Name: 포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 CRISPR-Cas9 기반 풀링 유전 스크린을 수행하는 방법을. sgRNA 라이브러리를 활용하여 전체 유전체의 유전자 기능을 체계적으로 분석하고, 필수 유전자와 유전적 상호작용을 효율적으로 식별할 수 있습니다.

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이 일은 게놈 캐나다, 온타리오 연구 기금 및 건강 연구를 위한 캐나다 학회 (MOP-142375, PJT-148802)에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li>
<li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+CRISPR%2FCas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li>
<li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li>
<li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+execution%2C+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR%2FCas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knock-out+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li>
<li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li>
<li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STBL2%3A+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li>
<li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAGEL%3A+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).</li>
<li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.1101/232736">https://doi.org/10.1101/232736</a> (2017).</li>
<li>Pedregosa, F. V., G,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scikit-learn%3A+Machine+Learning+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li>
<li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213(2011).</li>
<li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Am+I+ready+for+CRISPR%3F+A+user%27s+guide+to+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li>
<li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR%2FCas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knock-out+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554(2014).</li>
<li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li>
<li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li>
<li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators%3A+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

사용의 단순성과 높은 유연성으로 인해 CRISPR 기술은 정밀한 게놈 편집을 위한 도구로 널리 채택되었습니다. 풀린 CRISPR 스크리닝은 단일 실험에서 수천 개의 유전적 교란을 심문하는 방법을 제공합니다. 풀린 스크린에서, sgRNA 라이브러리는 각 순서가 고유하고 표적으로 한 유전자에 매핑되기 때문에 분자 바코드로 봉사합니다. 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 분리함으로써, 관심표현형을 일으키는 유전자는 차세대 염기서열 분석에 의해 sgRNA 풍부를 정량화함으로써 결정될 수 있다. 대규모 병렬 시퀀싱 방법은 샘플에서 sgRNAs를 정량화하는 데 사용되며, 이는 여러 개의 독립적인 셀 채우기를 동일한 시퀀싱 레인으로 풀링하여 비용을 최소화할 수 있음을 의미합니다.
대규모 선별 프로젝트에 착수하기 전에 특성이 좋고 기술적으로 최적화된 모델을 가지고 있어야 합니다. 유전적 배경, 성장 속도 및 형질전환 효율은 스크리닝을 위해 세포주를 선택할 때 중요한 요소입니다. 예를 들어 성장률과...

