포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

CRISPR 스크린 드롭아웃 스크린은 연구원에게 게놈 전체 수준에서 체인 기능을 심문하는 간단하고 효율적이며 저렴한 방법을 제공합니다. CRISPR의 장점은 가이드 서열을 단순히 변경하여 모든 유전자를 편집하는 그것의 책임입니다. CRISPR 가이드 라이브러리는 연구원이 편견없는 체계적인 방법으로 한 실험에서 모든 유기체의 전체 게놈을 심문할 수 있게 합니다.

현재 CRISPR 스크린은 수백 개의 인간 암에 걸쳐 필수 유전자를 식별하고 유전 적 상호 작용을 매핑하는 데 사용되고 있습니다. 스크린은 또한 포괄적으로 행동의 약 기계장치를 밝히기 위하여 약을 프로파일수 있습니다. 여기에 설명된 CRISPR 라이브러리는 인간 세포를 대상으로 합니다.

그러나 마우스와 같은 다른 종을 대상으로 하는 안내 라이브러리를 사용할 수 있으며 유사하게 스크리팅할 수 있습니다. 인간 세포에 있는 게놈 전체 스크린을 수행하는 것은 실제로, 세포에 있는 수천만의 처리를 관련시키고 데이터의 큰 세트의 분석을 요구하기 때문에, 실제로 어려울 수 있습니다. 화면을 시작하기 전에 세포주를 신중하게 특성화해야 합니다.

여기에는 세포주 순도, 두 배의 시간, 렌즈티바이러스 트랜스듀션 효율성 및 항생제 선택 에이전트에 대한 민감성을 아는 것이 포함됩니다. 시각적 데모는 화면에 필요한 수백만 개의 셀을 실질적으로 처리하고 체계적인 방식으로 수천 개의 혼란을 추적하는 방법에 대한 그림을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 안드레아 합시드, 카말딥 아울라크, 그리고 라이언 클리미, 내 실험실에서 모든 기술자가 될 것입니다.

기성용 CRISPR sgRNA 플라스미드를 전기능력 세포로 변환하고 원고 의 지시에 따라 성장시키는 것으로 시작합니다. 식민지를 수확 할 준비가되면, 각 접시에 카베니실린과 LB의 일곱 밀리리터를 추가하고 세포 스프레더와 함께 식민지를 긁어. 10밀리리터 파이펫을 사용하여 긁힌 세포를 멸균 원리터 원리터 원컬 플라스크로 옮기고, 카베니실린으로 LB의 5밀리리터로 플레이트를 헹구세요.

다시, 플라스크에 헹구는 솔루션을 전송. 원고 방향에 따라 세포를 원심 분리한 다음 젖은 펠릿의 무게를 결정합니다. 맥시 또는 메가 스케일 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화합니다.

293 T 세포를 파종하고 하룻밤 동안 배양하여 형질 전환세포를 준비합니다. 다음 날, 15센티미터 플레이트에 대한 세 개의 형질 플라스미드 혼합물을 준비합니다. 하나의 형질에 필요한 플라스미드의 양을 계산하고 플레이트 의 수에 대한 플라스미드의 혼합을 확인, 플러스 하나, 감염될 수 있습니다.

다음으로, 각 트랜스페션 및 알리쿼트 감소 혈청 매체에 대한 지질 기반 형질 전환 시약을 개별 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 준비하여 전염되는 플레이트 수에 대해. 트랜스페트 시약을 추가하고 부드럽게 섞고 실온에서 5분간 배양합니다. 잠복 후, DNA 복합체의 마이크로그램에 3 대 1 비율로 트랜스페션 시약에 DNA를 추가합니다.

용액을 부드럽게 섞고 실온에서 30분 간 그대로 둡니다. 패키징 셀에 트랜스페션 혼합물을 추가하고 원고 지침에 따라 배양합니다. 바이러스 수확 당일, 세포가 좋은 바이러스 생산의 표시로 비정상적이고 융합된 형태를 확인하고, 상류체를 수집하고 멸균 원심분리기로 이송하여 렌티바이러스를 수확한다.

화면 전체에서 유지될 CRISPR 가이드 RNA 라이브러리 커버리지를 선택하여 시작합니다. 라이브러리 커버리지에 기초하여, 가이드 RNA당 이를 유지하는 데 필요한 세포의 수와 MOI 0.3에서 감염에 필요한 세포의 수를 결정한다. 다음으로, 감염을 설정하는 데 필요한 플레이트 수를 결정한 다음, 각 플레이트에 세포를 수확하고 종자한다.

모든 플레이트에 헥사디메린 브로마이드를 추가하고 두 개의 플레이트를 선별하고 제어하기 위해 필요한 양의 바이러스를 추가합니다. 하나를 제어하기 위해 바이러스를 추가하지 마십시오. 해당 볼륨을 미디어로 바꿉다.

