.그 후 후드의 모든 표면을 1%SDS로 닦아내고 70%에탄올이 뒤를 따릅니다. 먼저 실리콘 유리 모세관 튜브를 유리 바늘 풀러에 넣습니다. 가열 요소를 켜고 부착 된 무게가 가열 된 유리 모세관 튜브를 스트레칭 할 수 있습니다.다음으로 가위를 사용하여 중간에 가장 얇은 지점에서 당겨진 유리 모세관 튜브를 자르고 유리 바늘 풀러에서 유리 바늘을 제거합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 수축 랩 튜브의 길이를 약 40mm로 자른다. 수축 랩을 10 마이크로리터 의 금속 바늘 위에 밀어 주사기를 휘청거.열을 가열하고 바늘에 수축 랩을 부착하는 열 화염을 사용, 열을 균등하게 적용하기 위해 바늘을 회전해야합니다. 끌어당겨진 유리 바늘의 큰 끝을 주사기의 금속 바늘 위에 조심스럽게 밀어 낸다. 그 후, 수축 랩 튜빙의 길이를 약 40mm로 자르고 유리 바늘 위에 조심스럽게 밀어 유리 바늘의 베이스와 주사기의 금속 바늘을 겹쳐냅니다.금속 바늘에 유리 바늘을 고정하기 위해 수축 랩을 가열하는 불을 사용합니다. 바늘을 더욱 보호하고 잠재적 누출을 방지하기 위해 수축 랩 튜브의 추가 길이를 약 40mm로 자르고 유리 바늘과 주사기의 금속 바늘의 베이스를 겹치기 위해 유리 바늘 위로 조심스럽게 밀어 냅니다. 금속 바늘에 유리 바늘을 고정하기 위해 수축 랩을 가열하는 불을 사용합니다.그런 다음 가위를 사용하여 유리 바늘을 다듬어 팁이 약 8mm 길도록 합니다. 바늘을 테스트하려면 1 mL 주사기를 증류수와 함께 부착 된 26 게이지 바늘로 채웁니다. 사용자 정의 유리 바늘 주사기에서 금속 플런저를 제거하고 사용자 정의 주사기의 베이스에 물 채워진 주사기의 바늘을 삽입합니다.유리 바늘과 금속 바늘의 계면을 검사하여 누출을 검사하고 꾸준한 물 흐름을 확인합니다. 그런 다음 마이크로 원심 분리기 튜브를 증류수로 채웁니다. 사용자 정의 유리 바늘 주사기를 사용하여 증류수에 그립니다.바늘을 검사하여 액체가 주사기로 옮겨지고 있으며 거품이 없음을 확인합니다. 거품이 있거나 물이 바늘에 그려지지 않는 경우 바늘을 트리밍하면 압력을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그 후, 수술에 필요할 때까지 부착 된 유리 바늘로 주사기를 조심스럽게 보관하십시오.전송 전자 현미경 검사로 검사는 긴 섬유의 존재를 확인합니다. 이에 비해, 알파 시뉴클레인 단량체는 보리를 볼 수 있으며 눈에 띄는 모양이 없습니다. 그런 다음 티오플라빈 T 분석체를 사용하여 피브릴의 항문 성 확인이 확인됩니다.대표적인 분석은 dPBS와 마우스 단량체가 마우스 PFFs에 비해 상대 밀가루 분단 단위에서 하부 신호를 생성한다는 것을 보여줍니다. 인간 PFF도 마찬가지로 단량제보다 더 높은 신호를 생성합니다.펠리탈 피브릴의 존재를 내재하기 위해 퇴적물 분석이 수행됩니다. 마우스와 인간 PFF 샘플 모두에서, 초검형 위반은 상수보다 펠릿에 더 많은 단백질을 가져야한다. 대조적으로, 마우스와 인간 단량체에서 단백질의 대다수는 펠릿에 거의 존재하는 상부체에 존재합니다.마우스와 인간 PFF는 알파 시뉴클레인 포함을 시드하는 데 적합한 길이의 PFF를 생성하기 위해 초음파 처리됩니다. 약 500개의 피브릴을 종합적으로 검사한 결과, 마우스 피브릴의 평균 길이는 약 44나노미터입니다. PFF의 86.6%가 60나노미터 이하를 측정합니다.그러나 인간 PFF는 평균 길이약 55.9나노미터로 PFF의 69.6%가 60나노미터 이하를 측정합니다. PFF 효능의 생체 내 검사에서 면역히스토케를 사용하여 확인된다. 실질적인 니그라에서 형성된 포함물질은 인산화된 알파 시뉴클레인을 함유하고, 아민로이드 구조를 포함하고, 티오플라빈 S를 함유하고, 단백질제 K 소화에 내성이 있다는 점에서 루이 바디와 유사한 특성을 공유한다.초음파 처리는 에어로졸화 된 사전 형성 된 피브릴에 개별 초음파 를 노출 할 수 있습니다. 따라서 적절한 안전 복장을 착용하고 노출 위험을 최소화하기 위해 후드에서 초음파 처리를 수행해야합니다.

generation-alpha-synuclein-preformed-fibrils-from-monomers-use

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 신경 염증을 유도하기 위해 알파-시누클레인 피브릴을 마우스에 주입하는 방법을 보여줍니다. 원섬유는 돌연변이된 알파-시누클레인 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에 복강내로 주입됩니다. 중추신경계에 도달하면, 원섬유는 뉴런으로 들어가 돌연변이된 단백질의 응집을 유도합니다. 응집체는 인접한 뉴런, 미세아교세포 및 성상세포로 퍼집니다. 응집체의 인식은 미세아교세포를 유발하여 신경 염증을 유발하여 뉴런을 손상시킵니다.

알파 Synuclein 섬유의 주입을 통해 쥐에 있는 neuroinflammation의 감응작용

이 비디오는 알파-시누클레인 미리 형성된 섬유로 전처리된 배아 마우스 도파민 뉴런에서 알파-시누클레인 축적을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 면역 형광을 사용하여 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 도파민 뉴런을 고정, 염색 및 정량화하는 단계를 설명합니다.

Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons에서 알파-시누클레인 축적 연구

단백질은 네이티브 구조를 채택하거나 불용성 아밀로이드로 잘못 접힐 수 있습니다. 잘못 접히는 경로를 선호하는 조건은 다양한 유형의 아밀로이드 섬유의 형성으로 이어집니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 in vitro에서 네이티브 단백질을 아밀로이드로 빠르게 전환할 수 있습니다.

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성<em&gt; 체외</em

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

본 프로토콜은 α-synuclein 응집체의 비강 내 투여 방법을 설명합니다. 이 방법은 파킨슨병에서 후각 점막에서 후각구까지 α-synuclein 전파에 대한 통찰력을 제공합니다.

α-Synuclein 응집체의 비강 내 투여 기법

학습하세요 알파-시뉴클레인 모노머로부터 미리 형성된 섬유소를 생성하고 품질 관리를 수행하는 방법을. 이 프로토콜은 파킨슨병 모델에서 생체 내 병리 형성을 위한 표준화된 기술을 제공합니다.

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

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