CRISPR-Cas는 정기적으로 스패니싱된 짧은 팔린드로믹 반복 및 CRISPR 관련 뉴클레아제에 대한 짧은, 합성 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체에서 단일 뉴클레아제 단백질(예를 들어, Cas9)으로 구성된다. 이 리보뉴클레오 단백질 복합체는 Cas9 효소를 표적으로 하여 특정 게놈 궤적1에서이중 가닥 DNA 분리를 유도합니다. 이중 가닥 휴식은 상동성 지시 수리 (HDR) 또는, 더 일반적으로, 비 상동성 끝 접합을 통해 복구 할 수 있습니다 (NHEJ), 삽입 및 / 또는 삭제 (INDELS)를 자주 중단하는 오류 경향이 수리 메커니즘 1. CRISPR의 효율성과 단순성은 이전의 게놈 편집 기술 [즉, 아연 손가락 뉴클레아제 (ZNF) 또는 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제 (nucleion)를 훨씬 능가하는 이전에 는 달성 할 수없는 수준의 게놈 표적화를 가능하게합니다. TALENS), 둘 다 높아진 설계 복잡성, 낮은 형질 감염 효율 및 멀티플렉스 유전자 편집의 한계로 고통받고있습니다 2].
CRISPR 단일 가이드 RNA 기반 게놈 편집의 기본 연구 응용 프로그램은 과학자들이 개별 유전자의 기능과 유전자 상호 작용 네트워크의 토폴로지의 기능을 효율적이고 저렴하게 심문할 수 있게 해 주어왔습니다. 기능적 게놈 전체 스크린을 수행하는 능력은 CRISPR-Cas 시스템의 사용에 의해 크게 향상되었습니다, 특히 RNA 간섭과 같은 초기 유전 섭동 기술과 비교할 때 (RNAi) 및 유전자 트랩 돌연변이 발생. 특히, RNAi는 높은 오프 타겟 효과와 불완전한 녹다운으로 고통받고 있으며, CRISPR3,4,5에비해 감도와 특이성이 낮으며 유전자 트랩 방법은 haploid에서만 가능합니다. 기능 상실 스크린을 위한 셀, 심문될 수 있는 세포 모형의 범위를 제한하는6. 완전한 유전자 녹아웃을 생성하는 CRISPR의 능력은 낮은 소음, 최소한의 오프 타겟 효과 및 시약 전반에 걸쳐 일관된 활성으로 돌연변이 표현형을 심문하는 보다 생물학적으로 견고한 시스템을 제공합니다5. 전체 인간 게놈을 표적으로 하는 CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리는 이제 널리 사용가능하여 단일 실험3,7,8,9에서 수천 개의 유전자 녹아웃을 동시에 생성할 수 있습니다. .
우리는 고해상도 기능 유전체 학 스크린을 용이하게하기 위해 컴팩트하고 시퀀스 최적화 된 토론토 녹아웃 (TKO) 라이브러리 (Addgene를 통해 사용 가능)라는 독특한 CRISPR-Cas9 게놈 넓은 sgRNA 렌티 바이러스 라이브러리를 개발했습니다. 최신 라이브러리인 TKOv3는 경험적 데이터를 사용하여 편집 효율에 최적화된 71,090개의 가이드를 사용하여 ~18,000개의 인간 단백질 코딩 유전자를 대상으로합니다 10. 또한 TKOv3는 단일 벡터에서 Cas9 및 sgRNAs를 발현하는 단일 구성 요소 라이브러리(LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294)로 사용할 수 있으므로 안정적인 Cas9 발현 셀을 생성할 필요성을 완화하여 광범위한 범위에서 게놈 전체 녹아웃을 가능하게 합니다. 포유류 세포 유형. TKOv3는 Cas9(pLCKO2:TKOv3, Addgene ID# 125517)가 없는 벡터에서도 사용할 수 있으며 Cas911을발현하는 셀에서 활용될 수 있다.
게놈 넓은 CRISPR-Cas9 편집된 세포 인구는 다른 성장 조건에 드러낼 수 있고, 차세대 염기서열로 정량화된 sgRNAs의 풍부와 함께, 추적 가능한 유전을 가진 세포의 중퇴 또는 농축을 평가하기 위하여 판독을 제공하 교란. CRISPR 녹아웃 라이브러리는 섭동시, 세포 적당 결함, 적당한 약물 민감도(예: 민감하거나 내성 있는 유전자), 단백질 발현 조절(예: 리포터) 또는 특정에 필요한 유전자를 식별하기 위해 활용될 수 있습니다. 통로 기능 및 세포 상태12,13,14. 예를 들어, 암 세포주에서의 차동 피트니스 스크린은 종양 억제유전자 유전자3,14,15의고갈 또는 감소 또는 종양 억제유전자의 증가를 식별할 수 있다. 유사하게, 치료약물의 중간 용량을 사용하면 약물 내성 및 과민성 유전자 둘 다 를 나타낼 수있다 16,17.
여기에 제공된 유전체 스케일 CRISPR-Cas9 기능 손실 스크리닝을 위한 상세한 스크리닝 프로토콜은 라이브러리 생성으로부터 포유류 세포에서 토론토 녹아웃 라이브러리(TKOv1 또는 v3)를 사용하여, 데이터 분석에 대한 스크리닝 성능이다. 이 프로토콜은 토론토 녹아웃 라이브러리를 사용하여 스크리닝에 최적화되었지만 모든 CRISPR sgRNA 풀린 라이브러리에 적용하여 확장 가능해질 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 미크론 필터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30&deg; C 플레이트 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C 진탕 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C, 5% CO2 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE 버퍼</td><td>BioShop</td><td>TAE222.4</td><td></td></tr><tr><td>6 N 염산 용액</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알라마르 블루</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>블루라이트 트랜스일루미네이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 열 충격 절연, 분획 V. 최소 98%, 생명공학 등급</td><td>Bioshop</td><td>ALB001.250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 Eagles 변형 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>셀 배양 매체</td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>BTX</td><td>45-0134</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BTX</td><td>45-0651</td><td></td></tr><tr><td>Endura 전기 유능 셀</td><td>Lucigen</td><td>90293</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 포장 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>권장 통과 번호 < 15</td></tr><tr><td>헥사디메스린 브로마이드(폴리브렌)</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>형질도입 효율 향상을 위한 양이온 폴리머</td></tr><tr><td>헥사디메스린 브로마이드(폴리브렌)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 플레이트, 카르베니실</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>린</td><td></td><td></td><td></td>이 있는 LB 배지</tr>, <tr><td>저분자량 DNA 사다리</td>, <td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 분광 광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0544L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Reduced serum media</td></tr><tr><td>Plasmid maxi purification kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G (envelope plasmid)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td>렌티바이러스 시스템</td></tr><tr><td>psPAX2 (패키징 플라스미드)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td>렌티바이러스 시스템</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Wisent</td><td>400-160-UG</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C 회수 매체</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>SYRB Safe DNA gel stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #90203</td><td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #125517</td><td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wizard genomic DNA purification kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td><td>Roche</td><td>06 365 809 001</td><td>지질 기반 형질주입 시약</td></tr></tbody></table>