기울어서 플레이트를 완전히 섞고 접시를 인큐베이터에 넣고 레벨이 있는지 확인합니다. 원고 방향에 따라 감염된 세포를 수확하고 게놈 DNA 추출을 위해 풀이 된 세포에서 세포 펠릿의 세 복제를 수집합니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리하고 PBS로 씻어.

튜브에 라벨을 부착하고 셀 펠릿을 영하 80도에서 동결하십시오. 감염된 세포의 풀을 세 개의 복제 그룹으로 분할하여 각 복제 내에서 라이브러리 커버리지를 유지합니다. 세포를 확장할 때 일반적으로 사용되는 밀도로 셀을 시드합니다.

각 복제에 대해 동일한 수의 셀과 복제 사이에 동일한 총 셀 수를 사용합니다. 세포를 통과하고 최대 15~20개의 세포 두 배에 대해 풀링된 감염된 세포의 각 복제에서 세포 펠릿의 3개의 복제를 수확합니다. 각 구절에서, 서로 복제 각 플레이트에서 세포를 수확.

각 펠릿에 시간 라벨을 지정하고 지정을 복제합니다. 50 마이크로리터 반응당 총 100마이크로그램의 게놈 DNA를 가진 원고 지시에 따라 PCR1을 설정하고 원하는 커버리지를 달성하기 위해 동일한 50 마이크로리터 반응을 설정합니다. 원고 방향에 따라 하나의 PCR 튜브 반응을 설정합니다.

풀링된 PCR1 제품의 5개의 마이크로리터를 템플릿으로 사용하고 각 개별 샘플에 고유 인덱스 프라이머 조합을 사용하여 시퀀싱 라이브러리 샘플을 풀링할 수 있습니다. PCR을 완료한 후 PCR 튜브 제품을 1~1 1/2시간 동안 저전압으로 2%의 아가로즈 젤로 실행합니다. 파란색 광 막다른 트랜스유미나이터에 제품을 시각화하고 200베이스 쌍 밴드를 소비합니다.

DNA를 정화하고 분광계와 불소계로 그 양과 품질을 측정합니다. 이상적인 가이드 RNA 라이브러리는 유사한 양으로 표현된 모든 단일 가이드 RNA가 있어야 합니다. 차세대 시퀀싱을 사용하여 라이브러리에 가이드 RNA가 단단히 분포되어 있음을 확인할 수 있습니다.

정밀 리콜 분석을 사용하여 화면 성능을 평가할 수 있습니다. 고성능 스크린은 6개 이상의 기저인자에서 많은 필수 유전자를 회수해야 하며 5% 미만의 거짓 발견률정밀 회수 곡선은 날카로운 팔꿈치와 단말 지점까지 직선이 있어야 한다. 베이즈 인자는 유전자 녹아웃이 피트니스 결함을 초래한다는 자신감 측정을 나타냅니다.

높은 점수는 증가 된 자신감을 나타내며, 낮은 점수는 유전자 녹아웃이 성장 우위를 제공한다는 것을 시사합니다. 게놈 전체 녹아웃 풀은 억제제 저항 유전자를 찾기 위해 과잉 약물 에이전트의 존재에서 배양 될 수있다. 티미딘 블록 의 억제제에 대한 긍정적 인 선택 화면을 수행하려면 T0의 모든 가이드 RNA에 대한 정규화된 읽기 수가 티미딘 처리 샘플의 평균 정규화 된 읽기 수에 대해 플롯됩니다.

CRISPR 스크린을 성공적으로 수행하기 위한 주요 세부 사항은 플라스미드의 트랜스퍼팅에서 세포의 트랜스퍼션에 이르기까지 각 가이드 RNA의 양호한 분포를 유지하는 것입니다. 이것은 RNA 표현을 왜곡하고 거짓 긍정 또는 부정적인 결과로 이끌어 낼 수 있는 무작위 효력의 기회를 최소화할 것입니다. 화면 유효성 검사 후 주 화면이 잠재적인 조회만 식별하기 때문에 조회를 확인하기 위해 실험을 수행해야 합니다.

안타의 생물학에 따라 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. CRISPR 편집은 차세대 시퀀싱과 결합되어 다양한 인간 모델 시스템에서 기능 스크린의 게놈 스케일 손실을 가능하게 했습니다. CRISPR의 단순성 으로 인해 이러한 유형의 스크린은 이제 모든 연구자가 광범위하게 접근 할 수 있으므로 더 많은 과학자들이 생물학적 과정과 질병을 연구하기 위해 기능적 유전 적 방법을 활용할 수 있습니다.