포유류 세포에 있는 풀린 crispr 기지를 둔 유전 스크린

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

CRISPR-Cas 시스템을 이용한 게놈 편집은 다양한 유기체의 게놈을 정밀하게 편집하는 능력을 크게 향상시켰습니다. 포유류 세포의 맥락에서, 이 기술은 기능적 유전체학 연구를 위한 게놈 전체 유전 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타낸다. 모든 개방된 판독 프레임을 대상으로 하는 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리는 특정 표현형에 대해 선별될 수 있는 단일 세포 풀에서 수천 개의 유전 적 교란을 생성하여 유전자 기능 및 세포 프로세스에 연루되도록 허용합니다. 편견과 체계적인 방법. CRISPR-Cas 스크린은 세포 표현형을 위한 유전 청사진을 밝히기 위하여 간단하고, 능률적이고, 저렴한 방법을 연구원에게 제공합니다. 게다가, 각종 세포주및 다른 암 모형에서 수행된 스크린의 차등 분석은 특정 항암 치료에 대한 잠재적인 표적을 드러내는 종양 세포에 문맥상 필수적인 유전자를 확인할 수 있습니다. 인간 세포에서 게놈 전체 스크린을 수행하는 것은 수천만 개의 세포를 처리하는 것을 포함하고 대량의 데이터 집합의 분석을 요구하기 때문에 어려울 수 있습니다. 세포주 특성화, CRISPR 라이브러리 고려 사항, 분석 중 CRISPR 기술의 한계와 기능 이해 와 같은 이러한 화면의 세부 사항은 종종 간과됩니다. 여기에 제공된 풀드게놈 전체 CRISPR-Cas9 기반 스크린의 성공적인 성능을 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다.

게놈 스케일 CRISPR 스크리닝 워크플로우 개요
그림 1은 단일 통합 이벤트와 적절한 라이브러리 표현(일반적으로 200- 1000)을 보장하기 위해 낮은 MOI에서 CRISPR 라이브러리 렌티바이러스를 가진 표적 세포의 감염으로 시작하여 풀린 CRISPR 스크리닝 작업 흐름에 대한 개요를 보여줍니다. -접기). 감염 다음, 세포는 변환 된 세포를 선택하는 항생제 puromycin으로 치료됩니다. 선택 후, 기준선 T0 세포 펠릿은 스크리닝 시작 시 라이브러리 분포를 평가하기 위해 수집된다. 유전 섭동의 이기종 인구로 구성된 나머지 세포는 유전자 편집및 결과 효력이 명시하는 것을 허용하기 위하여 15-20 배동안 매 3-4 일마다 원하는 도서관 표현에서 통과됩니다. 약물 치료를 가...

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPR 스크린 드롭아웃 스크린은 연구원에게 게놈 전체 수준에서 체인 기능을 심문하는 간단하고 효율적이며 저렴한 방법을 제공합니다. CRISPR의 장점은 가이드 서열을 단순히 변경하여 모든 유전자를 편집하는 그것의 책임입니다. CRISPR 가이드 라이브러리는 연구원이 편견없는 체계적인 방법으로 한 실험에서 모든 유기체의 전체 게놈을 심문할 수 있게 합니다.현재 CRISPR 스크린은 수백 개의 인간 암에 걸쳐 필수 유전자를 식별하고 유전 적 상호 작용을 매핑하는 데 사용되고 있습니다. 스크린은 또한 포괄적으로 행동의 약 기계장치를 밝히기 위하여 약을 프로파일수 있습니다. 여기에 설명된 CRISPR 라이브러리는 인간 세포를 대상으로 합니다.그러나 마우스와 같은 다른 종을 대상으로 하는 안내 라이브러리를 사용할 수 있으며 유사하게 스크리팅할 수 있습니다. 인간 세포에 있는 게놈 전체 스크린을 수행하는 것은 실제로, 세포에 있는 수천만의 처리를 관련시키고 데이터의 큰 세트의 분석을 요구하기 때문에, 실제로 어려울 수 있습니다. 화면을 시작하기 전에 세포주를 신중하게 특성화해야 합니다.여기에는 세포주 순도, 두 배의 시간, 렌즈티바이러스 트랜스듀션 효율성 및 항생제 선택 에이전트에 대한 민감성을 아는 것이 포함됩니다. 시각적 데모는 화면에 필요한 수백만 개의 셀을 실질적으로 처리하고 체계적인 방식으로 수천 개의 혼란을 추적하는 방법에 대한 그림을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 안드레아 합시드, 카말딥 아울라크, 그리고 라이언 클리미, 내 실험실에서 모든 기술자가 될 것입니다.기성용 CRISPR sgRNA 플라스미드를 전기능력 세포로 변환하고 원고 의 지시에 따라 성장시키는 것으로 시작합니다. 식민지를 수확 할 준비가되면, 각 접시에 카베니실린과 LB의 일곱 밀리리터를 추가하고 세포 스프레더와 함께 식민지를 긁어. 10밀리리터 파이펫을 사용하여 긁힌 세포를 멸균 원리터 원리터 원컬 플라스크로 옮기고, 카베니실린으로 LB의 5밀리리터로 플레이트를 헹구세요.다시, 플라스크에 헹구는 솔루션을 전송. 원고 방향에 따라 세포를 원심 분리한 다음 젖은 펠릿의 무게를 결정합니다. 맥시 또는 메가 스케일 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화합니다.293 T 세포를 파종하고 하룻밤 동안 배양하여 형질 전환세포를 준비합니다. 다음 날, 15센티미터 플레이트에 대한 세 개의 형질 플라스미드 혼합물을 준비합니다. 하나의 형질에 필요한 플라스미드의 양을 계산하고 플레이트 의 수에 대한 플라스미드의 혼합을 확인, 플러스 하나, 감염될 수 있습니다.다음으로, 각 트랜스페션 및 알리쿼트 감소 혈청 매체에 대한 지질 기반 형질 전환 시약을 개별 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 준비하여 전염되는 플레이트 수에 대해. 트랜스페트 시약을 추가하고 부드럽게 섞고 실온에서 5분간 배양합니다. 잠복 후, DNA 복합체의 마이크로그램에 3 대 1 비율로 트랜스페션 시약에 DNA를 추가합니다.용액을 부드럽게 섞고 실온에서 30분 간 그대로 둡니다. 패키징 셀에 트랜스페션 혼합물을 추가하고 원고 지침에 따라 배양합니다. 바이러스 수확 당일, 세포가 좋은 바이러스 생산의 표시로 비정상적이고 융합된 형태를 확인하고, 상류체를 수집하고 멸균 원심분리기로 이송하여 렌티바이러스를 수확한다.화면 전체에서 유지될 CRISPR 가이드 RNA 라이브러리 커버리지를 선택하여 시작합니다. 라이브러리 커버리지에 기초하여, 가이드 RNA당 이를 유지하는 데 필요한 세포의 수와 MOI 0.3에서 감염에 필요한 세포의 수를 결정한다. 다음으로, 감염을 설정하는 데 필요한 플레이트 수를 결정한 다음, 각 플레이트에 세포를 수확하고 종자한다.모든 플레이트에 헥사디메린 브로마이드를 추가하고 두 개의 플레이트를 선별하고 제어하기 위해 필요한 양의 바이러스를 추가합니다. 하나를 제어하기 위해 바이러스를 추가하지 마십시오. 해당 볼륨을 미디어로 바꿉다.기울어서 플레이트를 완전히 섞고 접시를 인큐베이터에 넣고 레벨이 있는지 확인합니다. 원고 방향에 따라 감염된 세포를 수확하고 게놈 DNA 추출을 위해 풀이 된 세포에서 세포 펠릿의 세 복제를 수집합니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리하고 PBS로 씻어.튜브에 라벨을 부착하고 셀 펠릿을 영하 80도에서 동결하십시오. 감염된 세포의 풀을 세 개의 복제 그룹으로 분할하여 각 복제 내에서 라이브러리 커버리지를 유지합니다. 세포를 확장할 때 일반적으로 사용되는 밀도로 셀을 시드합니다.각 복제에 대해 동일한 수의 셀과 복제 사이에 동일한 총 셀 수를 사용합니다. 세포를 통과하고 최대 15~20개의 세포 두 배에 대해 풀링된 감염된 세포의 각 복제에서 세포 펠릿의 3개의 복제를 수확합니다. 각 구절에서, 서로 복제 각 플레이트에서 세포를 수확.각 펠릿에 시간 라벨을 지정하고 지정을 복제합니다. 50 마이크로리터 반응당 총 100마이크로그램의 게놈 DNA를 가진 원고 지시에 따라 PCR1을 설정하고 원하는 커버리지를 달성하기 위해 동일한 50 마이크로리터 반응을 설정합니다. 원고 방향에 따라 하나의 PCR 튜브 반응을 설정합니다.풀링된 PCR1 제품의 5개의 마이크로리터를 템플릿으로 사용하고 각 개별 샘플에 고유 인덱스 프라이머 조합을 사용하여 시퀀싱 라이브러리 샘플을 풀링할 수 있습니다. PCR을 완료한 후 PCR 튜브 제품을 1~1 1/2시간 동안 저전압으로 2%의 아가로즈 젤로 실행합니다. 파란색 광 막다른 트랜스유미나이터에 제품을 시각화하고 200베이스 쌍 밴드를 소비합니다.DNA를 정화하고 분광계와 불소계로 그 양과 품질을 측정합니다. 이상적인 가이드 RNA 라이브러리는 유사한 양으로 표현된 모든 단일 가이드 RNA가 있어야 합니다. 차세대 시퀀싱을 사용하여 라이브러리에 가이드 RNA가 단단히 분포되어 있음을 확인할 수 있습니다.정밀 리콜 분석을 사용하여 화면 성능을 평가할 수 있습니다. 고성능 스크린은 6개 이상의 기저인자에서 많은 필수 유전자를 회수해야 하며 5% 미만의 거짓 발견률정밀 회수 곡선은 날카로운 팔꿈치와 단말 지점까지 직선이 있어야 한다. 베이즈 인자는 유전자 녹아웃이 피트니스 결함을 초래한다는 자신감 측정을 나타냅니다.높은 점수는 증가 된 자신감을 나타내며, 낮은 점수는 유전자 녹아웃이 성장 우위를 제공한다는 것을 시사합니다. 게놈 전체 녹아웃 풀은 억제제 저항 유전자를 찾기 위해 과잉 약물 에이전트의 존재에서 배양 될 수있다. 티미딘 블록 의 억제제에 대한 긍정적 인 선택 화면을 수행하려면 T0의 모든 가이드 RNA에 대한 정규화된 읽기 수가 티미딘 처리 샘플의 평균 정규화 된 읽기 수에 대해 플롯됩니다.CRISPR 스크린을 성공적으로 수행하기 위한 주요 세부 사항은 플라스미드의 트랜스퍼팅에서 세포의 트랜스퍼션에 이르기까지 각 가이드 RNA의 양호한 분포를 유지하는 것입니다. 이것은 RNA 표현을 왜곡하고 거짓 긍정 또는 부정적인 결과로 이끌어 낼 수 있는 무작위 효력의 기회를 최소화할 것입니다. 화면 유효성 검사 후 주 화면이 잠재적인 조회만 식별하기 때문에 조회를 확인하기 위해 실험을 수행해야 합니다.안타의 생물학에 따라 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. CRISPR 편집은 차세대 시퀀싱과 결합되어 다양한 인간 모델 시스템에서 기능 스크린의 게놈 스케일 손실을 가능하게 했습니다. CRISPR의 단순성 으로 인해 이러한 유형의 스크린은 이제 모든 연구자가 광범위하게 접근 할 수 있으므로 더 많은 과학자들이 생물학적 과정과 질병을 연구하기 위해 기능적 유전 적 방법을 활용할 수 있습니다.

pooled-crispr-based-genetic-screens-in-mammalian-cells

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기 우리는 세포 생존을 촉진 유전자 표적을 식별하는 방법을 순서 인간 LentiPlex 풀링 라이브러리 전통을 사용합니다. 우리는 설정하고 deconvolute LentiPlex 화면을하고 결과를 확인하는 방법을 보여줍니다.

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

우리 보고 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 반딧불 luciferase murine 셀 라인에서 x 염색체 비활성화의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위한 다음 세대 시퀀싱 기반 프로토콜 및 hygromycin 저항 유전자는 메 틸 CpG 바인딩 단백질 2 (융합 MeCP2) 비활동 성 X 염색체에 유전자입니다.

풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

여기서 우리는 면역 능력 마우스의 피부와 구강에 있는 몇몇 유전자의 기능을 동시에 평가하기 위하여 자궁 배아 렌즈바이러스 주사에서 초음파 유도를 사용하여 생체 내 CRISPR/Cas9 검열 방법론을 기술합니다.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

게놈 차원의 CRISPR/Cas9 스크리닝 방법을 적용하여 방사선의 저항성 및 민감성 유전자를 선택하기 위한 세심하고 구조화된 접근 방식이 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 임상적으로 투여되는 화학 약물에 대한 내성 메커니즘을 조사하는 다른 연구 노력을 위한 다재다능한 프레임워크 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

이 프로토콜은 마우스 유선에서 유전자 노크아웃 및 활성화 연구를 병행할 수 있는  확장 가능한 관내 CRISPR 스크리닝 접근법을 설명합니다.

마우스 유선에서 유전자 결색 및 활성화의 병행 생체 내 스크리닝

배우세요 포유류 세포에서 CRISPR-Cas9 기반 풀링 유전 스크린을 수행하는 방법을. sgRNA 라이브러리를 활용하여 전체 유전체의 유전자 기능을 체계적으로 분석하고, 필수 유전자와 유전적 상호작용을 효율적으로 식별할 수 있습니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

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